沙门氏菌检测.doc

沙门氏菌检测.doc 1 对传统的沙门氏菌检测方法的改进 由于检测沙门氏菌的传统培养基选择性和特异性不能达到今人满意的效果，沙门氏菌在饲料中的检出率又较低，而柠檬酸菌属、变形杆菌等均可能对沙门氏菌的检测产生干扰，因此传统的沙门氏菌检测方法需不断改进，其改进内容主要集中在选择性培养基的选择上。如由于沙门氏菌具有可特异性地分解丙烯乙二醇产酸，使中性红指示剂变红的生化特征，在分离培养基中加入丙烯乙二醇、5一溴一4-氯-3一吲哚一β-D呋喃半乳糖，可实现对沙门氏菌的分离与鉴定工作同步进行，使沙门氏菌检测所需时间从常规方法的 4,6 d缩短至2 d;采用Salmosyst培养基进行增菌后，在Rambach培养基上进行分离培养，可及用对沙门氏菌的快速检测，大大减少了检测中所需培养基种类，同时培养过程全部在37?下进行，操作简便;采用Salmosyst增菌液，对热伤害沙门氏菌环恢复效果，比常规检测方法中采用缓冲蛋白胨水和四硫磺酸盐煌绿增菌液更好，使检测灵敏度得到较大的提高。 2 快速酶触反应及代谢产物的检测 快速酶触反应是根据细菌在其生长繁殖过程中可合成和释放某些特异性的酶，按酶的特性，选用相应的底物和指示剂，将它们配制在相关的培养基中。根据细菌反应后出现的明显的颜色变化，确定待分离的可疑菌株，反应的测定结果有助于细菌的快速诊断。这种技术将传统的细菌分离与生化反应有机的结合起来，并使得检测结果直观，成为今后微生物检测发展的一个重要发展方向。据Manafi等报道，沙门氏菌属(包括各亚属)均产生辛酯酶，这一性能是肠杆菌科除沙雷氏菌属外其它各属细菌所不具备的，因此可用来鉴别沙门氏菌与肠杆菌科其它属细菌。近来，Aguirre,Ruiz,Manafi，Freydiere等用意大利Biolife公司的试剂“MUCAP Test”测试肠杆菌科细菌、假单胞菌属、气单胞菌属和类志贺氏邻单胞菌，证明该法对沙门氏菌有很高的敏感性和特异性，操作也十分简便、快速。中华人民共和国进出口商品检验行业标准SN 0332,94即为用4-甲基伞形酮辛酯(MUCAP)试剂对沙门氏菌进行检验的方法。 3 免疫学方法检测沙门氏菌抗原或抗体的技术 3(l 抗血清凝集技术 早在1933年，Lancefield就成功地用多价血清对链球菌进行了血清分型。随着抗体制备技术的进一步完善，尤其是单克隆抗体的制备，明显提高了细菌凝集实验的特异性，可用于沙门氏菌的分型和鉴定，如以沙门氏菌属特异单抗HRP标记抗体为核心试剂直接ELISA试验，为沙门氏菌检验和诊断提供了新技术。扬州大学研制两株针对沙门氏菌属共同表位的单抗 CBS和 de7它们与 99,的沙门氏菌属内不同血清的沙门氏菌反应，在此基础上，建立了直接的ELISA方法，并构建了沙门氏菌快速检测试剂盒。 3(2 乳胶凝集实验 将特异性的抗体包被在乳胶颗粒上，通过抗体与相应的细菌抗原结合，产生肉眼可见的凝集反应。通常此法需获得细菌纯培育物，再将培养物与致敏乳胶反应。目前FDA认可的产品有Bactigen、Spectate、Microscreen、 Serobact等，见表 l。 3(3 荧光抗体检测技术 用于快速检测细菌的荧光抗体技术主要有直接法和间接法。直接法是在检测样品上直接滴加已知特异性荧光标记的抗血清，经洗涤后在荧光显微镜下观察结果。间接法是在检样上滴加已知的细菌特异性抗体，等作用后经洗涤，再加入荧光标记的第二抗体。如研制成的抗沙门氏菌荧光抗体，用于750份食品样品的检测，结果表明，与常规培养法符合率基本一致 3(4 酶联免疫测试技术 酶联免疫技术应用，大大提高了检测的敏感性和特异性，现已广泛地应用在沙门氏菌的检验，如Salmonella,TEK、 TECRA、 BacTrce、 Assurance、EQUATE等，见表1。应用酶联免疫技术制造的mini-Vidas全自动免疫分析仪，是用荧光分析技术通过固相吸附器，用已知抗体来捕捉目标生物体，然后以带荧光的酶联抗体再次结合，经充分冲洗，通过激发光源检测，即能自动读出发光的阳性标本，其优点是检测灵敏度高，速度快，可以在48 h的时间内快速鉴定沙门氏菌。 4 聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR)技术 PCR技术原理为提高DNA探针的敏感性，可先将靶 DNA序列扩增，增加 DNA数量，使其达到足够的检测量，若反应以动力学为基础，则能定量分析。1983年 Millus和 Cetus发明了最基本的扩增 DNA或增加样品中特殊核苷酸片段数量的方法-聚合酶链反应即PCR法。PCR法建立在三步重复发生反应的基础上。?通过热处理将双股DNA变性裂解成单股DNA;?退火延伸引物至特异性寡核苷酸上;?酶促延伸引物与DNA配对合成楼板，引物退火，变性DNA片段，引物杂交形成的模板可参与再次反应。溶液中核苷酸通过酶聚合成相互补对的DNA片段，并能重新裂解成单股DNA成为下次PCR复制的模板。因此每次循环特异性DNA将以双倍量增加。典型扩增经过20,40次循环能引起100万倍的扩增。在PCR反应中引人Taq聚合酶使反应得以半自动化和简便反应程序。用扩增DNA进行的PCR反应具有无与伦比的优越性。 由于沙门氏菌血清型特别繁多(目前世界上已分离出近2 000多个血清型，我国也已发现了近百个血清型)，因此，对沙门氏菌的检测往往不能准确和灵敏，而 Xiaoming Li(2000)，CAROLA BURTSCHER(1999)， Kapley A((2000)等利用 PCR技术却能准确地检测出微量的沙门氏菌。