蓝氏贾第鞭毛虫的基因及基因型

蓝氏贾第鞭毛虫的基因及基因型 ? 58?热带病与寄生虫学2007年第5卷第1期 JournalofTropicalDiseasesandParasitology2007.ol5.No1 蓝氏贾第鞭毛虫的基因及基因型 杨志宏田喜凤卫茹 蓝氏贾第鞭毛虫fGiardialamblia)是一种多 鞭毛的单细胞真核生物,其滋养体寄生在人体的 小肠,引起以腹泻为主的贾第虫病(giardiasis).本病 世界范围的感染率约为30%,我国感染率各地区 不等,约在1%,20%左右(平均约2.54%).目前,贾 第虫病已被列为全世界危害人类健康的十种主要 寄生虫病之一[1】.贾第虫在生物进化上处于特殊地 位(属"源真核生物").随着分子生物学研究技术 的发展,国内外学者对本虫的基因及基因型研究 不断深人,本文就近年来这方面的研究综述如下. 一 ,蓝氏贾第鞭毛虫的基因 (一)酶基因 1.V—ATP酶A亚单位基因(vn1a一1gene) 关于蓝氏贾第鞭毛虫中编码空泡样ATP酶A 亚单位的基因序列已有报道.Hilario等(1995)[2】报 道此基因编码的蛋白质与真核生物和原细菌的 ATP酶同源亚单位的完整序列具有高度相似性. 区别仅在于贾第虫亚单位具有独特的三个区域, 最大的区域包含真核生物特有的剪接体内含子. 2.醛缩酶基因(aldolasegene) Henze等(1998)例克隆了蓝氏贾第鞭毛虫的 Glfba基因并进行序列分析结果表明,该基因编码 一 个324个残基长的第?类果糖1,6一二磷酸醛缩 酶.应用最大似然法和最大简约法进行种系发生 分析,显示该序列与卡尔文循环中的醛缩酶关系 非常密切.结合已知的I类和?类醛缩酶在分类 学和功能学的作用,在进化史上蓝氏贾第鞭毛虫 的醛缩酶与目前所知的所有真核生物的果糖1,6一 二磷酸醛缩酶之间具有显着差异. 3.乙酰辅酶A合成酶(ADP-forming)基因 (acetyl—CoAsynthetaseADP—forminggene) Sanchez等(1999)[4】克隆了蓝氏贾第鞭毛虫的 Glacs基因并进行序列测定分析,将其表达于大肠 杆菌.研究结果表明,此基因编码726个残基长的 乙酰辅酶A合成酶.该酶参与合成贾第虫代谢的 作者单位:063000河北唐山市,华北煤炭医学院生物 科学系病原生物学学科,*2004级研究生 ? 综述? 终产物一乙酰盐.目前,仅知此酶存在于两种无线 粒体的真核生物(蓝氏贾第鞭毛虫和溶组织内阿 米巴)和原细菌火球菌属的菌种中,且仅在少数原 细菌和真菌的全基因组中检测出同源染色体的未 确定的开放阅读框(ORF). 4.磷酸丙糖异构酶基因(triosephosphateiso— merase/timgene) 蓝氏贾第鞭毛虫的磷酸丙糖异构酶基因(tim 基因)编码磷酸丙糖异构酶.Baruch等(1996)f5】根 据对tim基因的序列分析,将来自北美不同宿主的 贾第虫株分为3种基因型,即1型(WB),2型 (JH)和3型(GS).根据tim基因的序列可以确定 虫株之间的遗传学关系. 卢思奇(1999)n对分离自我国的4株贾第虫的tim 基因序列进行了测定并与国外的做了比较.结果显示, 来自北京(c1)和四川(c2)的2株属于3型(GS);来自 河北的2株(CH2和CH3)同属于2型(jn). 陈小宁等(2001)7】随机选取河北承德地区居 民216人,其中小学生180人,农民36人,进行蓝 氏贾第鞭毛虫包囊大小与基因型关系的研究.将 从中分离的3株贾第虫包囊(命名为CH2,CH3, CH4).用PCR扩增tim基因和序列测定.将结果 与GenBank登录的标准虫株WBJH和Gs比较. 结果显示,此CH2,CH3和CH4均属第2型.研究 结果表明,河北承德地区感染者粪便内包囊虽有 大小之分.