培养基验证

培养基验证 培养基验证规程 1. 目的 本规程用于验证培养基的适用性和灵敏度 2. 适用范围 微生物实验室 3. 责任者 QC负责人。 4. 规程 4.1 培养基的灵敏度检查 A(菌种 培养基灵敏度检查所用的菌株传代次数不得超过5代(从菌种保存中 心获得的冷冻干燥菌种为第0代)，并采用适宜的菌种保藏技术，以保证试验菌 株的生物学特性。 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) ,CMCC(B) 26 003, 铜绿假单胞菌 (Pseudomonas aeruginosa) ,CMCC(B) 10 104, 枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis ) ,CMCC(B) 63 501, 生孢梭菌 (Clostridium sporogenes) [CMCC(B) 64 941] 白色念珠菌 (Candida albicans) [CMCC(F) 98 001] 黑曲霉 (Aspergillus niger ) [CMCC(F) 98 003 B(菌液制备 1)金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌菌液的制备 1 接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物至营养肉汤或营养琼脂培养基中，30,35?培养18,24小时，上述培养物采用液体培养物直接稀释法或细菌浓度比浊法，用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数小于100 cfu(/50~100cfu)的菌悬液(一般稀释至10-7)。菌数测定采用营养琼脂培养基平皿法。 2)枯草芽孢杆菌菌液的制备 接种枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤，30,35?培养18,24小时，上述培养物采用液体培养物直接稀释法或细菌标准浓度比浊法，用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数小于100 cfu (/50~100cfu)的菌悬液(一般稀释至10-5)。菌数测定采用营养琼脂培养基平皿法。 3)生孢梭菌菌液的制备 接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中,30,35?培养18,24小时，采用液体培养物直接稀释法或细菌标准浓度比浊法，用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数小于100 cfu (/50~100cfu)的菌悬液。菌数测定用硫乙醇酸盐流体培养基试管法。 4)白色念珠菌菌液的制备 接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基,23,28?培养24,48小时，上述培养物采用液体培养物直接稀释法或细菌标准浓度比浊法，用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数小于100 cfu (/50~100cfu)的菌悬液(一般稀释至10-6)。菌数测定用玫瑰红钠琼脂培养基平皿法。 5)黑曲霉菌液的制备 接种黑曲霉的新鲜培养物于改良马丁琼脂斜面培养基上,23,28?培养5,7天至大量孢子产生，加入3~5mL含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，采用适宜的方法吸出孢子悬液(用管口带有薄的无菌棉花或纱布能过滤菌丝的无菌毛细吸管)至无菌试管内，采用细菌标准浓度比浊法，用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数小于100 cfu(/50~100cfu)的孢子悬液。孢子数测定用玫瑰红钠培养基平皿法。 菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用;若保存在2~8?，可在24小时内使用。黑曲霉孢子悬液可保存在2~8?，在验证过的贮存期内使用。 2 C(灵敏度试验: 取每管装量为12ml的营养琼脂、营养肉汤、SCDLP、Baird Parker、甘露醇发酵培养基，分别接种小于100cfu的金黄色葡萄球菌各2只;12mL的十六烷三甲基溴化铵琼脂、SCDLP、明胶、绿脓素测定培养基、硝酸蛋白胨水接种小于100cfu铜绿假单胞菌各2只;12ml硫乙醇酸盐流体培养基枯草芽孢杆菌，生孢梭菌各2只，培养3天，取每管装量为9ml的改良马丁培养基和玫瑰红纳琼脂培养基分别接种小于100cfu的白色念珠菌，黑曲酶各2支，另一支不接种作为空白对照，培养5天，逐日观察结果。 (结果判断:空白对照管应无菌生长，若加菌的培养基管菌生长良好，判断培D 养基的灵敏度检查符合规定。 