柱层析分离纯化功能性红曲米中的有效成分

柱层析分离纯化功能性红曲米中的有效成分 ( 武汉工业学院 食品科学与工程学院，湖北 武汉 430023) 摘 要:为深入研究功能性红曲米浓缩物中有效成分的性质及其功能,采用硅胶柱层析法 依次用乙酸乙(酯: 石油醚(1 1,v??v) 、 乙酸乙酯、无水甲醇、蒸馏水进行洗脱) 对功能性红曲米浓缩物中的活性成分进行分离纯化,得到红曲黄色素、洛伐他汀粗品、醇溶 性红曲红色素、水溶性红曲红色素 4 种组分; 并采用紫外-可见扫描和高效液相色谱法对 4 种组分进行简单的性质结构表征。 关 键 词:功能性红曲色素; 柱层析法; 分离纯化; 高效液相色谱 中图分类号:O657, 7文献标识码:A文章编号:0254 ) 5071(2011)05 ) 0041 ) 04 Sepaaton and pufcaton ofeffectve components in functional Monascus pgment by coumn chomatogaphy ririiiiilrr * LI ingqi,CE unzhong,PAN e MHNYY ( College of FoodS cience and Engineering,Wuhan Polytechnic University,Wuhan 430023,China) Abstact: Bioactive coponents in red kojic rice concentrate was isolated and purified with silica gel colun chroatography, Elutes were in the sequence fo ethyl acetate: rmmm petroleum ether( 11,vv) ,ethyl acetate,anhydrous methanol and distilled water, Four components of Monascus yellow pigment,lovastatin crude,?? alcohol-soluble onascus red pigent and water-soluble onascus red pigent were obtained, Characteristics and structure of four coponents were deterined with -MmMmmmUVVIS spectrophotometry and high performance liquid chromatography, Key wods: functional onascus pigent; colun chroatography; isolation and purification; PLrMmmmHC 红曲米在东方食品中作为中药原料、食用色素的使用磷酸: 优级120 目,化学纯,甲醇: 色谱纯; 水: 三蒸水; 纯。 有上千年,但其化学成分不明确,色调不够鲜艳,溶解性不 主要 仪 器: 层 析 柱: 30mm × 800mm,45mm × 550mm, 好,产品品种比较单一,性能有待进一步提高,应用领域有 30 精密 p计 ,旋转蒸发仪,电热恒温水浴mm×350mm; H 锅, 待进一步拓展。中国已开发了一些以红曲为原料的药品和 循环水真空泵,低 速 离 心 机,电 子 天 平,索 氏 抽 提 器,美 国 Waters 公司高效液相色谱仪,超声波处理仪等。保健食品,但基本上是仿照国外已有的产品,对红曲活性成 29,-, 分及其功能作用的机理研究不够广泛和深入,在分子水平 2 方法与结果 ,1,2.1 功能性红曲米浓缩物中有效成分的分离纯化以及各组 上的作用机理研究更少。本研究旨在采用一种简单、快 分中 ovastatin 的含量检测的技术路线 L速、有效的、工业化的方法( 硅胶柱层析法) 对功能性红曲米 浓缩物中的有效成分进行分离纯化,建立对红曲色素中有 效成分的有效分离技术,制备较纯的洛伐他汀( Lovastatin) 以 及色调鲜艳、溶解性好的红曲色素纯组分,并对 4 种组分 进 行简单的结构表征。为开发安全性的纯色调红曲色素和 具 有保健功能的红曲色素提供理论依据和技术支撑,促进 红 曲产业健康发展。 1 材料与仪器 1. 1 材料 红曲米: 紫色红曲菌( Monascus purpureus ent) 固态W 2.2 硅胶柱层析分离纯化程序 发 酵制得; 武汉佳诚生物有限公司提供。 2.2 .1 硅胶的处理红曲米浓缩物: 采用 70 vol 乙醇在 60? 提取 2h,减压 % 取适量硅胶于 120?活化 30min 后放入干燥的烧杯中, 蒸馏浓缩制得。 加适量的溶剂溶解浸泡( 浸泡硅胶的溶剂与洗脱黄色组分 1.2 化学试剂及仪器 的溶剂相同浸泡) 20min。 化学试剂: 对照品: Lovastatin( Sigma 公 司) 标 准 品; 乙 2.2 .2 装柱醚、无水乙醇、盐酸、甲苯、苯、丙酮、乙酸乙酯、甲酸、三氯甲 先用洗液洗净硅胶柱,用清水清洗后再用蒸馏水清洗, 烷、石油醚、无水甲醇以上均为化学纯; 柱层析硅胶: 80 , 收稿日期:2011 ,0 1 ,1 1 基金项目:2008 年国家农转资金项目( 国科发农,2008,488 号) * 作者简介:李明起( 1983 , ) ,山东临沂人,在读硕士研究生,研究方向为生物质新能源新材料的研究与开发; 陈运中,教授,通讯作者。 干燥。