但它们的基因型却完全相同,说明虫株 的遗传学特征并未受地域因素的影响. Lu等(2002)阎为了确定来源于中国和其它国 家不同地理位置蓝氏贾第鞭毛虫分离株之间的遗 传学关系.对来自我国,柬埔寨,澳大利亚和美国 的9株蓝氏贾第鞭毛虫进行tim基因PCP,.扩增及 序列测定分析,并与基因库中的序列比较.结果显 示,来自柬埔寨的CAM和澳大利亚的A1和A2 属于第1型(WB);中国株CH2和CH3属于第2 型(JH):另外2株中国虫株c1和c2与美国的BP 和CDC属于第3型(GS).此外为了探讨蓝氏贾第 鞭毛虫tim基因的种内差异性,Lu等(2OO2)例对分 别来自中国,柬埔寨,美国,加拿大,人,海狸,豚鼠 热带病与寄生虫学2007年第5卷第1期 JournalofTropicalDiseasesandParasitology2007.V0l5.N?59? 和绵羊等宿主的16株贾第虫tim基因部分序列采 用简约法和邻结(N-j)法构建系统树进行系统发 育分析.结果显示,两种方法所得树的分枝结构相 似,均将受试的16株贾第虫株分为明显的两种基 因型,即1型()和3型(GS). 上述研究表明,宿主和地理因素对蓝氏贾第鞭毛 虫的遗传特性几无影响,而自然选择对tim基因分子 进化水平起到重要作用.提示tim基因可作为研究蓝 氏贾第鞭毛虫群体遗传结构有用的遗传标志. 5.谷氨酸脱氢酶基因(GDHgene) 刘全等(2002)]lq利用PCR.技术扩增蓝氏贾第鞭 毛虫GDH基因并将其插入PMD18一T载体,经酶切 鉴定后进行序列测定及分析.结果表明所克隆的 GDH基因序列与蓝氏贾第鞭毛虫Portland一1株谷氨 酸脱氢酶基因基本一致,该基因5'上游区具有典型的 cAAT/TATA盒,含有GDH启动子序列.此研究为 贾第虫病毒的反向遗传学操作奠定了基础. Abe等(2003)【"】以GDHF3和GDHB5为一 对引物,以GDH基因为靶基因,采用PCR扩增 GDH基因片断并对其扩增产物进行序列分析,鉴 定4株犬贾第虫分离株的基因型.结果表明,犬分 离株的序列片段是一致的,种间有15bp或lbp的 差异,分别为犬特异基因型集聚型c或集聚型D. 同时采用种系发育分析的方法来验证所扩增 DNA的一致性.结果显示,用邻结法分析所有犬 分离株的序列均与集聚型D种系群聚.因此,所有 犬分离株均为集聚型D.由此提示.以GDHF3和 GDHB5为分子标记有助于区别动物传染病基因 型和犬特异性基因型. CediUo—Rivera等(2003)旧采用PCR扩增 GDH基因片段和BspH1和ApaI限制性片断分析 方法判定墨西哥城26株纯贾第虫分离株所属的主 要基因型,同时结合变异性表面蛋白基因SPgene) 的扩增和分析结果确定其亚型.结果表明,尽管这些 分离株的临床背景各异,但同属于集聚型A—I型, 贾第虫集聚型A—I在墨西哥市普遍存在. 6.11型拓扑异构酶基因(type11DNAtopoi— somerasegene) He等(2005)?对蓝氏贾第鞭毛虫基因组的分 析研究,鉴定了编码?型拓扑异构酶的基因G. LTopo11.该基因为单拷贝基因,含有4476bp的开 放阅读框.无内含子.推导的氨基酸序列显示与真 核生物的Topo112基因具有高度同源性.然而也 发现了一些不同之处,例如在ATP酶区及中心域 有六个插入序列,较中心域长约100个氨基酸;较 c一末端区域约短200个氨基酸.富含带电荷残基. 通过真核生物酶的种系发生分析表明.动基体目 原生动物,植物,真菌和动物均源自单细胞的种 群.与植物谱系比较,动物和真菌谱系共有一个祖 先.然而,在系统发育树上蓝氏贾第鞭毛虫并不是 最早的分支,而是在线粒体动基体目原生动物后 分支而来的.典型的真核生物?型拓扑异构酶的 发现和种系分析结果及最近在蓝氏贾第鞭毛虫中 发现残余的线粒体细胞器等均提示蓝氏贾第虫可 能并不象以前所认定的那样原始.