【doc】L-谷氨酰胺、BSA对家兔卵母细胞体外受精及受精卵体外发育的影响

【doc】L-谷氨酰胺、BSA对家兔卵母细胞体外受精及受精卵体外发育的影响 L-谷氨酰胺、BSA对家兔卵母细胞体外受精 及受精卵体外发育的影响 《黑龙江畜牧兽医))2009年第1期109 2.2不同浓度的DMSO对精子活率的影响(见表2) 表2不同浓度的DMSO对精子活率的影响个 注:同列数据肩标表示差异显着(P<O.05),术车表示差异极显着 (P<0.01). 3讨论 3.IDMSO对精子AR的影响 DMSO可以很好地溶解孕酮,肝素等培养液添加 物,增加它们的渗透性,促进精子的获能,这决定了其 在培养液中的浓度不可过低;此外,DMSO对精子具 有一定的毒性又决定了其在培养液中的浓度不能过 高.由表1可以看出:短时间内虽然精子的顶体反应 率比较高,但是在120分钟时顶体反应率随DMSO浓 度升高而降低,说明DMSO的浓度过高对精子的毒 性也较高,不利于精子的AR;在120分钟时,顶体反 应率C组>b组>a组,说明DMSO的浓度过低也不 能充分发挥其作用,也是不利于精子AR的. 3.2DMSO对精子活率的影响 DMSO可以渗透到细胞内,在细胞内外产生一定 的摩尔浓度,使细胞内水分不会过分外渗,避免细胞 过分脱水皱缩.DMSO还是羟自由基的清除剂,而羟 自由基是一个极其活泼的氧化剂,可由超氧阴离子和 过氧化氢经Haber—weiss或Fenton反应生成,对细 胞损害严重.由表2可知,DMSO浓度在0.2%时精 子活率达到最高,超过0.2%时精子的活率逐渐下 降.这是DMSO能渗透到精子里维持精子内外的渗 透压和高浓度的DMSO对精子有很大毒性作用的结 果.高浓度的DMSO对精子有明显抑制作用,能导 致精子全部死亡.(011) L一谷氨酰胺,BSA对家兔卵母细胞 体外受精及受精卵体外发育的影响 周俊波,唐修君,丁志丽,曹访,王杏龙 (1.湖州师范学院,浙江湖州313000;2.扬州大学动物科学与技术学院,江苏扬州 225009) 中图分类号:$859.5文献标识码:B文章编号:1004—7034(2009)O1—0109—02 目前,体外受精技术在治疗人类不孕症以及提高 动物繁殖率和优秀母畜繁殖力等方面已成为一种有 效手段.笔者以家兔为试验动物,探讨L一谷氨酰 胺,牛血清白蛋白(BSA)对家兔卵母细胞体外受精及 受精卵体外发育的影响,旨在更好地了解整个受精过 程的生理机制,为畜牧业生产提供更多的胚胎来源与 相关技术. 1材料与方法 1.1动物 健康家兔28只,其中公兔5只,母兔23只,体重 2,3.5,年龄0.5,1岁,购自扬州运河种兔场. 家兔均为笼养,每天饲喂颗粒饲料[饲料组成:豆粕 15%,玉米20%,草粉(花生藤粉)36%,麸皮25%,石 粉1%,食盐0.5%,磷酸氢钙2%,酵母0.5%]2次, 共约200g,定期补充适量青绿饲料,自由饮水. 收稿日期:2008一l0—18 作者简介:周俊波(1979一),男,助理实验师,硕士研究生 1.2激素 注射用垂体促卵泡素(FSH,批号050630)和注 射用人绒毛膜促性腺激素(hCG,批号20050905),均 购自宁波第二激素厂. 1.3培养液 1.3.1基础培养液TCM一199液,先用5%NaHCO 调pH值至7.2,7.4,再用直径为0.22tun的滤膜过滤 灭菌. 1.3.2受精卵培养液受精卵培养液I:TCM一199+ 10%FBS;受精卵培养液I1:TCM一199+10%FBS+ 0.5mmol/LL一谷氨酰胺;受精卵培养液111:TCM一 199+10%FBS+1mmol/LL一谷氨酰胺;受精卵培 养液IV:TCM一199+10%FBS+2mmol/LL一谷氨 酰胺;受精卵培养液V:TCM一199+1mg/mLBSA; 受精卵培养液VI:TCM一199+2mg/mLBSA;受精卵 培养液VII:TCM一199+5mg/mLBSA. 1.3.3冲卵液冲卵液为含3rag/mEBSA的改良 杜氏磷酸缓冲液(mPBS). 