罗红霉素的质量研究

罗红霉素的质量研究 CENTRAL SOUTH UNIVERSITY 本科生,设计, 题 目 罗红霉素的质量研究 学生姓名 王晓鹏 指导教师 饶万兵 学 院 中南大学药学院 专业班级 药学一班 完成时间 2010年6月 目录 罗红霉素的质量研究 摘要 罗红霉素是经红霉素结构改造得到的新一代大环内酯类抗生素，为保证临床 试验的用药安全及药品生产过程中的质控，该文根据中国药典及欧洲药典要求， 对三批罗红霉素原料药进行了比旋度、引湿性、水分、炽灼残渣及重金属检查; 分别采用HPLC和GC对其进行了有关物质、含量及溶剂残留测定;通过影响因 素试验、加速试验及溶液稳定性试验考察了罗红霉素原料药在温度、湿度、光线 等的影响下随时间变化的规律。通过以上项目的全面考察，为其生产以及保存提 供科学依据。 关键词:罗红霉素;HPLC;有关物质;含量;稳定性;溶剂残留;系统适应性 Study on the quality of roxithromycin Abstract: Roxithromycin was a new generation of macrolide antibiotics which was obtained by modifying the structure of erythromycin, to ensure clinical medication safety and pharmaceutical quality control during production, the specific optical rotation, the hygroscopicity, the water, the sulphated ash and the heavy metal of three batches roxithromycin drug substances were checked in this study; the content of roxithromycin and its related substances and residual solvent were determined by HPLC and GC; the variation laws with the time of the roxithromycin drug substances which were influenced by temperature, humidity level and the illumination were observed by stress testing, accelerated testing and stability testing. These compreh- ensive investigations can provide scientific proof for its production and preservation. Keywords: Roxithromycin; HPLC; related substances; content; residual solvent; system adaptability 1.前言 1.1研究背景 大环内酯类抗生素是一类具有共同化学结构和相近抗菌作用的抗菌药。按其大环结构含碳母核的不同，可分为14，15和16元环大环内酯类抗生素，是一组庞 [1]大的抑制蛋白质合成的快速抑菌药。 自1952年第一个大环内酯类药物红霉素A应用于临床以来，迄今为止已经发现的大环内酯类抗生素已逾百种。红霉素A作为临床一线用药，其优越性相当明显，成本低、口服方便、抗菌谱广、体内组织分布好、组织浓度高。作为耐药的金黄色葡萄球菌和溶血性链球菌感染治疗首选药物，临床应用甚多，对呼吸系统 [2]疾病、儿科、内科、其他系统的感染治疗发挥了重要的作用。但是红霉素A具有生物利用度低、抗菌谱窄、胃肠道刺激等不良反应。在胃酸中红霉素降解成无活性的副产物，直接导致生物利用度低、胃肠道刺激。针对红霉素A酸性失活的化学修饰，产生了第二代大环内酯类抗生素，第二代大环内酯类抗生素的代药物有罗红霉素、阿奇霉素、克拉霉素、地红霉素和氟红霉素等。与红霉素相比，第二代大环内酯类抗生素克服了酸不稳定性，改善了药动学性质，增加组织浓度，延长半衰期，拓宽了抗菌谱，增强了抗菌活性，胃肠道刺激等副作用得到明显降 [3]低，因而获得了广泛的临床应用。如今，以第二代红霉素如阿奇霉素、克拉霉素和罗红霉素等领军的大环内酯类抗生素在国际市场上所占份额近几年正稳步上升，从2000年的5%上升至2008年的11%。据悉，在国际市场上阿奇霉素、克拉霉素和罗红霉素等三支第二代红霉素产品的单品种销售额均为15亿美元。据悉，我国基本上已能生产几乎全部国际市场上销售的红霉素类原料药产品。从八十年代以来风行世界市场的琥乙红霉素到现在畅销国际市场的阿奇霉素，国内均 [4]已做到规模化生产程度。 罗红霉素(roxithromycin)是法国罗赛尔尤克拉夫公司于1987年从红霉素C9位羰基的一系列改造中获得的一个对胃酸稳定性高，生物活性较好的引入含氮及含氧基团的衍生物(大环内酯类药物的分析)。罗红霉素是该公司于1987年开发上市的新型大环内酯类抗生素，其体外抗菌谱与红霉素相似。对葡萄球菌、链球菌、 2 淋球菌、衣原体等有抗菌活性，临床上用于呼吸道、皮肤软组织及口腔感染。罗红霉素具有口服吸收好，生物利用度高，半衰期长，抗菌作用强，稳定性好等优[5]点。所以其在实际中的应用也越来越广泛。其结构式如下: OOO NHONOH HOOO HO OOO OOOH 罗红霉素在临床上的应用主要包括以下几个方面: 一、治疗泌尿生殖感染 罗红霉素对由支原体和衣原体引起的尿道炎、阴道炎和宫颈炎治疗是非常有 [6]效的。高锡霞用罗红霉素治疗非淋菌性宫颈炎、尿道炎88例，总有效率达92. [7]1%。王绍钧采用罗红霉素治疗尿道非淋菌性炎132例，痊愈率为80.88%，总有效率为91.18%，病原体清除率为82.35%，达到了良好的治疗效果，且不良反应 [8]均比较轻微，不影响治疗。周德惠采用罗红霉素联合维生素C阴道片治疗解脲支原体所致阴道炎103例，结果治愈93例，显效7例，无效3例，总有效率为97.1%。