执业中药师考试中药化学黄酮

第六章 黄酮 考点精要: 1.黄酮类化合物的含义与结构分类; 2.黄酮类化合物的理化性质(性状、溶解性、酸性、显色反应); 3.黄酮类化合物的提取与分离; 4.中药实例; 5.黄酮类化合物的结构结构鉴定(UV，NMR)。 定义: 黄酮类化合物是广泛存在于自然界的一大类化合物，由于这类化合物大多呈黄色或淡黄色，且分子中亦多含有酮基而因此被称为黄酮。 经典定义:指基本母核为2-苯基色原酮的一系列化合物。 现代定义:泛指两个苯环(A与B环)通过三个碳原子相互连接而成的一系列化合物，其基本碳架为C-C-C。 636 第一节 结构与分类 一、苷元的结构与分类 分类依据:根据中央三碳链的氧化程度、B-环联接位置(2-或3-位)以及三碳链是否成环等特点，可将中药中的主要的黄酮类化合物分类，如表所示。 此外，尚有由两分子黄酮或两分子二氢黄酮，或一分子黄酮及一分子二氢黄酮按C-C或C-O-C键方式联接而成的双黄酮类化合物。 另有少数黄酮类化合物结构很复杂，如水飞蓟素为黄酮木脂体类化合物，而榕碱及异榕碱则为生物碱型黄酮。 配伍选择题 A.黄酮醇 B.二氢黄酮 C.二氢黄酮醇 D.异黄酮 E.查耳酮 1.2，3位有双键，3位连有羟基的黄酮类化合物是( ) [答疑编号5630060101] 【正确】A 2.2，3位无双键，3位连有羟基的黄酮类化合物是( ) [答疑编号5630060102] 【正确答案】C 3.2，3位无双键，3位没有羟基的黄酮类化合物是( ) [答疑编号5630060103] 【正确答案】B 4.2，3位有双键，3位连有B环的黄酮类化合物是( ) [答疑编号5630060104] 【正确答案】D 二、黄酮苷的糖的结构与分类 单糖类:D-葡萄糖、D-半乳糖、D-木糖、L-鼠李糖、L-阿拉伯糖及D-葡萄糖醛酸等。 121l1612 双糖类:槐糖(glc—glc)、龙胆二糖(glc—6gc)、芸香糖(rha—glc)、新橙皮糖(rha—glc)、 16刺槐二糖(rha—gal))等。 “新龙腾云怀抱刺” 16121612 三糖类:龙胆三糖(glc—glc—fru)、槐三糖(glc—glc—glc)等。 酰化糖类:2-乙酰葡萄糖、咖啡酰基葡萄糖等。 黄酮苷中糖联接位置与苷元的结构类型有关。如黄酮醇类常形成3-、7-、3′- 、4′-单糖苷，或3，7-;3，4′-及7，4′-双糖链苷等。 除O-糖苷外，天然黄酮类化合物中还发现有C-键苷，如葛根素、葛根素木糖苷,为中药葛根中的扩张冠状动脉血管的有效成分。 R=H 葛根素;R=xylose 葛根素木糖苷 重要考点: 1.黄酮类化合物结构分类; 2.黄酮苷类常连接的单糖; 3.黄酮苷类常连接的双糖。 第二节 理化性质 一、性状 1.形态 黄酮类化合物多为结晶性固体，少数(如黄酮苷类)为无定形粉末。 (可用结晶或重结晶法进行分离) 2.旋光性 游离的苷元中，除二氢黄酮、二氢黄酮醇、黄烷及黄烷醇有旋光性外，其余均无光学活性。 黄酮苷类由于在结构中引入糖分子，故均有旋光性，且多为左旋。 3.颜色 黄酮类化合物大多呈黄色，所呈颜色主要与分子中是否存在交叉共轭体系有关，助色团(-OH、-0CH3等)的种类、数目以及取代位置对颜色也有一定影响。 黄酮、黄酮醇及其苷类多显灰黄,黄色 查耳酮为黄,橙黄色 二氢黄酮、二氢黄酮醇及异黄酮类，几乎无色 异黄酮显微黄色。 在黄酮、黄酮醇分子中，尤其在7位或4′位引入-OH及-OCH等供电子基团后，产生p-π共轭，促进3 电子移位、重排，使共轭系统延长，化合物颜色加深。但-OH、-0CH引入分子结构中其他位置，则对颜色影3 响较小。 花色素的颜色可随pH不同而改变,一般pH,7时显红色，pH为8.5时显紫色，pH,8.5时显蓝色。 二、溶解性 黄酮类化合物的溶解度因结构类型及存在状态不同而有很大差异。 1.游离黄酮类化合物 一般难溶或不溶于水。 易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯、乙醚等有机溶剂及稀碱水溶液中。 花色素,二氢黄酮,异黄酮,黄酮(醇),查耳酮 (原因:黄酮、黄酮醇、查耳酮等平面性强的分子，分子间排列紧密，相互用力较大，故更难溶于水;而二氢黄酮及二氢黄酮醇等，因系非平面性分子，分子间排列不紧密，相互作用力较小，有利于水分子进入，溶解度稍大;花色苷元(花青素)类以离子形式存在，故水溶度较大。) 黄酮类化合物如分子中引入的羟基增多，则水溶性增大，脂溶性降低; 羟基被甲基化后，则脂溶性增加。 2.黄酮苷类 一般易溶于水、甲醇、乙醇等强极性溶剂。 难溶或不溶于苯、氯仿、乙醚等亲脂性有机溶剂。 