4.2 适用性检查 4.2.1 试验步骤 123a(菌液制备:按稀释度10,10,10等依次类推稀释菌悬液，接种培养后取50,100cfu计数。接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养琼脂培养基上;接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，30~35?，培养18~24小时;接种白色念株菌的新鲜培养物至改良马丁培养基上25~28?，培养24~48小时，上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml 含菌数为50~100CFU的菌悬液，备用。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，23~28?，培养5~7天，加入3-5ml0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，吸出孢子悬液(用管口带有薄的无菌棉花或纱布能通过滤菌丝的无菌巴氏吸管)至无菌试管内，用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数50,100cfu的孢子悬液。菌液制备后在室温2h内使用，在2~8?可再24h内使用。 b(适用性检查:接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌各50-100cfu，分别注入无菌平皿中，立即倾入营养琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，混匀，凝固，置30~35?培养48h，计数;取白色念珠菌、黑曲霉各50-100cfu，分别注入无菌平皿中，立即倾注玫瑰红钠琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，混匀，凝固，置23~28?培养72h，计数。同时，用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。 3 结果判定:若被检培养基上得菌落平均数不小于对照培养基上得菌落平均数的70%，且菌落形态大小与对照培养基上得菌落一致，判改培养基的适用性检查符合规定。 4.2.2 验证方法 验证试验至少应进行3次独立的平行试验，并分别计算个试验菌每次试验的回收率。 a(平皿法计数时，取试验可能用的最低稀释级供试液1ml和50,100cfu试验菌，分别注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌数。薄膜过率法计数时，取规定量试验可能用的最低稀释剂供试液，过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中加入50,100cfu试验菌，过滤，按薄膜过滤法测定其菌数。 b(菌液组 测定所加的试验菌数。 c(供试品对照组 取规定量的供试液，按菌落计数方法测定供试品本底菌数。 d(稀释剂对照组 若供试液制备需要分散、乳化，中和、离心或薄膜过滤等 待处理时，应增加稀释剂对照组，以考察供试液替代供试验品，加入试验菌，使最终菌浓度为每1ml供试液含50,100cfu，按试验组的供试液制备方法和菌落计数方法测定其菌数。 表1 微生物验证方法 组数 加样 加样量(mL) 回收率是否 (%) 合格 试验组 供试液+菌液 1 菌液组 菌液 供试品对照组 供试液 稀释剂对照组 稀释液+菌液 e(结果判断 在3次独立的平行试验中。 稀释剂对照组的平均菌落数 稀释剂对照的菌回收率= ×100% 4 菌液组的平均菌落数 试验组平均菌落数—供试品对照组平均菌落数 试验组的菌回收率= ×100% 菌液组的平均菌落数 各组回收率应均不低于70%，照该供试液制备方法和计数法测定供试品的细菌、霉菌及酵母菌数;若任一次试验中试验组的菌回收率低于70%，应采用培养基稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。 结果判定:若被检培养基上的菌落平均数不小于对照培养基上的菌落平均数的70%，且菌落形态大小与对照培养基上的菌落一致，判该培养基的适用性检查 符合规定。 5. 制定依据 《中华人民共和国药典》2010版第二部附录XI H无菌检查法 《中国药品检验标准操作》2010年版 无菌检查法 GB/T14233.3-2005医用输液、输血、注射器具检验方法 第二部分:生物学 6. 附录 附录1:培养基灵敏度检查报告 附录2:培养基适用性检查报告 附录1:培养基灵敏度检查报告 5 培养条件 菌种类型 培养基 温度 时间 阴性对照 结论 金黄色葡萄球菌 枯草芽孢杆菌 生梭孢菌 铜绿假单胞 白色念珠菌 黑曲霉 检验人 复核人 日期 备注: 6 附录2:培养基适用性检查报告 培养基 菌种类型 培养皿编号 对照培养基 验证培养基培养条件 结论 计数 计数 1 金黄色葡萄球菌 2 1 枯草芽孢杆菌 2 1 生梭孢菌 2 1 铜绿假单胞 2 1 白色念珠菌 2 1 黑曲霉 2 检验人 复核人 日期 备注: 7