停药1个月后进行随访，复发7例，复发率为8.5%。结果表明联合用药具有一定的优越性。 二、治疗呼吸道感染 作为大环内酯类药物的罗红霉素，通过抑制细菌蛋白质合成，且细胞膜的穿透性强，极易渗入肝、肺等组织，起抑菌作用。对呼吸道感染的主要致病菌-流感嗜血杆菌、溶血性链球菌、肺炎双球菌，尤其对某些特殊的制病菌如肺炎衣原体、支原体、军团菌等有很好的抗菌作用。因此临床上用于治疗敏感菌引起的呼 [9]吸道感染效果显著。段敏超采用罗红霉索治疗支气管哮喘，疗效肯定。对患者给予常规吸氧、支气管扩张剂、糖皮质激素等治疗的基础上加用罗红霉索150mg，2次/d，疗程2周。研究结果表明，用罗红霉素配合糖皮质激素和支气管扩张剂的治疗方法能较快消除体征和症状，提高肺功能，并能有效地降低患者EOS水平， 3 治疗前后对照有显著差异。因此，对经支气管扩张剂或糖皮质激素治疗效果不理 [10]想的哮喘患者，加用罗红霉素治疗有确切的效果。欧阳喜雷应用罗红霉素联合雷米封治疗肺炎支原体感染，疗效总有效率为92.7%。研究表明由于两者联合应用的双重协同作用，更有利于促进炎症渗出的消散和吸收，从而提高疗效。尤其对缓解重而持久的咳嗽，效果较单用罗红霉素理想。 三、治疗五官感染 [11]吴炳光采用小剂量罗红霉素治疗慢性鼻窦炎、鼻息肉患者，结果表明症状改善81.0%，鼻内窥镜检查治愈33例，好转20例，无效5例，总有效率91.4%。治疗前后平均STT分别为( 43.6?10.2) min和( 23.5?5.8)min。通过本组观察，长期小剂量罗红霉素治疗慢性鼻窦炎和鼻息肉，确实可改善慢性鼻窦炎的临床症状， [12]使鼻息肉缩小，且服药剂量小、不良反应少。李健鹰应用小剂量长时间口服罗红霉素治疗常年性变应性鼻炎患者60例，治疗12周后，总有效率为80% ，鼻分泌物嗜酸性粒细胞(EOS)计数，血清细胞因子IL-5、IL-8浓度均较治疗前明显降低。研究表明小剂量长时间口服罗红霉素治疗常年性变应性鼻炎有效，可能通过减少机体细胞因子IL-5、IL-8，抑制EOS在鼻黏膜的聚集而发挥其抗炎、调节 [13]免疫的作用。刘瑞清应用香菊片加罗红霉素治疗慢性副鼻窦炎280 例，获得较好疗效。治愈203例，显效31例，好转27例，无效19例，总有效率93.3%。 四、治疗其他疾病 近年来有研究结果表明，罗红霉素具有对胃酸稳定，发挥强大的幽门螺杆菌 [14]作用。王道福采用罗红霉素、奥美拉唑合并羟氨苄青霉素三联疗法治疗有幽门螺杆菌感染的消化溃疡患者。罗红霉素、奥美拉唑合并羟氨苄青霉素的三联疗法幽门螺杆菌根除率达到93. 5%。这表明以罗红霉素为主的三联疗法具有对除幽门螺杆菌很高的根除率。同时近年来发现罗红霉素是胃动素受体激动剂，在餐后诱导胃产生类似于消化期间移行性复合运动(MMC) ?相，引起胃窦强大收缩，降低幽门压力，从而引起消化道反应，这种作用与罗红霉素化学结构密切相关。因此用该药治疗原发性胃轻瘫是让其激动胃动素受体，促进胃的排空，及时降低 [15]胃内压力，改善症状。 但随着罗红霉素的广泛应用，其不良反应发生情况呈现多样化，罗红霉素其不良反应以腹痛、腹泻、恶心、呕吐等胃肠道反应为主，偶见皮疹、皮肤瘙痒、 4 [16]头昏、头痛、肝功能异常、外周血细胞下降等。 1.2 罗红霉素分析方法研究进展 目前检测罗红霉素含量和有关物质的文献中描述的方法主要是HPLC法，还很少有文献报道有使用别的方法检测罗红霉素含量和有关物质的方法。 罗红霉素收录在2005版中国药典中，在该版药典方法中，采用十八烷基硅烷键合硅胶固定相为填充剂，以0.067mol/L磷酸二氢铵溶液(用三乙胺调节pH到6.5)-乙腈(65:35)为流动相，检测波长为210nm，罗红霉素的保留时间不少于9min，其与前相邻的杂志峰的分离度不得小于1.0，与后相邻杂质峰的分离度应不少于2.0，理论塔板数按罗红霉素峰计算不得小于2500。中国药典应用该方法测定罗红霉素的含量和有关物质。在2010版药典沿用了2005版药典中的检测方法和检测项，不过增加了溶剂残留的检测项目。在该检测项目下要检测甲醇、丙酮和N,N-二甲基甲酰胺的溶剂残留情况，限度符合指导原则规定的限度。 同时罗红霉素在EP6.0中也有收录，也是采用HPLC法测定罗红霉素的含量和有关物质。在该版药典中采用150mm*4.6mm，5umC-18色谱柱，检测波长205nm;柱温150?;采用梯度洗脱，流动相配置及洗脱程序如表1所示: 表1 罗红霉素EP6.0色谱条件 色谱条件 流动相配置 A相:59.7g/LNHHPO用稀NaOH调节pH到4.3，量取424 上述buffer740mL，加入260mL乙腈，混匀即得流动相A B相:乙腈:水=70:30(V/V) 色谱柱 150mm*4.6mm，5um C-18色谱柱 1.1mL/min 流速 Time Mobile phase A Mobile phase B 洗脱程序 (min) (percent V/V) (percent V/V) 0-50 100 0 50-51 10090 10 0,,,,,, 51-80 90 10 80-81 90100 100 ,,,,,, 100 0 81-100 205nm 检测波长 5 柱温 150? EP采用上述方法测定罗红霉素的含量和有关物质，并对罗红霉素含量做了规定，同时对其有关物质中的已知杂质的限度做了规定。在该版药典中定义了A、B、C、D、E、F、G、H、K、J、I;杂质G的限度为1.0%，其余杂质的限度为0.5%，总杂为3.0%。该方法专属性较好。 近年来，由于液质联用技术具有高灵敏度和高选择性的特点，因此它已广泛应用于生物药物分析中，成为定量测定复杂基质中小分子化合物的重要技术。但是随着研究的深入发现，以电喷雾作为电离源的液质联用技术存在一个致命的弱点—基质效应。基质效应主要是由共提物存在影响了待测物的离子化效率而引起的，这种效应直接会影响分析方法的准确度和精密度。在色谱定量分析中主要由两种校正方法:内标法和外标法。本研究在建立血浆中罗红霉素的测定方法时分别采用了上述两种定量校正方法，通过比较两种方法的校正曲线的线性、准确度 [17]和精密度等参数来确定一种可靠的定量方法。张丽芳等建立一种准确可靠的测定血浆中罗红霉素的液质联用方法。