载脂蛋白B—100受体结合缺陷新变种的检测

载脂蛋白B—100受体结合缺陷新变种的检测 载脂蛋白B—100受体结合缺陷新变种的检 测 中华医学杂志2呻1年12月l0日第8】卷第23期NailMMJChina,De~ntb.!.l,!.望 载脂蛋白B一100受体结合缺陷新变种的检测 牵颖冯建生牵文典 【摘要l目的筛壹导致家族性载脂蛋白B一100tapoB一100)受体结台缺陷的未 知突变,以阐明高 胆固醇血症的遗传背景,了解apoB-100受体结台区的定位方涪原发性高胆固醇血 症患者为对 象,用聚合酶链反应(PcR)扩增apoB基固第26外显子编码2980—3084位氨基酸 残基的核苷酸序列,长 363碱基对,产物进行单链构像多志性(SSCP),筛查可能存在的突变.结果341例样本的 sscP图谱均未发现异常电泳带结论(1)广东原发性高胆固醇血症患者上述区段不 存在突变.或 突变率租低(2)不支持2980—3084残基是apoB一100的受体结合区的假说 【美键词】载脂蛋白B;遗传病;高胆固醇血症;单链构像多态性 ?i?gforthe1Iewvariantofdefectivereceptor-bbadiQgapolipoproteinB-100,FENG jiansheng.?WendianDepartmentof?,MedicdCol&geofJina,zUniversity,Guangzhou510632, China 【Abstract】 ObjectiveTodetectpossiblyexistingunkno~mutation(s)innueleotidesequenceending aminoacidresidues2980to3084.thatnmyleadtofamilialdefeefiveapoB一 100,andtoprovideevideneefor ealua~ngthepu~tivereceptorbindingdomainofapoB一 100MethodsThenucleotidesequenceendingthe anaJnoacid~esHdue$2980— 3084ofapoBgenein341patientsvdthpfima~hypercholesteremiaandof50 controlswasamplifiedbyPCRandsubectedtosinglestrandconforrnafionalpolymoq~hism analysisunderoptimized conditionsResultsNoabnormaleleclix~phoreficfiga~rewasfoundinthesamplesfrom341h ~Tpercholesterlemic patientsand50conlix~Conclusion(1)Pointmutationcausinghypercholesterlemiaistmlike lytoexist,or .ifany.inthecodons2980—3084ofapoB100inChinese.t2jAminoacidresidues2980— 3084may notbeim'olvedinthereceptor-bindingofapoB一10(3 【Keywords】 ApohpoproteinB;Geneticdisease:Hype~holesterlemia;Singlestrandcotfformational polymorphism 家旗性apoB一100缺陷症(FDB)是由于apoB一100 与低密度脂蛋白受体结合能力受损而导致的遗传疾 病.据推断,apoB一100与受体结台有关区域可能定 位在2980.3o84,3359—3369,3441—3569和3665.3780 氨基酸残基这4段上一.作者选择了编码2980— 3084位氨基酸残基的DNA片段进行单链构像多态 性(sscP)分析,看其中是否存在影响apoB.1O0受体 结合功能的突变.以弄清FDB的遗传背景.并为 apoB.1O0受体结合区的定位提供证据: 对象与方法 一 , 对象 原发性高胆固醇血症患者341例,排除糖尿病 肝,肾,甲状腺疾病,年龄23,77岁,其中男169人 基盎项目:国家自然科学基金费助项目(3957039【J 作者位:5[0632广州.暨南大学医学院生化教研室:亭颖l李 颖现在新打[垃司立大学1.冯建生]珠海市扪劫保健院(李丈典1 通讯作者:冯建生,mal1:j[mmhenng@21encl?n 论着 女172人,血浆总胆固醇高于5.72mmol/L.或同时 有血浆甘油三酯高于1.7mmol/L_3J,341例患者血 浆总胆固醇6.75mmol/L?0.91mmol/L,甘油三酯 1.45mmol/L?0.81mmol/L.正常对照50例.分别 来自暨南大学医学院附属第一医院,暨南大学门诊 部及珠海市人民医院: 二,方法 1.静脉取血,酚一氯仿法提取白细胞中基因组 DNA浓度在0.3,0.5异/之间. 2.聚台酶链反应(PCR)-J:根据apoB基因序 列J,通过软件Primer辅助以引物,扩增apoB 基因9213号至9576号核苷酸问的碱基序列.上游 引物:5CATGTGGGCCACAGTGlqrCT3;下游引物:5 TCCTACATGGGCCTCCATAA3.由美国BRL公司合 成:Taq聚合酶等PCR用试剂购自上海生物工程有 限公司. 3.PCR产物的鉴定:用2%琼脂糖凝胶电泳分 离,与分子量比较以判断产物的分子量.限制 中华医学杂忐2001年l2月lO日第8】卷第23期Na— tlMealJChina, — December10.200— ],VoL81— , No.23 酶Dra1和Hpa1消化"及双脱氧末端终止法测序 按文献进行0. 4.PCR产物的SSCP分析:聚丙烯酰胺凝胶总浓 度7%,丙烯酰胺:双丙烯酰胺=49:1,甘油浓度为 8%,3ul产物碱变性后上样,温度10oC,10V/cm,电 泳6,7h.银染后干燥保存. 