苷分子中糖基的数目多少和结合的位置，对溶解度亦有一定影响。 三、酸碱性 (一)酸性 黄酮类化合物因分子中多具有酚羟基，故显酸性，可溶于碱性水溶液、吡啶、甲酰胺及二甲基甲酰胺 中。 酸性由强至弱的顺序: 7，4′-二OH,7-或4′-0H,一般酚羟基,5-OH NaHCO Na2CO 0.2%NaOH 4%NaOH 33 7-和4′-位酚羟基，受p-π共轭效应影响,酸性较强;3或5-位酚羟基，可与4-位的羰基形成分子内 氢键，故酸性最弱。 此性质可用于提取、分离及鉴别工作。 (二)碱性 黄酮类化合物分子中γ-吡喃酮环上的1-位氧原子，因有未共用电子对,故表现出微弱的碱性，可与强无机酸，如浓硫酸、盐酸等生成(钅羊)盐，该盐极不稳定，加水后即分解。 黄酮类化合物溶于浓硫酸中生成的(钅羊)盐，常常表现出特殊的颜色,可用于黄酮类化合物结构类型的初步鉴别。某些甲氧基黄酮溶于浓盐酸中显深黄色,且可与生物碱沉淀试剂生成沉淀。 所生成的盐极不稳定，加水后即可分解。 四、显色反应 黄酮类化合物的颜色反应主要是利用分子中的基本母核及其所含的酚羟基的性质。 (一)还原反应 1.盐酸-镁粉反应 (最常用的反应) 方法:将样品溶于1.0ml甲醇或乙醇中,加入少许镁粉(或锌粉)振摇，滴加几滴浓盐酸，1,2分钟内(必要时微热)即可显色。 (+)黄酮(醇)、二氢黄酮(醇) 红,紫色 (助色团—OH，—OCH可使颜色加深) 3 (-)查耳酮、橙酮、儿茶素、多数异黄酮 注意:排除假阳性，应先加盐酸不显色，再加镁粉。 2.四氢硼钠(钾)反应(二氢黄酮类专属显色反应) 方法:是在试管中加入0.1ml含有样品的乙醇液，再加等量2%NaBH4的甲醇液,1分钟后，加浓盐酸或浓硫酸数滴，生成紫至紫红色。 (+)二氢黄酮类 紫,紫红色 (-)其他黄酮类 另外,近来报道二氢黄酮可与磷钼酸试剂反应而呈棕褐色，也可作为二氢黄酮类化合物的特征鉴别反应。 (二)金属盐类试剂的络合反应 黄酮类化合物分子中若具有3-羟基、4-羰基或5-羟基、4-羰基或邻二酚羟基等结构，则可以与许多金属盐类试剂如铝盐、锆盐、锶盐等反应，生成有色的络合物或有色沉淀，有的还产生荧光。 1.铝盐 样品 + 1%AlCl(三氯化铝) 黄色(紫外灯λmax,415 nm下呈亮黄色荧光) 3 (4′-羟基黄酮醇或7，4′-二羟基黄酮醇显天蓝色荧光) 2.铅盐 样品 + 1%乙酸铅(碱式乙酸铅水溶液) 黄至红色沉淀 (乙酸铅需有可络合结构才可沉淀，而碱式乙酸铅可与一般酚类化合物沉淀，据此不仅可用于鉴定， 也可用于提取及分离工作。) 3.锆盐 利用此反应鉴别黄酮类化合物分子中3-或5-OH的存在与否: 3位有羟基的黄酮类化合物与二氯氧锆形成的络合物 4.镁盐 5.氯化锶(SrCl) 2 样品+氨性氯化锶?具有邻二酚羟基结构的黄酮类化合物生成绿色至棕色乃至黑色沉淀。 具有邻二酚羟基的黄酮类化合物与SrCl的反应 2 6.三氯化铁 样品 + 三氯化铁 紫、绿、蓝色 含有酚羟基即显阳性反应，但一般仅在含有氢键缔合的酚羟基时，才呈现明显的颜色 (三)硼酸显色反应 5-羟基黄酮、2′-羟基查耳酮类 + 硼酸(无机酸或有机酸存在条件下)亮黄色。 一般在草酸存在下显黄色并具有绿色荧光，但在枸橼酸丙酮存在的条件下，则只显黄色而无荧光。 (四)碱性试剂显色反应 (1)二氢黄酮类易在碱液中开环，转变成相应的异构体——查耳酮类化合物，显橙色至黄色。 (2)黄酮醇类在碱液中先呈黄色，通入空气后变为棕色，据此可与其他黄酮类区别。 3)黄酮类化合物的分子中有邻二酚羟基取代或3，4′-二羟基取代时，在碱液中不稳定，易被氧化， ( 出现黄色?深红色?绿棕色沉淀。 显色反应 适用结构 盐酸-镁粉反应 黄酮(醇)、二氢黄酮(醇) 还原反应 四氢硼钠(钾)反应 二氢黄酮类专属显色反应 铝盐 3-OH，5-OH，邻二酚羟基 铅盐 3-OH，5-OH，邻二酚羟基 金属络合反应 锆盐 3-或5-OH，5-OH加枸橼酸褪色 镁盐 3-OH，5-OH，邻二酚羟基 氯化锶 邻二酚羟基 多项选择题 5,7-二羟基黄酮的阳性反应有( ) A.三氯化铝反应 B.四氢硼钠反应 C.锆盐-枸橼酸反应 D.氨性氯化锶反应 E.盐酸-镁粉反应 [答疑编号5630060105] 【正确答案】AE 重要考点: 1.颜色与结构的关系; 2.溶解性与结构的关系(记住溶解度顺序); 3.酸性与结构的关系(记住酸性顺序); 4.显色反应: (1)还原反应(盐酸-镁粉、四氢硼钠的显色适用范围); (2)金属络合反应(适用结构、所用试剂，特别是锆盐的显色判定); (3)硼酸与碱性试剂(了解适用对象及颜色变化现象); (4)碱性试剂反应。 