通过比较两种定量方法(内标法和外标法) 的校正曲线的线性、方法的准确度和精密度等参数最终确定选用内标法更能获得可靠的测定结果。 [18]陈鹭颖等建立测定人血浆中罗红霉素浓度的反相高效液相色谱法。方法:采用Agilent C18分析柱(150mm*4.6mm，3.6um)，以甲醇-0.02mol/l乙酸胺(68:32，用氨水调pH至7.4)为流动相，流速0.8mL/min，紫外检测波长210nm，柱温55?，血浆样品碱化后用乙醚提取两次，以克拉霉素为内标。结果:罗红霉素的保留时间为6.2min，线性范围为0.25-33ug/mL(r=0.997)，最低检测限为4ng，方法回收率为96.2%-100.1%之间，日内，日间RSD均小于4%。该法简便快速、准确灵敏、重现性好，适用于罗红霉素血药浓度测定。 1.3 罗红霉素的质量研究内容 药物的质量研究与质量标准的制订是药物研发的主要内容之一。在药物的研发过程中需对其质量进行系统、深入的研究，制订出科学、合理、可行的质量标准，并不断地修订和完善，以控制药物的质量，保证其在有效期内安全有效。 药物质量研究是制定质量标准的基础，为保证药品的安全有效，目前国际与 6 国内均对药物的质量研究提出更高的要求，尤其是杂质限度要求更加严格。 罗红霉素为具顺反异构体的化合物，顺式光学手性化合物为药用构型，由于各异构体可能表现出不同的活性，为了用药的安全有效，需对顺反异构体进行考察。 原料药的质量研究应在确证化学结构或组份的基础上进行。原料药的一般研究项目包括性状、鉴别、检查、含量测定和稳定性等几个方面。 稳定性主要包括:影响因素实验，加速实验，破坏性实验和长期实验。 影响因素试验是在剧烈条件下进行的，目的是了解影响稳定性的因素及可能的降解途径和降解产物，为制剂工艺筛选、包装材料和容器的选择、贮存条件的确定等提供依据。同时为加速试验和长期试验应采用的温度和湿度等条件提供依据，还可为分析方法的选择提供依据。 影响因素试验一般包括高温、高湿、光照试验。一般将原料药供试品置适宜的容器中(如称量瓶或培养皿)，摊成?5mm厚的薄层，疏松原料药摊成?10mm厚的薄层进行试验。对于口服固体制剂产品，一般采用除去内包装的最小制剂单位，分散为单层置适宜的条件下进行。 加速试验是在超常条件下进行的，目的是通过加快市售包装中药品的化学或物理变化速度来考察药品稳定性，对药品在运输、保存过程中可能会遇到的短暂的超常条件下的稳定性进行模拟考察，并初步预测样品在规定的贮存条件下的长期稳定性。 长期试验是在上市药品规定的贮存条件下进行，目的是考察药品在运输、保存、使用过程中的稳定性，能直接地反映药品稳定性特征，是确定有效期和贮存条件的最终依据。 残留溶剂作为已知的毒性杂质，在一定合理范围内使用，并需进行严格的控制，本文主要采用气相色谱法，一个色谱条件对多个溶剂进行测定，并参照中国药典和ICH相关的技术要求和限度进行研究。 药品的有效期应综合加速试验和长期试验的结果，进行适当的统计分析得到，最终有效期的确定一般以长期试验的结果来确定。通过以上数据的分析，可以最终确定药物的包装条件和储存条件，保证药物的质量。 7 1.4 本论文的主要内容 按现有药典的标准，采用高效液相色谱法和气相色谱法测定罗红霉素的有关物质、含量和溶剂残留;并测定了其炽灼残渣，水分和重金属等;在稳定性方面，进行原料药影响因素试验和加速试验，以考察罗红霉素原料药在温度，湿度，光线等的影响下随时间变化的规律，为药品的生产、包装、贮存、运输条件提供科学依据。 2(实验部分 2.1 仪器 Agilent 1200高效液相色谱仪(Agilent，美国)，配置有以下组件:高压四元泵、在线真空脱气机、自动进样器、二极管阵列检测器。由化学工作站软件控制各组件的运行。 Agilent7890A气相色谱仪 pH由Mettler Toledo DELTA 320 pH计测定。Mettler Toledo 电子分析天平。梅特勒公司卡尔费休水分滴定仪。 -1型自动指示旋光仪。WiseTherm马弗炉 W22 00永生40C恒温恒湿箱，永生光照稳定性实验箱，永生60C恒温恒湿箱。 2.2 试剂 乙腈:色谱纯;甲醇;磷酸二氢铵;盐酸;氢氧化钠;磷酸;罗红霉素标CRS准对照品(购于EP)。 没有特别说明，所有的试剂均为分析纯，实验所用水为Miliq 超纯水。 试验样品:罗红霉素三批:HCS09160-13-2-3，RXM00170，RXM00171，由宜昌长江药业提供。 8 2.3 实验内容 2.3.1罗红霉素的比旋度测定 2.3.1.1仪器准备 打开W22-1型自动指示旋光仪的电源开关，将电源开关置于"~"交流挡上，预热20min后，扳至直流"-"挡，准备测定。 2.3.1.2供试液准备 精密称取20mg样品于100mL容量瓶中，用无水乙醇溶解。在20??5?温度(或各药品项下规定的温度)下，恒温，定容。 2.3.1.3测定旋光度 先做空白校正，用空白溶剂(无水乙醇)冲洗测定管数次，缓缓注入溶剂适量(注意勿使发生气泡)，置于旋度计内读数，调零旋钮调零。同法测定供试液。表盘读数右旋者为右旋以"+"表示，反之为左旋以"-"表示。重复读数三次，取平均值计算。测定后，再次用空白溶剂调零，以确定测定时零点有无变动，如有零点变动，应重新测定旋光度。测定过程中，须保证测定温度在20??5?。 测定结果:HCS09160-13-2-3，RXM00170，RXM00171三批样品的旋光度分别为-83.675?，-83.632?，-83.332?。均在药典规定的-82?,-87?范围内。 2.3.2罗红霉素引湿性的测定 药物的引湿性是指在一定温度和湿度条件下该物质吸收水分多少的特性。本法仅作为表述药品引湿性的一种指征，适用于中国药典收载且满足该品种正文项下干燥失重或水分限度要求的药品。同时亦可作为药品选择适宜的包装和贮存条件的参考。具体测定方法如下: 2.3.2.1 取一定量供试品置已精密称重(m)的具塞玻璃称量瓶，精密称重(m)。 122.3.2.2 把称量瓶敞口置于25?1?的恒温干燥器(下部放置氯化铵或硫酸铵饱和 溶液)，相对湿度为80?2%。 2.3.2.3 放置24h。 2.3.2.4 盖好称量瓶盖子，精密称重(m)。 