蓝氏贾第鞭毛 虫的Topo11基因特征的研究结果对抗贾第鞭毛 虫药物的选择性提供了帮助. (二)蛋白基因 1.一贾第素基因(alpha-giardingene) Weiland等(2005)f141测定了蓝氏贾第鞭毛虫 一 贾第素基因14个新编码区序列.这些与膜联蛋 白有关,并组成了一个有21个成员的多基因家 族.多数一贾第素是高表达蛋白质,在急性贾第 虫病患者体内具有强免疫原性,然而对于这些蛋 白质的确切作用却知之甚少.采用半定量逆转录 PCR法分析发现一贾第素在mRNA表达水平上 存在显着差异.抗原表位示踪法将一贾第素定位 在不同部位的细胞骨架成分(如鞭毛,吸盘及细胞 膜)上.提示一贾第素在细胞运动,附着和膜稳定 性上发挥重要作用. 2.B一贾第素基因(beta-giardingene) LaUe等(2005)[51收集了意大利的人源性(n=37) 和动物源性(犬,猫,小牛.n=46)蓝氏贾第鞭毛虫包 囊,采用PCR法扩增B一贾第素基因片断并进行序 列分析.结果显示.人源分离株中只鉴定出集聚A和 集聚B两种基因型;犬分离株中除6株为集聚A 外.绝大多数为集聚c和集聚D.猫分离株为猫特 异性基因集聚F.在小牛分离株中,多数为集聚A (n=12)和集聚B(n=5),而集聚E却较少见(n=3).通 过B一贾第素基因的序列异质性研究,鉴定出许多基 因亚型:集聚A(8种亚型),B(6种亚型),D(2种亚型) 和E(3种亚型).并且发现A1,A2,A3,A4和B3等5 种基因亚型与人类,犬和小牛感染有关,提示这些动 物可能作为人类感染的传染源. La1le等(2005)?还对分离自墨西哥有症状的 儿童(n=9)和宠物犬(n=5)的蓝氏贾第虫包囊,采 ? 6O?热带病与寄生虫学2007年第5卷第1期 JournalofTropicalDiseasesandparasitology2Qo7.V.NO1 用巢式PCB.法扩增B一贾第素基因.同时对体外 培养的8株人源的贾第虫分离株和2个参照株 (集聚型A和集聚型B)进行PCB.限制性片段长 度多态性分析(PCI~.-B.FLP).结果表明所有的分 离株均属于集聚型A.序列分析结果亦表明绝大 多数分离株属于A1基因型.有趣的是,有2株人 源分离株为A3基因型.此基因型以前曾在意大利 的人源分离株中发现过.宠物犬分离株的A1和 A3基因型提示其可能作为人类感染的传染源.值 得注意的是.到目前为止还没有在墨西哥的贾第 虫分离株中发现集聚型B包囊. (三)其它基因 i.内含子基因(introngene) 许多原生生物中都具有短的内含子,但早期的 研究并没有报道在蓝氏贾第鞭毛虫基因组中存在 内含子.Nixon等(2002)c71在蓝氏贾第鞭毛虫编码 铁氧还原蛋白(2Fe一2s]的基因中发现一个长度为 35bp的剪接体内含子.此内含子的3'末端(AG)含 有规范的剪接位点,其5'端(CT)为非规范的剪接 位点.此外,除了首个核苷酸序列从CT从C外, 内含子尚含有与酵母菌相应序列相符的分支点序 列TACTAAC.同时在蓝氏贾第鞭毛虫基因中亦发 现存在多个剪接体多肽同源基因,包括真核生物特 异性剪接体蛋白同源物(Prp8andPrpl1),数个 DexH模体盒RNA解螺旋酶基因(此基因与真细菌 者同源.但在真核生物中其基本作用为进行内含子 的剪接),儿种原细菌样的Sm和Sm样核多肽,后者 包被于小核RNA(SnRNA)上. Russell等(2005)【8】在蓝氏贾第鞭毛虫编码核 糖体蛋白L7a基因(Rpl7a)中发现了第二个剪接 体内含子,其5'端为经典的剪接位点.将已知的两 个内含子序列进行比较后发现,在它们5'端和3' 端边界处具有广泛的核苷酸一致性,这与近期在 阴道毛滴虫属(副基体)中发现的保守剪接体内含 子序列相似.同时在贾第虫基因组中一个开放阅 读框中检测到第三个内含子.