第三节 提取与分离 黄酮类化合物的溶解性: 游离黄酮:多不溶于水; 易溶于甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿; 溶于碱水。 黄酮苷类:多溶于水、甲醇、乙醇、丙酮; 不溶于氯仿、石油醚等低极性有机溶剂; 溶于碱水。 (一)溶剂法 1.乙醇或甲醇提取法 高浓度的醇(如90%,95%)适于提取游离黄酮。 60%左右浓度的醇适于提取黄酮苷类。 提取方法可选择冷浸法、渗漉法或回流法等。 2.热水提取法 该法成本低，安全，适合于工业化生产，但提出的杂质较多，并且仅限于提取黄酮苷类。 (二)碱提酸沉法 酚羟基黄酮?碱性水或碱性稀醇(如50%的乙醇)浸出?浸出液经酸化?黄酮类化合物游离，沉淀析出，或用有机溶剂萃取。 常用的碱性水溶液为稀氢氧化钠溶液和石灰水。 注意:?碱浓度不宜过高,以免在强碱下加热时破坏黄酮类化合物母核。 ?加酸酸化时，酸性也不宜过强，以免生成(钅羊)盐，致使析出的黄酮类化合物又重新溶解，降低产品收率。 ?当分子中有邻二酚羟基时，应加硼酸保护。 (三)炭粉吸附法(了解) 主要适于苷类的精制工作。通常，在植物的甲醇粗提取物中，分次加入活性炭，搅拌，静置，直至定性检查上清液无黄酮反应时为止。过滤，收集吸苷炭末，依次用沸水、沸甲醇、7%酚-水、15%酚-醇溶液进行洗脱。对各部分洗脱液进行定性检查(或用PC鉴定)。通过对Baptisia lecontei中黄酮类化合物的研究证明，大部分黄酮苷类可用7%酚-水洗下。洗脱液经减压蒸发浓缩后,再用乙醚振摇除去残留的酚,余下水层减压浓缩即得较纯的黄酮苷类成分。 二、分离 (一)柱色谱法 分离黄酮类化合物常用的吸附剂或载体有硅胶、聚酰胺及纤维素粉等。此外,也有用氧化铝、氧化镁及硅藻土等。 1.硅胶柱色谱 主要适于分离异黄酮、二氢黄酮、二氢黄酮醇及高度甲基化(或乙醚化)的黄酮及黄酮醇类。 少数情况下，在加水去活化后也可用于分离极性较大的化合物，如多羟基黄酮醇及其苷类等。 供试硅胶中混存的微量金属离子，应预先用浓盐酸处理除去，以免干扰分离效果。 2.聚酰胺柱色谱 吸附原理:氢键吸附。 吸附强度主要取决于黄酮类化合物分子中酚羟基的数目与位置等及溶剂与黄酮类化合物或与聚酰胺之间形成氢键缔合能力的大小。 洗脱规律: 以含水流动相(水-乙醇)做洗脱剂,黄酮苷比游离黄酮先洗脱下来。 (1)苷元相同，洗脱先后顺序一般是:叁糖苷，双糖苷，单糖苷，苷元。 (2)母核上羟基越多，吸附越强，越难洗脱。 (3)聚酰胺对处于羰基间位或对位的羟基吸附力大于邻位羟基，故洗脱顺序为:具有邻位羟基黄酮，具有对位(或间位)羟基黄酮。 (4)不同类型黄酮化合物,先后流出顺序一般是:异黄酮，二氢黄酮醇，黄酮，黄酮醇。 (5)分子中芳香核、共轭双键多者易被吸附，故查耳酮往往比相应的二氢黄酮难于洗脱。 3.葡聚糖凝胶柱色谱 凝胶型号:Sephadex-G型及Sephadex LH-20型 分离机理:分离游离黄酮——吸附作用(酚羟基越多，吸附越强，越不容易洗脱) 分离黄酮苷——分子筛(分子量越大，越容易洗脱) 常用洗脱剂: (1)碱性水溶液(如0.1mol/LNH0H)，含盐水溶液(0.5mol/LNaCl等)。 4 (2)醇及含水醇,如甲醇,甲醇-水(不同比例)，t-丁醇-甲醇(3:1)、乙醇等。 (3)其他溶剂:如含水丙酮、甲醇-三氯甲烷等。 (二)pH梯度萃取法 酸性由强至弱的顺序 7，4′-二OH,7-或4′-0H,一般酚羟基,5-OH NaHCO NaCO 0.2%NaOH 4%NaOH 323 (三)根据分子中某些特定官能团进行分离 有邻二酚羟基的成分可被乙酸铅沉淀，不具有邻二酚羟基的成分可被碱式乙酸铅沉淀，据此可将两类成分分离。 具有邻二酚羟基的黄酮可与硼酸络合，生成物易溶于水，借此也可与不具上述结构的黄酮类化合物相互分离。 配伍选择题 A.3,5,7-三羟基黄酮 B.3,5-二羟基-7-O-葡萄糖基黄酮苷 C.3,5,7,4’-四羟基黄酮 D.3,5,4’-三羟基-7-O-葡萄糖基黄酮苷 E.3,5,7,3’,5’-五羟基黄酮 以上五种化合物经聚酰胺柱色谱，以水-乙醇混合溶剂梯度洗脱 1.首先被洗脱的是( ) [答疑编号5630060201] 【正确答案】B 2.第二被洗脱的是( ) [答疑编号5630060202] 【正确答案】D 3.第三被洗脱的是( ) [答疑编号5630060203] 【正确答案】A 4.第四被洗脱的是( ) [答疑编号5630060204] 【正确答案】C 5.