3 9 m-m32计算:增重百分率=×100% (1) m-m21 测定结果经公式(1)计算后，得到HCS09160-13-2-3，RXM00170，RXM00171三批样品的增重率分别为0.225%，0.709%，0.668%，均在0.2%,2%之间，因此定义罗红霉素略有引湿性。 2.3.3罗红霉素的水分测定 用卡尔费休水分滴定仪测定罗红霉素原料药的水分，其操作步骤如下所示 2.3.3.1卡尔费休氏滴定液的标定 取纯化水5-6mg，称重，用卡尔费休氏液滴定至终点，卡尔费休氏液消 WV耗体积，计算F值，计算公式为:F= (2) 表2 卡氏液水分标定 RS 1 2 3 F均值(mg/mL) D 纯化水称重W(mg) 5.79 5.74 5.62 消耗卡氏液体积V(mL) 1.100 1.091 1.054 0.46 F(mg/mL) 5.2636 5.2612 5.3321 5.2856 % 2.3.3.2样品测定 分别取三批样品适量，称重，用卡尔费休氏液滴定至终点，记录卡氏液消耗体 FVW积，计算样品的水分，计算公式如下所示:水分%=×100 (3) 表3 样品HCS09160-13-2-3卡尔费休水分滴定结果 称重(mg) 体积(mL) 水分% 1 92.1 0.361 2.072% 2 141.5 0.559 2.088% 均值 — — 2.080% 所测得的罗红霉素原料药HCS09160-13-2-3的水分为2.080%，符合药典的要求含水量小于3.0%。 表4 样品RXM00170卡尔费休水分滴定结果 称重(mg) 体积(mL) 水分% 1 317.2 1.299 2.165% 2 326.2 1.327 2.150% 均值 — — 2.158% 所测得的罗红霉素原料药RXM00170的水分为2.158%，符合药典的要求含水量 10 小于3.0%。 表5 样品RXM00171卡尔费休水分滴定结果 称重(mg) 体积(mL) 水分% 1 251.1 1.008 2.122% 2 244.0 0.988 2.140% 均值 — — 2.131% 所测得的罗红霉素原料药RXM00171的水分为2.131%，符合药典的要求含水量小于3.0%。 综上所得，此三批罗红霉素原料药的水分含量均符合药典要求。 2.3.4罗红霉素的炽灼残渣和重金属检查 为控制原料药中残渣和重金属含量，须对其进行炽灼残渣和重金属检查，现取三批样品中的一批样品按美国药典的要求进行检查，操作如下: 炽灼残渣:在600?50?下，30min灼烧三个瓷坩埚，于干燥器中放凉后精密称定至恒重后(记m)，精密称定1g罗红霉素样品(记m)于坩埚中，。用少量硫酸12 (通常是1mL)润湿样品，然后用可行的尽可能低的温度缓缓加热直到样品完全炭化。放冷，然后除另有规定外，用少量硫酸(通常是1mL)润湿残渣，缓缓加热直到不再冒白烟，于600?50?灼烧直到残渣完全灰化。将坩埚于干燥器中放凉后准确称量至恒重后(记m)，计算残渣的百分含量，结果如下: 3 ,mm:52.0585g 52.0586g :50.4391g 50.4391g 1 1 ,m: 1.0220g m:1.0101g 22 ,mm:52.0588g 52.0588 :50.4394 50.4395 3 3 计算公式:炽灼残渣%=(×100 (4) m,m)m312 经公式(4)计算得平行两组结果的平均值为0.034%，符合药典要求的小于0.1%。 重金属检查—硫代乙酰胺法 取上述残渣，加6N盐酸4mL，加盖，置蒸气浴上加热15min，去盖，在蒸气浴上慢慢蒸至干，用1滴盐酸润湿残渣，加热水10mL，蒸煮2min，加盖放冷后，滴加6N氢氧化铵直到溶液对石蕊试纸呈碱性，用水稀释至25mL，以短程 11 pH试纸作为外指示剂，用1N醋酸调pH至3.0-4.0。必要时过滤，用10mL水洗涤坩埚和滤器，合并滤液和洗液，置50mL纳氏比色管中，用水稀释至40mL，摇匀。 在上述两试管中分别加pH=3.5的醋酸盐缓冲液2mL后加硫代乙酰胺-甘油试剂1.2mL，用水稀释至50mL。摇匀，放置2min，在白色背景下自上而下观察，供试品产生的颜色与标准品的相比，不得更深。 标准品溶液的配置:向纳氏比色管中加入1.0mL标准铅溶液(10ug/mL)，再加入pH=3.5的醋酸盐缓冲液2mL后加硫代乙酰胺-甘油试剂1.2mL，用水稀释至50mL即得。 检查结果:供试品产生的颜色比标准品的颜色浅，符合要求。 2.3.5 罗红霉素有关物质测定 2.3.5.1 色谱条件 仪器:HPLC 色谱柱:Waters Symmetry –C18 4.6×250mm，5μm 波长:205nm 运行时间:90min 进样体积:20µL 流速:1.1mL/min 柱温:20? 2.3.5.2 流动相配置 流动相A:用超纯水将磷酸二氢铵配置成59.7g/L的溶液，用稀氢氧化钠调节pH到4.3;利用上述BUFFER与乙腈混合，BUFFER:乙腈=74:26(V/V) 即得流动相A。 流动相B:乙腈:水=70:30(V/V) 梯度洗脱，梯度程序如表6所示: 12 表6 罗红霉素EP梯度洗脱程序 Time Mobile phase A Mobile phase B (min) (percent V/V) (percent V/V) 0-50 100 0 50-51 10090 10 0,,,,,, 51-80 90 10 80-81 90100 100 ,,,,,, 81-100 100 0 2.3.5.3 溶液配置 稀释液配置:用超纯水将磷酸二氢铵配置成59.7g/L的溶液，用稀氢氧化钠调节pH到5.3;利用上述BUFFER配置与乙腈混合，BUFFER:乙腈=70:30(V/V); 空白溶液:稀释液 系统适应性溶液:准确称取罗红霉素工作标准品CRS 10mg置于5mL容量瓶中，用稀释液溶解并稀释到刻度，摇匀即得。 供试品溶液:准确称取10mg供试品置于5mL容量瓶中，用稀释液溶解并稀释到刻度，摇匀即得。 2.3.5.4 实验步骤 取系统适用性溶液，进样20uL，记录色谱图，罗红霉素主峰与杂质G的分离度应不小于1.5。 取空白溶液，进样一针，进样20uL，记录色谱图。 取供试品溶液，进样20uL，记录色谱图，按照面积归一化法计算各杂质的含量。 