11O HeilongjiangAnimalScience andVeterinaryMedicineNo12009 1.3.4获能液DM液:按照Brackett的配制方法配 制,先用5%NaHCO调pH值至7.6,7.8,然后再用直 径为0.22m的滤膜过滤灭菌,使用前加3ms/mL BSA,并在38.2qC,5%CO培养箱中平衡0.5h. DM一肝素液:取5mLDM液,加入500g肝素钠即 成.His液:取10mLDM液,加入34mgNaC1即成,使 用前在38.2oC,5%CO培养箱中平衡0.5h. 1.4精子的体外获能 采用DM—His法获能.用人工采精的方法获取家 兔精液,将200活力在0.8以上的精液置于1.5mL离 心管中,慢慢加入800DM一肝素液,以1500r/rain离 心5min,弃掉上清液;再加入1mLHis液使精子沉淀物 悬浮,封口后置于38?水浴锅中孵育15min;再以 I500r/rain离心5min,弃掉上清液;最后用ImLDM一 肝素液再次悬浮精子,并以1000r/min离心5min;吸取 800上清液,剩下的200txLDM精子悬浮液在38? 水浴锅中轻轻摇晃3min后封口;以45.角倾斜放在 38.2?,5%CO培养箱中培养4h,将活力在0.4以上, 密度为7×10个/mL的精液用于体外受精. 1.5超数排卵和卵子的收集 按参考文献[1]中的FSH—hCG法对母兔进行 超排处理.注射hCG14,15h后手术取出卵巢和输 卵管,每侧输卵管用5,6mLmPBS由输卵管伞端向 子宫端冲洗;用平皿收集卵母细胞,回收的卵子用 TCM一199液清洗3次,备用. 1.6体外受精 在直径为3cm的塑料培养皿上,用微量移液管 制备培养小液滴(50I/滴)4,5滴;用灭菌石腊油 覆盖,加盖,置于38.2oC,5%CO培养箱中平衡 1,2h;将正常卵子放到小液滴里,每滴内放l0个卵 子;然后加入7.5体外获能精子,加盖后置于 38.2?,5%CO:培养箱中培养. 1.7受精卵的体外培养 受精培养6h后检出卵子,用TCM一199液清洗 3次后移到新制的培养小液滴中;加盖,置于 38.2?,5%CO培养箱中培养;每隔12h在体视显 微镜下观察并统计卵子卵裂情况及受精卵发育情况; 体外培养96h后统计各发育阶段胚胎发育率,以出现 正常卵裂或卵黄周隙出现2个极体为受精标准. 1.8统计分析 采用t检验对试验数据进行统计分析. 2结果 2.1L一谷氨酰胺对卵母细胞体外受精及受精卵体 外发育的影响(见表1) 由表1可知:在受精卵培养液?中,8,16细胞 百分率,桑椹胚百分率及卵裂率均显着高于受精卵培 养液I和?(P<0.05);而4,8细胞百分率显着低 于受精卵培养液I(P<0.05). 表1L-谷氨酰睃对卵母绷抱体外及受精卵饵.纠峻育的影响枚 注:括号中数为百分率;同列数据肩标字母不同表示差异显着 (P<0.05). 2.2BSA对卵母细胞体外受精及受精卵体外发育的 影响(见表2) 表2BSA对卵母细胞体外受精及受精卵体外发育的影响枚 注:括号中数为百分率;同行数据肩标字母不同表示差异显着 (P<0.05). 由表2可知,卵母细胞在受精卵培养液V,?,? 中进行体外受精时均未发生卵裂现象,由此可见BSA 不能代替血清. 3讨论 3.1L一谷氨酰胺对卵母细胞体外受精及受精卵体 外发育的影响 目前,L一谷氨酰胺在小鼠和牛早期胚胎体外培养 中应用较多,而在兔卵母细胞体外受精中的应用尚未 见相关报道.试验在培养液TCM一199+10%FBS中 添加0.5mmoL/L的L一谷氨酰胺,试验效果显着高于 不添加组,但随着L一谷氨酰胺添加量的增加效果降 低.效果显着可能是由于L一谷氨酰胺在胚胎早期发 育中具有提供代谢中氨基氮来源的作用;也可能是在 代谢中较其他氨基酸更具有运输方面的竞争性.而添 加量的增加抑制体外受精效果可能是其中某种物质在 该过程中起着阻碍作用.有关L一谷氨酰胺在胚胎发 育中的具体作用机制还有待于进一步探索. 3.2BSA对卵母细胞体外受精及受精卵体外发育的 影响 BSA是培养液中常用的一种蛋白源物质,能结合 培养液中一些胚胎毒性物质,对胚胎有保护作用,在血 清存在情况下BSA能促进胚胎发育,增加胚胎中细胞 数量.试验用BSA替代血清,没有发现卵裂现象,说 明单独使用BSA并不能完全取代血清,血清中一些能 促进卵泡分化和生长的因子可能是BSA中不具有的. 但也有试验证明无血清培养可以代替有血清培养.目 前无血清培养体系还不完善,需进一步完善. 参考文献: [1]刘亚,张运海,章美玲,等.兔超数排卵的比较试验[J].黑龙江 畜牧兽医,2003(4):35—36.(O11)