第五被洗脱的是( ) [答疑编号5630060205] 【正确答案】E 重要考点: 1、熟悉游离黄酮与黄酮苷的溶解性; 2、黄酮类化合物提取与分离的方法都有哪些(记住方法名称); 3、碱提酸沉的操作及注意事项(如果具有邻二酚羟基，要加硼酸保护); 4、聚酰胺柱色谱的吸附规律(出峰顺序); 5、pH梯度萃取的分离顺序(记住酸性与结构的关系)。 第四节 含黄酮类化合物的中药实例 一、黄芩 主要有效成分:有黄芩苷(含4.0%,5.2%)、黄芩素、汉黄芩苷、汉黄芩素等黄酮类化合物。 生物活性:具有抗菌、消炎作用，此外，黄芩苷还有降转氨酶的作用。黄芩素的磷酸酯钠盐可用于治 疗过敏、喘息等疾病。 《中国药典》指标成分:黄芩苷。 黄芩苷为淡黄色针晶。 几乎不溶于水，难溶于甲醇、乙醇、丙酮，可溶于含水醇和热乙酸。 遇三氯化铁显绿色，遇乙酸铅生成橙红色沉淀。 溶于碱水及氨水初显黄色，不久则变为黑棕色。 经水解后生成的苷元黄芩素分子中具有邻三酚羟基，易被氧化转为醌类衍生物而显绿色，这是黄芩因保存或炮制不当变绿色的原因。黄芩变绿后，有效成分受到破坏，质量随之降低。 二、葛根 主要成分:含异黄酮类化合物，主要成分有大豆素、大豆苷、大豆素-7，4′-二葡萄糖苷及葛根素、 葛根素-7-木糖苷。 《中国药典》指标性成分:葛根素。 生物活性:葛根总异黄酮有增加冠状动脉血流量及降低心肌耗氧量等作用; 大豆素具有类似罂粟碱的解痉作用; 大豆素、大豆苷及葛根素均能缓解高血压患者的头痛症状; 葛根素有α受体阻断作用。 三、银杏叶 主要成分:有黄酮、黄酮醇及其苷类、双黄酮和儿茶素类等。 《中国药典》指标性成分:总黄酮醇苷和萜类内酯。要求总黄酮醇苷大于等于0.4%，对照品采用槲皮素、山柰酚和异鼠李素;要求萜类内酯大于等于0.25%，对照品采用银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C和白果内酯。 生物活性:银杏黄酮类化合物具有扩张冠状血管和增加脑血流量作用。 银杏叶制剂是血小板激活因子抑制剂，长期服用可能抑制血小板的凝血功能引起脑出血。 四、槐花 主要成分:芦丁、槲皮素、皂苷、白桦脂醇、槐二醇以及槐米甲、乙、丙素和黏液质等。 芦丁是有效成分，可用于治疗毛细血管脆性引起的出血症，并用做高血压的辅助治疗剂。据近代研究表明槐米中芦丁的含量高达23.5%， 槐花开放后降至13.0%。《中国药典》指标成分:总黄酮。要求槐花总黄酮(以芦丁计)大于等于8.0%，槐米总黄酮大于等于20.0%，对照品采用芦丁。 芦丁可溶于乙醇、吡啶、甲酰胺等溶剂中，不溶于苯、乙醚、氯仿、石油醚，易溶于热水，冷水中溶 200，沸乙醇中1:60，沸甲醇中1:7。 解度小。在冷水中1:10000，沸水中1: 芦丁分子中具有较多酚羟基，显弱酸性，易溶于碱液中，酸化后又可析出，因此可以用碱溶酸沉的方法提取芦丁。 芦丁分子中因含有邻二酚羟基，性质不太稳定，暴露在空气中能缓缓氧化变为暗褐色，在碱性条件下更容易被氧化分解。硼酸盐能与邻二酚羟基结合，达到保护的目的，故在碱性溶液中加热提取芦丁时，往往加入少量硼砂。 五、陈皮 主要成分:挥发油，黄酮类化合物橙皮苷等。 生物活性:橙皮苷具有和芦丁相同的用途，也有维生素P样功效，多作成甲基橙皮苷供药用,是治疗冠心病药物“脉通”的重要原料之一。 《中国药典》指标性成分:橙皮苷,陈皮中要求橙皮苷大于等于2.5%。 橙皮苷性质:几乎不溶于冷水，在乙醇或热水中溶解度较大，可溶于吡啶、甘油、乙酸或稀碱溶液，不溶于稀矿酸、三氯甲烷、丙酮、乙醚或苯中。 与三氯化铁、金属盐类反应显色或生成沉淀，与盐酸-镁粉反应呈紫红色。 橙皮苷在碱性水溶液中其γ-吡喃酮环容易开裂，生成黄色的橙皮查耳酮苷，酸化后又环合成原来的橙皮苷沉淀析出。 六、满山红 主要成分:杜鹃素、8-去甲基杜鹃素、山柰酚、槲皮素、杨梅素、金丝桃苷、异金丝桃苷以及莨菪亭、伞形酮、木毒素、牻牛儿酮、薄荷醇、杜松脑和α-、β-、γ-桉叶醇等。其中杜鹃素是祛痰成分，临床用于治疗慢性支气管炎。 《中国药典》以杜鹃素为对照品对满山红进行含量测定。要求杜鹃素大于等于0.08%。 : 中主要黄酮类成分 结构特点 主要生理活性 药 均属黄酮类化合黄黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉物。 黄芩苷具有抗菌、消炎、降转氨酶等作用 芩 黄芩素 汉黄芩苷(素) 在5位有甲氧基 均属异黄酮类化葛合物。 