2.3.5.5 结果与讨论 得到的系统适用性溶液的色谱图如图1所示，得到的系统适用性较好，罗红霉素与杂质G的分离度为2.54，符合系统适用性的要求。得到的空白溶液的色谱图和样品的色谱图如图2，图3所示: 13 图1 罗红霉素CRS对照品系统适用性色谱图 图2 空白溶液色谱图 图3 罗红霉素样品色谱图 按照上述色谱条件分别测定三批样品(HCS09160-13-2-3，RXM00170，RXM00171)，得到的结果如表7所示: 表7 三批样品有关物质测定结果 批号 HCS09160-13-2-3 RXM00170 RXM00171 RRT EP杂 14 质 A 0.28 未检出 未检出 未检出 B 0.31 未检出 未检出 未检出 C 0.33 0.09 0.18 0.18 D 0.62 0.15 0.16 0.21 E 0.67 0.16 0.39 0.32 F 0.83 0.11 0.44 0.46 G 1.15 0.21 0.24 0.18 K 1.7 未检出 未检出 未检出 H 1.85 0.2 0.27 0.30 J 2.53 0.2 0.26 0.24 I 3.03 0.13 0.2 0.24 0.90 0.15 0.11 0.10 未知1 1.26 0.09 0.08 未知2 未检出 3.17 0.13 0.12 0.08 未知3 -- 1.55 2.44 2.39 总杂 样品的检测结果符合EP要求。 2.3.6 罗红霉素含量测定 2.3.6.1色谱条件 如2.3.5.1和2.3.5.2所示 2.3.6.2 溶液配置 稀释液配置:用超纯水将磷酸二氢铵配置成59.7g/L的溶液，用稀氢氧化钠调节pH到5.3;利用上述配置的缓冲溶液与乙腈混合，BUFFER:乙腈=70:30(V/V); 空白溶液:稀释液 系统适应性溶液:准确称取罗红霉素工作标准品CRS 10mg置于5mL容量瓶中，用稀释液溶解并稀释到刻度，摇匀即得。 对照溶液:配置如系统适用性溶液，平行配置两份 15 供试品溶液:准确称取10mg供试品置于5mL容量瓶中，用稀释液溶解并稀释到刻度，摇匀即得，平行配置两份。 2.3.6.3实验步骤 取系统适用性溶液，进样一次，进样20µL，系统适用性达到标准后进空白溶液;取空白溶液，进样20µL，进样一次;取对照溶液，进样20uL;取供试品溶液，进样20µL，进样一针，罗红霉素的保留时间约为22min，以无水物计算本品的含量，计算公式如下: 含量=(AT，WS，P)(AS，WT，(1,W)) (5) 其中:AT为供试品溶液中罗红霉素主峰面积的平均值; AS为对照品溶液中罗红霉素主峰面积的平均值;WT为所称取供试品的重量(mg);WS为所称取对照品的重量(mg);P为对照品纯度;W为本品的水份。 2.3.6.4实验结果 按照上述公式计算罗红霉素的含量，其计算结果如表8所示: 表8 罗红霉素样品的含量测定 W(mg) C(mg/mL) Area Recovery(%) STAN-1 9.9 1.9800 12506.7 100.50 STAN-2 9.71 1.9420 12328.6 W(mg) C(mg/mL) Area Content% Avg% HCS09160-13-2-3-1 10.36 2.0720 13038.8 98.91 99.00 HCS09160-13-2-3-2 11.11 2.2220 14007.4 99.08 RXM00170-1 10.94 2.1880 13681 98.35 98.34 RXM00170-2 11.95 2.3900 14940 98.32 RXM00171-1 11.02 2.2040 13692 97.54 98.03 RXM00171-2 12.25 2.4500 15371 98.51 从上表中可以得到:三批样品的含量均符合EP对罗红霉素原料药含量的要求。 2.3.7 溶液稳定性 药物使用HPLC分析时需要配制成溶液然后进样，但是有些药物在溶液中不稳定会降解，生成未知杂质或者是某些已知杂质增加;有些物质在室温下不稳定， 16 但是在低温的时候比较稳定，故考察溶液的稳定性可以帮助确定HPLC分析时样品的储存条件，确保结果的准确性。 将溶液按照药典供试品溶液的配制方法，配制成2mg/mL的溶液，在室温放置(用HCS09160-13-2-3样品为代表)，分别在12h，24h，2d，3d，4d取样，考察溶液的稳定性，得到的稳定性数据如表9所示: 表9 罗红霉素溶液稳定性数据 0h 12h 24h 2d 3d 4d EP杂质 杂质A 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 杂质B 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 0.09 0.08 0.08 0.10 0.10 0.11 杂质C 0.15 0.28 0.41 0.61 0.90 1.22 杂质D 0.16 0.15 0.16 0.16 0.15 0.15 杂质E 0.11 0.13 0.14 0.14 0.14 0.14 杂质F 0.21 0.22 0.21 0.20 0.23 0.23 杂质G 杂质K 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 0.20 0.21 0.20 0.21 0.21 0.21 杂质H 0.20 0.22 0.22 0.21 0.21 0.20 杂质J 0.13 0.12 0.14 0.15 0.15 0.15 杂质I 0.15 0.14 0.13 0.15 0.14 0.16 未知1 0.13 0.13 0.14 0.13 0.13 0.13 未知3 1.55 1.69 1.85 2.06 2.36 2.68 总杂 从上表可知，罗红霉素在稀释液中放置4天，没有新的未知杂质出现，但是杂质D含量增加，其余的杂质基本上没有增加;杂质D的结构为罗红霉素的Z式异构体，其含量增加可能是罗红霉素在酸性条件下发生构型反转，罗红霉素E式构型生成其对映构型Z式结构，该杂质增加，故实验过程中稀释液需要现做现配置。 