结果 1.PCR扩增及产物鉴定:PCR产物用2%的琼 脂糖电泳,得一清晰条带,无非特异扩增条带;扩增 带位于404bp和309bp之间,初步证明是所需363 bp目标片段(图1).产物经Dral消化后产生89bp 1pBR322.."b~p1分于量标准:(从L至 下,622527,404,309,242,217,190bp; -5PCR扩增产物 2 及274bp两个片 段,经Hpal消化后 产生218bp及145 bp两个片段,大小 均与预期相符. 选一个PCR产物 进行测序,顺序与 文献报道相同, 这证明PCR产物 确为目标片段. 图1FCR增产物琼脂糖电泳图谱2 . 通过对影 响SSCP各种参数的摸索比较,最后确定了SSCP的 电泳条件.按此条件进行分析,结果见图2.图中可 见(从上到下)两条单链带和一条复性双链带.条带 清晰,条带间分离良好,背景浅,实验重复性好.通 过反复进行分析,341例样品及50例正常对照的 SSCP图谱均未发现异常电泳带. 图2sscp电诛图谱 讨论 载脂蛋白B.100突变 导致与受体结台欢陷是引 起LDL清除缓慢,血浆胆 固醇升高的重要原因. Mihle等人推测,apoB一 100与受体结合有关区域 ,分别位于2980, 有3段 3084,3441—3569和3665,3780位氨基酸残基. 1989年首先发现3500号的精氨酸突变为谷氨酰胺 【Arg3500-to—Gln),它使LDL与受体的结合力严重受 损,只剩原来的4%.这一突变在白种人群中发生 率高达1/500—1/1COO,而其他民族则设有或罕见. 1995年又发现3531号精氨酸突变为半胱氨酸(Arg 3531一to—Cvs)7,但甚为罕见,它对LDL与受体结合 力的影响也弱.第3种是3500号精氨酸突变为色 氨酸(Arg3500一toTrp),它对LDL与受体结合的影 响和A3500Gln相同,突变携带者以华人居多,海 外华人中和台湾及大陆都有报道....上述都发生 在3441,3569氨基酸残基区段内,说明这一区段对 LDL与受体结合非常重要.但Boren等则认为. 只有3359—3369氨基酸残基才是直接与受体结合的 区段:而国外的筛查未能在这一区段内发现突 变_】1.那么,其他区段的氨基酸残基发生替换时会 否影响apoB一100与受体结合呢?为此,我们对2980— 3084这一区段进行了筛查,结果在341例高胆固醇 血症患者中均未发现突变,说明在广东人群中,此区 段内不存在突变.或突变率很低,此区段的突变不是 广东人群高胆固醇血症的主要原因;同时这一结果 也不支持Milne等提出的本区段是apoB.100受体结 合区之一的假说.因此apB一100与受体结合区域的 确定尚有待进一步研究. 参考文献 1blilneR.lsJrR.glamieeR.etal"foe…ofnocIon mltlbedi~to】0c】thelowdenshlipopmrein~eptor-bindingdomain ofapolJpopro~inBJBiolCh啪,1989,264:19754—19760. 2BoronJ.LeeI,ZhuWetalldenfifi~tionofthe1owdensiLv]ipopmtein re~ptorbindingsitein叩.lp0pr0LnB1呻and1hemodulationofits bindingae,twitvbythec盯b.xvlterminusin{arailialdefecfiveapo.B1130 JClinlnvesl,1998.10】:1084—1093 3h-圻,王钟林.宁田海,等血脂异常防治建议,中华心血管病杂 志.1997.25:169—172 4s日nIbmokJ,Frit~hEF.M~iatisTMolecu】盯cloning2ridedNew York:ColdSpringLabemtot3'?日1989a916-919;[b1414一 I4.19;【cJ528—5+32{dJ136—139 5LudwigEHBl~kberdBD.升m曲VR.etDNAg~eNceofthe humanapolipopreteinBgeneDNA,1987,6:363—372 6SofiaLF.hEH.CI盯he皿GalA~iationbetwe… specificapoHpopmleiaBmutmj吼蚰dlaafilJaldektiveapalipeproteinB一 100P瑚Natl^cadSciUSA,J989,86:5.591. 7Pulllnge~CR,H…gLK,Chatterton皿,etFamilialll8~d— defeclive呻0Up0ukmBidenfifidalioaofmutationthatdecrees LDL0rbindingKl[fidilyJClinht~'est.1995,95:1225-1234. 8GMfne)D,Reid删.Catrd00nIM.et.1ndep~dentmutafio~at c0den3500oftheapol[pep~telnBgenem~ialedwilh hvporlipidemlaArterlo~]erTnm?V舡cBiol,1995.15:1(n5—1029 9TaiDY,PanJP,Lee-ChenGJIdentification蚰dhaploty~e…alIsof apelipowcJ:einB-103atg35~Trymutationinh)TerlJpidemlcChine~ ClJnCh…199844:1659—1665 10冯建生,周羽并,俞锐敏,等高胆固醇血症患者筛查出家族载 脂蛋白B一100缺陷症中华心血管赢杂志,2000,28:449_451 11GraffneyD,HaffsMS,C~eronlMetsdlnfluen~of珊1~m]opldsm Q3405EdmutationA33718rLnlheapollpopretelnBonLDL re~ptorbindingAthemscle~is,1998,137:167—174 (收稿日期:2001.03—28] 【率文编辑:胨新石)