葛根总黄酮具有增加冠状动脉血流量及大豆素、大豆苷、葛根素 根 大豆苷为氧苷、降低心肌耗氧量等作用 葛根素为碳苷 山奈酚类、槲皮素类、木犀草素银银杏黄酮类化合物具有扩张冠状血管和类、二粒小麦黄酮、儿茶素类、 双杏分类较多 增加脑血流量作用,银杏叶制剂是血小板黄酮类 叶 激活因子抑制剂 (总黄酮醇苷、萜类内酯) 中主要黄酮类成分 结构特点 主要生理活性 药 芦丁可治疗毛细血管脆性引起槐芦丁、槲皮素 (总黄酮) 均属黄酮醇类化合物 的出血症，并用做高血压的辅助花 治疗剂 陈橙皮苷 属二氢黄酮类化合物 (用途同芦丁) 皮 满杜鹃素、8-去甲基杜鹃素、山奈酚、分类较多，主要成分杜杜鹃素具有祛痰作用，临床用于山槲皮素、杨梅素、金丝桃苷、异金丝鹃素属二氢黄酮类化治疗慢性支气管炎 红 桃苷等 合物 配伍选择题 A.槐二醇 B.芦丁 C.金丝桃苷 D.杜鹃素 E.槲皮素 1.槐米中治疗出血症的有效成分是 [答疑编号5630060206] 【正确答案】B 2.满山红中的祛痰有效成分是 [答疑编号5630060207] 【正确答案】D 第五节 鉴别与结构鉴定 一、色谱法在黄酮类化合物鉴别中的应用 (一)纸色谱 适用于分离各种天然黄酮类化合物及其苷类的混合物。 混合物的鉴定常采用双向色谱法。 以黄酮苷类为例 第1向展开采用某种醇性溶剂,如n-BuOH-HOAc-HO(4:1:5上层，BAW)等(分配作用原理)。 2 第2向展开溶剂则用水或含水溶液，如2%,6%HOAc等(吸附作用原理)。 黄酮类化合物苷元一般宜用醇性溶剂或用CH-HOAc-HO (125:72:3)、CHCl3-HOAc- H2O (13:6:662 1)、PhOH-HO(4:1)或HOAc-浓HCl-HO (30:3:3)进行分离。 22 对于花色苷及其苷元，则可用含HCl或HOAc的溶液作为展开剂。 纸色谱显色: ?用紫外光灯检查时，可以看到有色斑点，以氨蒸气处理后常产生明显的颜色变化。 ?可喷以2%AlCl(甲醇)溶液(在紫外光灯下检查)或1%FeCl，-1%KFe(CN)(1:1)水溶液等显3336色剂。 Rf影响因素: ?以含水溶剂展开时，平面性较强的分子如黄酮、黄酮醇、查耳酮等Rf较小(,0.02);而非平面性分子如二氢黄酮、二氢黄酮醇、二氢查耳酮等，因亲水性较强，故Rf值较大(0.10,0.30)。 ?黄酮类化合物分子中羟基苷化后，极性即随之增大，故在醇性展开剂中Rf值相应降低，同一类型苷元，Rf值依次为:苷元,单糖苷,双糖苷。 ?以在BAW中展开为例,多数类型苷元(花色苷元例外)Rf值在0.70以上，而苷则小于0.70。但在用水或2%,8%HOAc，13%NaCl水溶液或1%HCl展开时，则上列顺序将会颠倒，苷元几乎停留在原点不动，苷类的Rf值可在0.5以上，糖链越长，则Rf值越大。 (二)吸附色谱 硅胶薄层色谱:用于分离与鉴定弱极性的黄酮类化合物较好。 展开剂:甲苯-甲酸甲酯-甲酸(5:4:1),并可以根据待分离成分极性的大小适当地调整甲苯与甲酸的比例。另外尚有苯-甲醇(95:5)、苯-甲醇-乙酸(35:5:5)、三氯甲烷-甲醇(8.5:1.5，7:0.5)、甲苯-三氯甲烷-丙酮(40:25:35)、 丁醇-吡啶-甲酸(40:10:2)等。分离黄酮苷元的衍生物如甲醚或乙酸乙酯等中性成分,可用苯-丙酮(9:1)、苯-乙酸乙酯(7.5:2.5)等为展开剂。 聚酰胺薄层色谱:适用范围较广,特别适合于分离含游离酚羟基的黄酮及其苷类。 展开剂:由于聚酰胺对黄酮类化合物吸附能力较强，因而需要用可以破坏其氢键缔合的溶剂作为展开剂。在大多数展开剂中含有醇、酸或水。常用的展开剂有乙醇-水(3:2)、水-乙醇-乙酰丙酮(4:2:1)、水-乙醇-甲酸-乙酰丙酮 (5:1.5:1:0.5)、水饱和的正丁醇-乙酸(100:1，100:2)、丙酮-水(1:1)、丙酮-95%乙醇-水(2:1:2)、95%乙醇-乙酸(100:2)、苯-甲醇-丁酮(60:20:20)等。 二、紫外及可见光谱在黄酮类化合物鉴别中的应用 一般程序如下: (1)测定样品在甲醇溶液中的UV光谱。 (2)测定样品在甲醇溶液中加入各种诊断试剂后得到的UV及可见光谱。常用的诊断试剂有甲醇钠(NaOMe)、乙酸钠(NaOAc)、乙酸钠-硼酸(NaOAc-HB0)、三氯化铝(AlCl)及三氯化铝-盐酸(AlCl-HCl)3333等。 (3)如样品为苷类，则可先进行水解，或甲基化后再水解，并测定苷元或其衍生物的UV光谱。 (一)黄酮类化合物在甲醇溶液中的UV光谱特征 带?在300,400nm区间,由B环桂皮酰系统电子跃迁引起; 带?在220,280nm区间,由A环苯甲酰系统电子跃迁引起。 1.黄酮及黄酮醇类 两者UV光谱谱形相似，但带?位置不同，可据此进行分类。 