2.3.8 影响因素实验 影响因素实验是在比加速实验更激烈的条件下进行，其目的是探讨药物的固 17 有稳定性，了解影响其稳定性的因素及可能的降解途径与降解产物，为制剂生产工艺、包装、贮存条件和建立降解产物分析方法提供科学依据。 2.3.8.1 罗红霉素在高温下的稳定性 分别称取0.5g罗红霉素样品于称量瓶中，摊成?5mm厚的薄膜，置于60?恒温稳定性试验箱中，分别于5天，10天取样。考察罗红霉素的高温稳定性。实验结果如表10所示: 表10 罗红霉素高温稳定性 HCS09160-13-2-3 RXM00170 RXM00171 批号 RRT 5d 10d 5d 10d 5d 10d EP杂质 A 0.28 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 C 0.33 0.09 0.07 0.18 0.16 0.18 0.19 D 0.62 0.15 0.16 0.16 0.19 0.21 0.24 E 0.67 0.16 0.14 0.39 0.37 0.32 0.33 F 0.83 0.11 0.16 0.45 0.44 0.47 0.46 G 1.15 0.21 0.22 0.24 0.25 0.18 0.20 K 1.7 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 H 1.85 0.2 0.2 0.27 0.11 0.30 0.25 J 2.53 0.2 0.2 0.26 0.23 0.24 0.24 I 3.03 0.13 0.16 0.2 0.31 0.24 0.30 0.90 0.15 0.14 0.11 0.14 0.10 0.12 未知1 1.26 0.12 0.12 0.11 0.10 未知2 未检出 未检出 3.17 0.13 0.15 0.12 0.16 0.08 0.12 未知3 -- 1.55 1.59 2.52 2.54 2.44 2.57 总杂 备注:以有关物质检查项下的数据作为0天数据 从上表中数据可以看出:有关物质I和未知杂质3在60?下放置10天后含量有所增加，其余的杂质较稳定，总杂质没有超过限度。 2.3.8.2 罗红霉素高湿实验 取罗红霉素样品0.5g于称量瓶中，摊成?5mm厚的薄膜，开口置于25?2?恒温湿度92%(NHCl和NHSO饱和溶液)环境中，于第五天，第十天取样，444 18 照考察项目下的方法检测，考察罗红霉素样品在高湿度下的稳定性。实验结果如下表所示: 表11 罗红霉素高湿稳定性 HCS09160-13-2-3 RXM00170 RXM00171 批号 RRT EP杂质 5天 10天 5天 10天 5天 10天 A 0.28 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 B 0.31 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 C 0.33 0.10 0.09 0.18 0.17 0.18 0.18 D 0.62 0.17 0.19 0.39 0.43 0.44 0.44 E 0.67 0.16 0.15 0.37 0.38 0.31 0.30 F 0.83 0.11 0.15 0.44 0.46 0.46 0.44 G 1.15 0.23 0.28 0.15 0.17 0.14 0.20 K 1.7 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 H 1.85 0.2 0.17 0.11 0.18 0.28 0.3 J 2.53 0.19 0.21 0.22 0.21 0.19 0.22 I 3.03 0.13 0.15 0.30 0.35 0.38 0.40 0.90 0.13 0.12 0.14 0.16 0.12 0.13 未知1 1.26 0.10 0.10 0.11 0.10 未知2 未检出 未检出 3.17 0.12 0.12 0.20 0.23 0.15 0.17 未知3 -- 1.56 1.63 2.61 2.81 2.87 2.98 总杂 从上表结果可知:从上述结果罗红霉素在高湿条件下，大多数杂质都有所增加，总杂增加，故需要在罗红霉素包装的时候需要注意湿度。 2.3.8.3光照稳定性 分别取罗红霉素样品置于称量瓶中，摊成?5mm厚的薄膜，置于照度为4500?500lx的光照稳定性试验箱中，分别于第五天和第十天取样照有关物质检测项目检测。检测结果如表12所示: 表12 罗红霉素光照稳定性 HCS09160-13-2-3 RXM00170 RXM00171 批号 RRT EP杂质 5天 10天 5天 10天 5天 10天 19 A 0.28 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 B 0.31 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 C 0.33 0.11 0.10 0.14 0.18 0.15 0.14 D 0.62 0.17 0.18 0.35 0.35 0.42 0.44 E 0.67 0.16 0.14 0.39 0.36 0.32 0.30 F 0.83 0.11 0.14 0.44 0.43 0.46 0.44 G 1.15 0.23 0.26 0.21 0.16 0.16 0.20 K 1.7 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 H 1.85 0.2 0.21 0.30 0.38 0.26 0.3 J 2.53 0.22 0.21 0.22 0.21 0.19 0.22 I 3.03 0.13 0.16 0.30 0.28 0.29 0.27 0.90 0.11 0.12 0.14 0.12 0.11 0.11 未知1 1.26 0.10 0.10 0.09 0.10 未知2 未检出 未检出 3.17 0.12 0.12 0.19 0.23 0.11 0.13 未知3 -- 1.56 1.64 2.78 2.80 2.56 2.65 总杂 备注:以有关物质检测项下的数据作为0天数据 从上表可以得出:罗红霉素在光照条件下杂质有所增加，对光有些不稳定，故需要避光保存。 