09大肠杆菌生长曲线的测定

09大肠杆菌生长曲线的测定 第九次课 大肠杆菌生长曲线的测定(2学时) 一、基本原理 大多数细菌的繁殖速率很快，在合适的条件下，一定时期的大肠杆菌细胞每20min分裂一次(将一定量的细菌转入新鲜液体培养基中，在适宜的条件下培养细胞要经历延迟期、对数期、稳定期和衰亡期四个阶段。以培养时间为横坐标，以细菌数日的对数或生长速率为纵坐标作图所绘制的曲线称为该细菌的生长曲线。不同的细菌在相同的培养条件下其生长曲线不同，同样的细菌在不同的培养条件下所绘制的生长曲线也不相同。测定细菌的生长曲线，了解其生长繁殖规律，这对人们根据不同的需要，有效地利用和控制细菌的生长具有重要意义。 本实验用分光光度计进行光电比浊测定不同培养时间细菌悬浮液的OD值，绘制生长曲线(也可以直接用试管或带有测定管的三角瓶测定“klett units”值的光度计。只要接种1支试管或1个带测定管的三角瓶，在不同的培养时间(横坐标)取样测定，以测得的klett units为纵坐标，便可很方便地绘制出细菌的生长曲线。如果需要，可根据公式1klett units=OD,0.002换算出所测菌悬液的OD值。 二、实验器材 1(菌种 大肠杆菌。 2(培养基 LB液体培养基70m1，分装2支大试管(5ml,支)，剩余60ml装入250ml的三角瓶( 3(仪器或其他用具 722型分光光度计，水浴振荡摇床，无菌试管，无菌吸管等。 三、实验步骤 1.标记 取11支无菌大试管，用记号笔分别标明培养时间，即0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16和20h。 2(接种 分别用5m1无菌吸管吸取2(5m1大肠杆菌过夜培养液(培养10—12h)转人盛有50m1 LB 液的三角瓶内，混合均匀后分别取5m1混合液放人上述标记的11支无菌大试管中。 3(培养 将已接种的试管置摇床37?振荡培养(振荡频率250r,min)，分别培养0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16和20h，将标有相应时间的试管取出，立即放冰箱 中贮存，最后一同比浊测定其光密度值。 4(比浊测定 用未接种的LB液体培养基作空白对照，选用600nm波长进行光电比浊测定。从早取出的培养液开始依次测定，对细胞密度大的培养液用LB液体培养基适当稀释后测定，使其光密度值在0.1,0.65之内(测定OD值前，将待测定的培养液振荡，使细胞均匀分布)。 本操作步骤也可用简便的方法代替: 1( 用l ml无菌吸管吸取0.25ml大肠杆菌过夜培养液转入盛有3—5ml LB液的试管中、混匀后将试管直接插入分光光度计的比色糟中，比色糟上方用自制的暗盒将试管及比色暗室全部罩上，形成一个大的暗环境，另以1支盛有LB液但没有接种的试管调零点，测定样品中培养0h的OD值(测定完毕后，取出试管置37?继续振荡培养。 2(分别在培养0、1.5、3、4、6、8、10、12、14，16和20h，取出培养物试管按上述方法测定OD值。该方法准确度高、操作简便。但须注意的是使用的2支试管要很于净，其透光程度愈接近，测定的准确度愈高。 四、实验 1 将测定的OD值填入下表 600 培养时间(h)对照 1 1.5 3 4 6 8 10 12 14 16 20 光密度值OD 600 2 绘出大肠杆菌的生长曲线 OD值600 培养时间/h 3 次生代谢产物的大量积累在哪个时期,根据细菌生长繁殖的规律，采取何种措 施可以使次生代谢产物积累更多,