在黄酮及黄酮醇母核上，如7-及4′-位引入羟基、甲氧基等供电基，将促进结构重排，有利于实现上述电子转移，可引起相应吸收带红移。通常，整个母核上氧取代程度越高，则带?将越向长波方向位移。 表6-6 几种羟基黄酮类化合物的紫外吸收光源(带?) 带?峰的位置受A-环氧取代程度的影响，取代程度越高，则带?将越向长波方向位移。 表6-7 几种羟基黄酮类化合物的紫外吸收光源(带?) B-环的取代基对其峰位影响甚微，但可影响它的形状。例如当B-环上仅有4′-氧取代时,带?为单峰; 而当B-环上同时存在3′，4′-二氧取代时，则带?将为双峰(或一个主峰，并伴有一个肩峰)。 黄酮及黄酮醇母核上的羟基甲基化或苷化时，将引起相应吸收带，尤其带?向紫位移。 黄酮醇(3-OH游离) 352,385 黄酮醇(3,OH被取代) 328,357 当羟基乙酰化后，原来的酚羟基对光谱的影响将会完全消除。例如:具有4′-羟基的黄酮类在乙酰化后，将表现出与4′-甲氧基黄酮十分相近的光谱，据此可以鉴定黄酮类化合物母核上烷氧基的取代位置。 2.查耳酮及橙酮类 共同特征是带?很强，为主峰;而带?则较弱，为次强峰。 查耳酮中，带?位于220,270 nm，带?位于340,390 nm，有时分裂为?a(340,390 nm)及?b(300,320 nm)。 与黄酮、黄酮醇类化合物一样，环上引入氧取代基，也会引起吸收带、尤其带?向红位移(如下表)，在2′位上引入-OH时影响最大。2′-OH甲基化或苷化时，可引起带?向紫位移15,20nm，但其余位置的结构变化对带?影响不大。 橙酮中，常显现3,4个吸收峰，但主要吸收峰(带?)一般位于370-430nm，天然来源的橙酮可为388,413nm。 羟基甲基化或苷化时对光谱并不产生显著影响，但6，7-二羟基橙酮中的7-羟基除外。 后者如被甲基化或苷化，可使带?向紫位移18nm。 3.异黄酮、二氢黄酮及二氢黄酮醇 这三类化合物中，除有由A-环苯甲酰系统引起的带?吸收(主峰)外，因B-环不与吡喃酮环上的羰基共轭(或共轭很弱)，故带?很弱，常在主峰的长波方向处有一肩峰。 根据主峰的位置，可以区别异黄酮与二氢黄酮及二氢黄酮醇类。前者在245,270nm，后两者在270,295nm 。 黄酮类化合物UV吸收范围 总结: 黄酮类型 带?(nm) 带?(nm) 黄酮 250,280 304,350 黄酮醇(3-OH取代) 250,280 328,357 黄酮醇(3-OH游离) 250,280 358,385 异黄酮 245,270 310,330(肩峰) 二氢黄酮、二氢黄酮醇 270,295 300,330(肩峰) 查耳酮 220,270(低强度) 340,390 (二)加入诊断试剂后引起的位移及其在结构测定中的意义 1.加入诊断试剂后黄酮及黄酮醇类化合物的紫外光谱 (1)乙酸钠/硼酸 黄酮类化合物分子中如果有邻二酚羟基结构单元时，可在乙酸钠碱性下，与硼酸螯合，并引起相应峰带红移。 带? 红移12,30nm，B环有邻二酚羟基 带? 红移5,10nm，A环有邻二酚羟基 黄酮类化合物与硼酸形成的络合物 (不包括5,6位邻二酚羟基) (2)三氯化铝及三氯化铝,盐酸 分子中有邻二酚羟基或3-羟基,4-酮基，或5-羟基,4-酮基时，还可以与三氯化铝络合，并引起相应吸收带红移。 生成的铝络合物相对稳定性按下列顺序排列:黄酮醇的3-OH,黄酮的5-OH,二氢黄酮的5-OH,邻二酚羟基,二氢黄酮醇的3,OH。 邻二酚羟基及二氢黄酮醇3-OH系统与三氯化铝形成的络合物很不稳定，加入少量酸水(如盐酸)时即可分解(见下式)。二氢黄酮醇的铝络合物可因在乙酸钠中不稳定而予以鉴别。 AlCl/HCl , MeOH谱图——无3-及/或5-OH 3 AlCl/HCl ? MeOH谱图——可能有3-及/或5-OH 3 带? 红移35,55nm，有5-OH而无3-OH 红移50,60nm，有3-或3-和5-OH AlCl/HCl , AlCl谱图 —— 结构中无邻二酚羟基 33 AlCl/HCl ? AlCl谱图 —— 可能有邻二酚羟基 33 带? 紫移30,40nm，B环有邻二酚羟基 紫移50,65nm，A、B环具有邻二酚羟基 (3)甲醇钠(碱性较强,可使黄酮类化合物母核上的所有酚羟基解离，导致相应的吸收带红移) 带? 红移40 , 65nm,强度不变或增加 有4’-OH 红移50 ,60nm，强度减弱有3-OH，但无4’-OH 2.加入诊断试剂后的异黄酮、二氢黄酮及二氢黄酮醇的紫外光谱 因该组化合物的桂皮酰共轭系统被破坏，所以紫外光谱主要显现来自苯甲酰共轭系统的峰带?，对峰带?的吸收影响最大的是7位羟基和5位羟基。 (1)利用乙酸钠检测异黄酮、二氢黄酮及二氢黄酮醇的7位羟基: (乙酸钠显弱碱性，可使黄酮类化合物母核上酸性较强的酚羟基解离，从而导致相应的吸收带红移) 7-OH异黄酮 红移6,20nm(6位有氧取代时，观测不到) 5,7-OH二氢黄酮及二氢黄酮醇 红移34,37nm 7-OH二氢黄酮及二氢黄酮醇 红移51,58nm 在乙酸钠中7-羟基异黄酮的紫外光谱带?的移动 7-OH异黄酮 红移6,20nm(6位有氧取代时，观测不到) (2)利用三氯化铝/盐酸检测异黄酮、二氢黄酮及二氢黄酮醇的5位羟基: 带? 5-羟基的异黄酮 红移10,14 nm 5-羟基二氢黄酮、5-羟基二氢黄酮醇红移20,28nm 3.加入诊断试剂后的查耳酮、橙酮的紫外光谱 (1)利用甲醇钠检测查耳酮的4-羟基或2-及4′-羟基: 带? 红移60,100nm，强度增强有游离4-羟基的查耳酮 红移60,100nm，强度不变没有4-羟基,但有一个2-或4′-羟基 (2)利用甲醇钠检测橙酮的4′-羟基及6-羟基: 带? 红移70,95 m 有游离4′-羟基或6-羟基 红移幅度减小，同时有4′-和6-羟基 (3)利用三氯化铝和三氯化铝/盐酸对紫外光谱的影响，检测查耳酮和橙酮的邻二酚羟基: 查耳酮和 橙酮中B环上的邻二二酚羟基均可利用加入三氯化铝后，其紫外光谱的带?向长波移动40,70 nm(以样品 加入三氯化铝/盐酸诊断试剂后的紫外光谱中带?的位置为基准)来检出。 (4)利用三氯化铝/盐酸对紫外光谱的影响，检测查耳酮的2′-羟基:2′-羟基查耳酮的紫外光谱的 ?在含有三氯化铝,盐酸的溶液中大幅度向长波移动(40,60 nm)。 带 三、氢核磁共振在黄酮类化合物结构分析中的应用 溶剂: 氘代三氯甲烷 氘代二甲基亚砜(DMS0-d6) 氘代吡啶 无水DMS0-d6(没有作成衍生物的黄酮类化合物) 也可将黄酮类化合物作成三甲基硅醚衍生物，溶于四氯化碳中进行测定。 补充:核磁共振原理 化学位移δ，耦合常数J，裂峰数与峰面积 CH-X 3 X的电负性?, 电子云密度?, 屏蔽效应?, 共振在较低磁场发生，δ? (一)A环质子 1.5，7-二羟基黄酮类化合物 H-6总比H-8在较高场(H-6位移数字小) 当7-OH成苷时，则H-6及H-8信号均向低磁场方向位移 表6-12 5,7-羟基黄酮类化合物中H-6及H-8的化学位移 d为二重峰 2. 7-羟基黄酮类化合物 7-羟基黄酮类化合物的基本结构 H-5 δ8.0 d,J,9.0Hz (C-4位羰基强烈的负屏蔽作用，处于低场位置) H-6 δ6.70,7.10 dd, J=9.0Hz, J=2.5Hz H-5H-8 H-8 δ6.70,7.00 d,J=2.5Hz) 表6-13 在7-OH黄酮类化合物中H-5、H-6及H-8的化学反应位移 d为二重峰;dd为双二重锋 与5，7-二羟基黄酮类化合物比较,在7-羟基黄酮类化合物中H-6及H-8均将出现在较低的磁场内，化 学位移值大小的顺序可能颠倒。 (二)B环质子 1.4′-氧取代黄酮类化合物 4′-氧取代黄酮类化合物基本结构 大体上位于比A环质子稍低的磁场区 H-3′、H-5′的化学位移总是比H-2′、H-6′的化学位移值小，由于4′-OR取代基的屏蔽作用，以及C环对H-2′、H-6′的负屏蔽效应 H-2′、H-6′的具体峰位取决于C环的氧化水平，氧化水平越高，位移值越大。 表6-14 H-2′、H-6′及H-3′，H-5′的化学反应位移(在4′-氧取代黄酮类化合物中) 2. 3′，4′-二氧取代黄酮及黄酮醇 3 ′,4′-二氢取代黄酮及黄酮醇类化合物的基本结构 H-2′ δ7.20,7.90 d，J,2.5 Hz H-5′ δ6.70,7.10 d，J,8.5 Hz H-6′ δ7.20,7.90 dd，JH-5′,8.5，JH-2′ =2.5 Hz 依据H-2′及H-6′的化学位移，可以区别黄酮及黄酮醇的3′,4′-位上是3′0H,4′-OMe还是3′-0Me，4′-0H。 表6-15 H-2′及H-6′的化学位移(在3′，4′-二氧取代黄酮类化合物中) 3. 3′，4′-二氧取代异黄酮、二氢黄酮及二氢黄酮醇 H-2′、H-5′及H-6′将作为一个复杂的多重峰(常常组成两组峰)出现在δ6.70,7.10区域内。此时C环对其影响很小，各质子的化学位移将主要取决于它们相对于含氧取代基的位置。 4. 3′，4′，5′-三氧取代黄酮类化合物 当B环有3′，4′，5′-三羟基时，H-2′及H-6′将作为相当于两个质子的一个单峰， 出现在δ6.50,7.50范围内。