2.3.9 加速实验 取罗红霉素三批样品(批号:HCS09160-13-2-3，RXM00170，RXM00171)，置于称量瓶中，于温度40?2?，相对湿度75?5%的恒温恒湿稳定性试验箱中，分别于1个月，2个月，3个月，6个月末取样(由于时间原因6个月未做)，按照有关物质检查项下的条件进行检测。检测结果如表13所示: 表13 加速实验数据 HCS09160-13-2-3 RXM00170 RXM00171 批号 RRT 杂质 1月 2月 3月 1月 2月 3月 1月 2月 3月 A 0.28 未检未检未检未检未检未检未检未检未检 20 出 出 出 出 出 出 出 出 出 B 0.31 未检未检未检未检未检未检未检未检未检 出 出 出 出 出 出 出 出 出 C 0.33 0.09 0.10 0.10 0.16 0.17 0.18 0.16 0.16 0.15 D 0.62 0.17 0.16 0.16 0.37 0.36 0.35 0.41 0.42 0.44 E 0.67 0.16 0.16 0.16 0.39 0.38 0.39 0.32 0.30 0.30 F 0.83 0.11 0.13 0.14 0.44 0.44 0.43 0.46 0.46 0.44 G 1.15 0.23 0.23 0.26 0.21 0.23 0.23 0.26 0.25 0.25 K 1.7 未检未检未检未检未检未检未检未检未检 出 出 出 出 出 出 出 出 出 H 1.85 0.2 0.20 0.21 0.30 0.32 0.32 0.26 0.29 0.3 J 2.53 0.22 0.22 0.21 0.22 0.22 0.21 0.19 0.21 0.22 I 3.03 0.13 0.14 0.16 0.30 0.29 0.28 0.29 0.27 0.27 0.90 0.11 0.11 0.12 0.14 0.15 0.14 0.11 0.12 0.11 未知 1 1.26 0.10 0.10 0.11 0.09 0.09 0.10 未知未检未检未检 2 出 出 出 3.17 0.12 0.12 0.13 0.19 0.17 0.17 0.11 0.12 0.11 未知 3 -- 1.53 1.57 1.63 2.82 2.83 2.83 2.66 2.60 2.69 总杂 备注:以有关物质检测项下的数据作为0月数据 从上表可以得出以下结论:罗红霉素在40?下比较稳定，杂质在误差范围内结果变化不大。 2.3.10 溶剂残留考察 2.3.10.1 初始方法的建立 将整个合成工艺中的溶剂列出来，然后对里面的溶剂进行分析，根据各待测溶剂的理化性质，主要是沸点和极性，及其在FID检测器上的响应大小，将上述各溶剂分为两类进行测定。第一类是甲醇、乙醇和丙酮;第二类是DMF。 21 其初始方法如下所示: 参考EP2.4.24，初步设定甲醇、乙醇及丙酮的测定条件，具体色谱条件及顶空参数见表14。初步设定的各溶液配制方法见表15。 表14 甲醇、乙醇、丙酮测定方法参数 进样口 色谱柱 DB-624 模式 分流 色谱柱类 型 (30m*0.32mm*1.8um) 温度 140? 流速模式 恒压 6.0psi 载气 氮气 压力 柱温 Initial Temp Final Temp 40? 240? Initial Time 10min Final Time 2min Rate 1 20?/min —— —— 检测器 FID 温度 260? 类型 自动顶空进样器(PE TurboMatrix 40) 30.0min 柱温 105? 保温时间 3.0min 取样针温度 110? 加压时间 0.2min 传输线温度 115? 拔针时间 14.0psi 0.05min 载气压力 进样时间 表15 甲醇、乙醇和丙酮测定溶液配制 名称 配制过程 空白溶液 精密量取5.0mL DMF于20mL顶空瓶中 样品溶液 精密称取2.5g样品，用DMF溶解并稀释至25mL 甲醇、乙醇对照精密称取0.3g甲醇、0.5g乙醇，用DMF稀释并定容至液 100mL ，再精密量取1.0mL该溶液，用DMF稀释至100mL 精密称取0.5g丙酮，用DMF稀释并定容至100mL ，再精丙酮对照液 密量取5.0mL该溶液，用DMF稀释至50mL 样品加标溶液 精密称取2.5g样品，用对照液溶解并稀释至25mL 22 初步设定罗红霉素DMF残留方法，具体色谱条件及顶空参数见表16。初步 设定的各溶液配制方法见表17。 表16 N,N-二甲基甲酰胺测定方法参数 进样口 色谱柱 DB-624 模式 分流 色谱柱类型 (30m*0.32mm*1.8um) 温度 220? 流速模式 恒压 10.5psi 载气 氮气 压力 柱温 Initial Temp Final Temp 85? 200? Initial Time 10min Final Time 6min Rate 1 35?/min —— —— 检测器 FID 温度 260? 类型 自动顶空进样器(PE TurboMatrix 40) 30.0min 柱温 135? 保温时间 3.0min 取样针温度 140? 加压时间 0.2min 传输线温度 145? 拔针时间 18.0psi 0.10min 载气压力 进样时间 表17 N,N-二甲基甲酰胺测定溶液配制 名称 配制过程 空白精密量取5.0mLDMSO于20mL顶空瓶中 样品精密称取2.5g样品用DMSO溶解并稀释至25mL 溶液 精密称取0.88gN,N-二甲基甲酰胺用DMSO稀释至100mL，再溶液 对照液 精密量取1.0mL该溶液用DMSO稀释至100mL，再量取5.0mL 该溶液DMSO稀释至50mL 样品精密称取2.5g样品用对照液溶解并稀释至25mL 2.3.10.2 甲醇、乙醇及丙酮测定方法考察 加标 溶液 23 2.3.10.2.1 系统适应性考察 按照2.3.10.1项下设定的初始条件，进样甲醇、乙醇及丙酮的对照液一针，查看各待测溶剂峰的对称因子及分离度，具体测定结果见表18。 