通过对Rpl7a内含 子种系分类和特性的综合分析,认为其可以作为 真核生物种系发生的标志. 2.小亚单位rRNA(SSU-rRNA)基因 BerriUi等(2004)[191采用小亚单位rRNA基因 序列分析的方法对意大利家养和农场动物的21 株蓝氏贾第虫分离株的基因型(其中分离自犬的 17株,猫1株,小牛3株)的遗传学特征进行分析. 结果表明,犬分离株中,76.5%为犬特异性基因型 (集聚C,D和集聚C/D),23.5%表现为潜在的动 物传染病基因型(集聚A和集聚A/C).猫分离株 属于集聚A.而小牛分离株的基因序列与有蹄家 畜的基因型相符,将其命名为集聚E. 目前.蓝氏贾第鞭毛虫的多种基因已被克隆并 特征化,基因组计划业已启动.蓝氏贾第鞭毛虫的 基因及基因型研究.对于本虫的生物进化,分子流行病学研究,贾第虫病的分子生物学诊断等多方 面奠定了良好的基础. 二,蓝氏贾第鞭毛虫的基因型 欧洲研究者Homan等(1992)将其分为波兰 株和比利时株;北美的学者Nashc21等则将其分为 两组,即组1+2和组3;澳大利亚的学者Mayrhofer 等[笠】将其分为集聚型(assemblage)A和集聚型B.实 际上,这些不同的分类方法在基因水平上是同义 的.即集聚型A与波兰株,组1+2所表述的基因型 一 致.其中包括W-B分离株,波兰分离株1(Port- land—i)等:基因集聚型B与比利时株,组3所表述 的基因型一致,其中包括GS等分离株.对基因集 聚型A和B进一步细分,每一集聚型大致可分为 两簇.即集聚型A中的簇I,簇?,集聚型B中的 簇?,簇?.集聚型A—I包括感染人和多种哺乳 动物的分离株笠-231.常可造成全球性的播散和流 行:集聚型A一?则全部为可感染人类的分离株 241 .集聚型B一?和B—IV则主要包括感染人类和动 物的不同基因型分离株Im22,~1. 另外.来自不同哺乳动物如猫,犬,猪,大鼠等 的蓝氏贾第鞭毛虫分离株PCR,同工酶谱及种系 树等分析表明又可分为其他几种基因型:集聚型 C和集聚型D(犬分离株)[24-251;集聚型E(猪分离 株)[24,26];集聚型F(猫分离株);集聚型G(大鼠分 表1蓝氏贾第鞭毛虫的基因型 热带病与寄生虫学2007年第5卷第1期 JournalofTropicalDiseasesandParasit~2007yol.Q 离株)(另见表1). 同一宿主可感染不同集聚型或基因型.而同 一 集聚型或基因型又可感染不同宿主.在哺乳动 物体内发现的集聚型和基因型在形态学上无明显 差异,因此,蓝氏贾第鞭毛虫的种内分类,目前尚 无令人满意的统一标准. 参考文献 1MeyerEA.HumanParasiticDiseases.NewYork.Oxford: E1sevviserAmsterdanpub.1999.17—43. 2HilaIioE.GogartenJP.TheV-ATPaseAsubunitgene (vma一1)fromGiardialamblia.BiochimBiophysActa.1995, 1238(1):94-98. 3HenzeK,MorrisonHG,SoginML,eta1.Sequenceand phylogeneticpositionofaclass?aldolasegeneinthe amitoehondriateprotist,GiardiaIomblia.Gene.1998,222 (2):163-168. 4SanchezLB,MorrisonHG,SoginML,eta1.Cloningand sequencingofanacetyl-CoAsynthetase(ADP—forming) genefromtheamitochondriateprotist,GiardiaIomblia. 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