但如3′-或5′-OH甲基化或苷化时，则H-2′及H-6′将分别以不同的化学位移作为一个二重峰(J,2.0 Hz)出现。 (三)C环质子 1.黄酮类 该类化合物的H-3常常作为一个尖锐的单峰信号出现在δ6.30左右。 黄酮醇类的3位H被-OH取代，故1H-NMR上无C环质子。 2.异黄酮类 异黄酮上的H-2，因正好位于羰基的β位，且通过碳与氧相接,故将作为一个单峰出现在比一般芳香质子较低的磁场区(δ7.60,7.80)，当用DMS0-d6作溶剂时，还将进一步移到δ8.50,8.70处。 3.二氢黄酮及二氢黄酮醇 (1)二氢黄酮: H-2与两个磁不等同的H-3偶合(Jtrans,Ca.11.0 Hz;Jcis,Ca.5.0 Hz)，故作为一个双二重峰出 现,中心位于δ5.20处。 两个H-3，因有相互偕偶(J,17.0 Hz)及H-2的邻偶,将分别作为一个双二重峰出现,中心位于δ2.80处，但两组峰常有相互重叠现象。 (2)二氢黄酮醇: 在天然存在的二氢黄酮醇中，H-2及H-3多为反式双直立键，故分别作为一个二重峰出现(J,11.0 Hz)。H-2位于δ4.90前后，H-3则位于δ4.30左右，两者很容易区分，据此还可确定C-2.及C-3的相对构型,即两质子互为反式，可用下式表示。 当3-OH成苷时，则使H-2及H-3信号均向低磁场方向位移，如表6-16。据此可以帮助判断二氢黄酮醇苷中糖的结合位置。 表6-16 在二羟黄酮及二氢黄酮醇上H-2及H-3的化学位移 化 合 物 H-2 H-3 二氢黄酮 5.00-5.50(dd) 靠近2.80(dd) 二氢黄酮醇 4.80-5.00(d) 4.10-4.30(d) 二氢黄酮醇3-O-糖苷 5.00-5.60(d) 4.30-4.60(d) (四)糖上的质子 1.单糖苷类 2.双糖苷类 (五)C-CH及C-CH质子 6383 (六)乙酰氧基的质子 (七)甲氧基上的质子 四、碳核磁共振在黄酮类化合物结构研究中的应用 13 黄酮类化合物C-NMR信号的归属一般可以通过: ?与简单的模型化合物如苯乙酮、桂皮酸以及它们的衍生物的图谱进行比较; ?用经验性的简单芳香化合物的取代基位移加和规律进行计算等方法加以解析。?在13C-NMR谱上，可以通过黄酮C环中央三个碳核信号的位置以及它们在偏共振去偶谱中的裂分情况，推断黄酮类化合物的骨架类型。 13 表6-21 C-NMR谱中黄酮类化合物结构中的中央三碳核的信号特征 C,0 C-2(或C-β) C-3(或C-α) 归 属 168.6-169.8(s) 137.8-140.7(d) 122.1-122.3(s) 异橙酮类 160.5-163.2(s) 104.7-111.8(d) 黄酮类 174.5-184.0(s) 149.8-155.4(d) 122.3-125.9(s) 异黄酮类 147.9(s) 136.0(s) 黄酮醇类 111.6-111.9(d) 182.5-182.7(s) 146.1-147.7(s) 橙酮类 (,CH) 136.9-145.4(d) 116.6-128.1(d) 查耳酮类 188.0-197.0(s) 75.0-80.3(d) 42.8-44.6(t) 二氢黄酮类 82.7(d) 71.2(d) 二氢黄酮醇类 配伍选择题 A.H-2’，H-6’的化学位移为7.10,7.30(d) B.H-2’，H-6’的化学位移为7.20,7.50(d) C.H-2’，H-6’的化学位移为7.60,7.80(d) D.H-2’, H-6’的化学位移为7.70,7.90(d) E.H-2’，H-6’的化学位移为7.90,8.10(d) 1.4’-氧取代的二氢黄酮的1H-NMR特征是( ) [答疑编号5630060301] 【正确答案】A 2.4’-氧取代的异黄酮的1H-NMR特征是( ) [答疑编号5630060302] 【正确答案】B 3.4’-氧取代的橙酮的1H-NMR特征是( ) [答疑编号5630060303] 【正确答案】C 4.4’-氧取代的黄酮的1H-NMR特征是( ) [答疑编号5630060304] 【正确答案】D 表6-14 H-2′，H-6′及H-3′，H-5′的化学位移(在4′-氧取化黄酮类化合物中) 化 合 物 H-2′，H-6′ H-3′，H-5′ 二氢黄酮类 7.10-7.30(d) 二氢黄酮醇类 7.20-7.40(d) 异黄酮类 7.20-7.50(d) 查耳酮类(H-2，H-6及H-3，H-5) 7.40-7.60(d) 6.50-7.10(d) 橙酮类 7.60-7.80(d) 黄酮类 7.70-7.90(d) 黄酮醇类 7.90-8.10(d)