表18 甲醇、乙醇及丙酮系统适应性考察结果 参数 系统适应性参数 与最近峰分离度 对称因子 0.8~1.5 可接受标准 ?1.5 2.07 0.65 甲醇 7.72 0.75 乙醇 7.72 0.92 丙酮 由上表结果可知:用DB-624色谱柱检测时，甲醇、乙醇的对称因子分别为0.65和0.75，色谱峰拖尾严重，达不到预定标准。测定图谱见图1。 图4 甲醇、乙醇及丙酮系统适应性(DB-624柱) 由于甲醇和乙醇的对称因子达不到预定标准，故将色谱柱换成HP-INNOWA -X (30m*0.53 mm*1um)，载气压力设定为2.3psi ，其他参数均同2.3.10.1，进样对照液一针，考察其分离度和对称因子是否满足要求，结果见表19。 表19 甲醇、乙醇及丙酮系统适应性考察结果 系统适应性参数 参数 与其最近峰分离度 对称因子 24 0.8~1.5 可接受标准 ?1.5 13.19 0.91 甲醇 7.69 0.94 乙醇 13.19 0.96 丙酮 由上表结果可知:改变后的检测条件满足系统适应性要求。具体图谱见图5。 图5 甲醇、乙醇及丙酮系统适应性(HP-INNOWAX柱) 2.3.10. 2.2 专属性考察 按照2.3.10.1项下的溶液配制方法，分别配制空白溶液、样品溶液、对照溶液及样品加标溶液，于85?加热平衡30分钟，根据系统适应性优化的色谱条件，顶空进样分析，测定结果见表20。 表20 甲醇、乙醇及丙酮专属性考察结果 溶剂名称 空白液 供试液 对照液 加标液 加标液-供试液 51.48 50.14 50.14 峰甲醇 —— —— 1.17 77.79 76.73 75.56 乙醇 —— 面 368.26 2348.03 2706.29 2338.03 丙酮 —— 积 由上表的结果可知，顶空中无甲醇、乙醇、丙酮残留，溶剂中的其他峰对样品测定无干扰，各溶剂(加标液-供试液)的峰面积和对照液的峰面积基本相同，无基质效应的影响。 2.3.10.3 DMF测定方法考察 2.3.10.3.1 系统适应性考察 按照2.3.10.1项下设定的初始条件，进样DMF对照液一针，查看DMF峰的 25 对称因子及其与最近峰的分离度，具体测定结果见表21。 表21 N,N-二甲基甲酰胺系统适应性考察结果 参数 系统适应性参数 与最近峰分离度 对称因子 0.5~1.5 可接受标准 ?1.5 2.00 0.82 N,N-二甲基甲酰胺 由上表结果可知，在该色谱条件下，对照液中DMF峰的对称因子及其与最近峰的分离度均可达到预定标准，满足系统适应性的要求。 2.3.10.3.2 专属性考察 按照2.3.10.1项下的溶液配制方法，分别配制空白溶液、样品溶液、对照溶液及样品加标溶液，根据系统适应性优化的色谱条件，顶空进样分析，测定结果见表22。 表22 N,N-二甲基甲酰胺专属性考察结果 溶剂名称 空白溶液 供试液 对照液 加标液 加标液-供试液 DMF —— —— 4.47 4.80 4.80 由上表的结果可知，顶空进样器无N,N-二甲基甲酰胺残留(但需要注意，在检测前若使用过DMF，需要清洗顶空进样器至无DMF)，溶剂中的其他峰对样品测定无干扰，(加标液-供试液)的N,N-二甲基甲酰胺的峰面积和对照液中N,N-二甲基甲酰胺峰面积基本相同，基质效应不明显。 2.3.10.4 方法确立 综合以上各测定结果，确定出罗红霉素甲醇、乙醇和丙酮测定的最终方法参数见表23，溶液配置方法见表15; N,N-二甲基甲酰胺测定的最终方法参数和溶液配制方法分别见表16和表17。 表23 甲醇、乙醇、丙酮测定方法参数 进样口 色谱柱 HP-INNOWA -X 模式 分流 色谱柱类 (30m*0.53 mm*1um) 型 26 温度 140? 流速模式 恒压 2.3psi 载气 氮气 压力 炉温 Initial Temp Final Temp 40? 240? Initial Time 10min Final Time 2min Rate 1 20?/min —— —— 检测器 FID 温度 260? 类型 自动顶空进样器(PE TurboMatrix 40) 30.0min 炉温 105? 保温时间 3.0min 取样针温度 110? 加压时间 0.2min 传输线温度 115? 拔针时间 14.0psi 0.05min 载气压力 进样时间 2.3.10.5测定结果 用上面优化的溶剂残留测定方法，测定的三批样品的结果如下所示: 样品批次 甲醇残留量 乙醇残留量 丙酮残留量 DMF残留量 HCS09160-13-2-3 743ppm 20ppm 未检出 未检出 RXM00170 659ppm 23ppm 未检出 未检出 RXM00171 530ppm 25ppm 未检出 未检出 从上面的结果可以得出，可以将甲醇、乙醇和DMF溶剂残留作限度测试;由于丙酮作为重结晶做的溶剂，必须定量检测。 3. 小结 通过对罗红霉素进行质量研究，生产的三批样品都符合EP标准，也符合中国药典标准，同时罗红霉素在高温下较稳定，但是在湿度和光照下有些不稳定。对加速试验数据的分析可以说明罗红霉素稳定性较好。通过对罗红霉素工艺中用到的溶剂进行分析，并通过方法学研究，找到了溶剂残留的分析方法。 27 4. 致谢 感谢指导老师饶万兵对我的悉心指导与帮助，以及东阳光研究院分析中心所有师兄师姐及其领导对我的关心与帮助;在你们的热心指导下，我才顺利的做完毕业设计。 感谢陪伴我四年大学生活的母校，是你给了我学习的机会和展现自己的舞台;感谢母校各位老师的谆谆教诲，是你们给了我专业的知识，为人处世的道理; 感谢陪伴了我四年的同窗，是你们与我共同奋进。 参考文献 [1] 焦丹,大环内酯类抗生素研究进展.医药导报,2009,28(6),69-71 [2] 张桂枝, 罗永煌,大环内酯类抗生素研究进展[ J ].动物医学进展, 2004,25(3): 33-36 [3] 董毅,大环内酯类扰生素的研究进展[ J ]国外医药合成药生化 药制剂分册, 2001,22(3):134-136 [4] 苏奎, 红霉素类再度“走红”,医药经济报,2009,12(7) [5] E J Co rey, Sunggak Ki m, L aw rence S . 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