在柱子地步铺一层玻璃棉或脱脂棉,轻轻塞紧,再在1,v /v) 洗脱,依次收集黄色级分和无色级分,通过 ( 1? UV- 脱脂棉上盖上一层厚约 0.5 c 的石英砂。采用湿法装柱,m VIS 扫描检测,洛伐他汀物质可能存在于无色级分。 先将层析柱垂直固定在铁架台上,加入适量的溶剂于层析 洛伐他汀的结晶纯化: 无色级分,40? ,真空蒸干,用正 柱内,排走柱子内的空气,然后把预先用溶剂浸泡好的活化 己烷荡洗,用热苯复溶,冷却结晶,过滤,弃掉滤液,得到白 硅胶搅匀,然后将悬浮液连续倒入层析柱中,待其自然沉降 色结晶。白色结晶用含水丙酮溶解后重结晶得到无色针状 至层析柱高的 1 /4 ,1 /3 时打开层析柱的下面端口,让溶剂 慢慢 晶体,取出无色针状晶体,低温干燥后待用。 流出,使柱子上端的悬浮液慢慢下降 到 需 要 的 高 度。 平 2. 3.3 醇溶性红曲红色素级分的纯化衡柱子 3h , 4h。 醇溶性红曲红色素级分离心,取清液低温浓缩至干,得 2.2 .3 上样 到红色粉末固体。 经过平衡的层析柱,先将硅胶上多余的溶剂放出,待平 2.3 .4 水溶性红曲红色素级分的纯化衡液的弯月面正好与硅胶床面相平时,仔细将待分离的提 水溶性红曲红色素级分经离心分离,取清液,真空浓缩 取浓缩后的样品液沿管壁加到固定相表面,尽量避免扰动 后待用。 固定相表面。 2.4 红曲色素各组分的 UV-VIS 2. 2.4 洗脱 2. 4. 1 红曲黄色素的 UV-VIS( 见图 有机溶剂洗脱,按照溶剂极性的大小来进行洗脱,先用 2)极性较弱的石油醚?乙酸乙酯 (1?1,v /v) 的混合溶液洗脱 黄色组分,待收集到的黄色组分颜色变淡至接近无色时改 用极性稍强的乙酸乙酯溶液洗脱浅色组分( 洛伐他丁) ,然 后用极性强的甲醇洗脱醇溶性红色素组分,最后用强极性 的水洗脱水溶性红色素组分,结果见图 1。 图 2 红曲黄色素 UV-VIS 吸收峰 Figure 2, UV-VIS absorption peak of yellow pigment component 扫描波长 300nm ,80 0nm,溶剂为正己烷,结果见图 2, 在 300nm, 80 0nm范围 内扫描黄色素级分,红曲黄色素,在 图 1 石油醚乙酸乙酯洗脱黄色素组分(A)、乙酸乙酯洗脱浅色素? 可见光的特征吸收峰为 366.0 nm、377.9 nm、388nm。在此吸 组 分(B)、无水甲醇洗脱醇溶性红色素组分(C)、蒸馏水洗脱水溶性收峰处,测得红曲黄色素的色价为 9200U /g。 红色素组分(D) 2.4 . 2 浅色素级分的 -ISUVVFigure 1, Yellow pigment component eluted by petroleum ether: ethyl acetate(A)，Light color pigment component eluted by ethyl acetate(B)，Alcohol-solubler ed pigment component eluted by methanol(C)，Water-soluble red pigment component e luted by distilled water(D) 2. 2.5 收集 按不同颜色收集各组分。 2.3 4 种色素级分的纯化 2.3 .1 黄色素级分的纯化 黄色素级分低温真空蒸干,氯仿洗涤,正己烷复溶,低 温条件下结晶,得到黄色结晶,得率约为 3. 78 。用于进一 % 图 3 浅色级分 UV-VIS 吸收峰 Figure 3, UV-VIS absorption peak of light color pigment component 步分析。 2.3 .2 浅色级分的分离纯化白色结晶用正己烷荡洗,用热苯复溶,冷却后得到白色 中性氧化铝柱层析分离: 中性氧化铝 20g于 120?活 化结晶,过滤,弃掉滤液。用含水丙酮溶解后重结晶得到无色 1h,用正己烷浸泡,排气后,小心装柱,平衡 3h,待用。由硅 针状晶体,取出无色针状晶体,低温干燥后乙醇复溶在波长 胶柱层析分离收集的浅色级分,经 40? ,真空蒸干,乙酸乙 200nm ,60 0nm,溶剂为乙醇水 =6 4( vv) 条??? 。 2.4 .3 醇溶性红曲红色素的 UV-VIS mL。分离心分离,分别量取各个组分各 10 扫描波长 300n , 800n,溶 剂 为 乙 醇,醇 溶 性 红 曲 mm2.5 .3 曲线的制作 红色素在 506. 1n,516. 0n 处有特征吸收。其扫描结果 配制浓度为 2.0 g/ L、10g/ L、50g/ L、100g /L、mmmmmmμμμμ 见图 4。在此吸收峰处,测得醇溶性红曲红色素的色价为 300g/ 洛伐他丁标准溶液,在给定的仪器条件下进行 μmL 液相色谱分析,以峰高对浓度作标准曲线。分别精确量取 11000U /g。 洛伐他丁标准品不同浓度溶液 20L,注 入 高 效 液 相 色 谱 μ 仪,记录峰面积、峰高、出峰时间。以峰高对浓度作出标准 曲线见图 6。洛伐他丁标准品的液相色谱图见图 7。 图 4 醇溶性红曲红色素 UV-VIS 吸收峰 Figure 4, UV-VIS absorption peak of alcohol-soluble re d pigment component 2.4 .4 水溶性红曲红色素的 UV-VIS 扫描波长 300nm, 80 0nm,溶剂为水,扫描结果见图 5, 水溶性红曲红色素级分的特征吸收为 486.0 n。此吸收峰 m 处水溶性红曲红色素的色价为 4200U/ g。 2.5 .4 红曲色素中各组分中洛伐他丁的含量测定 红曲黄色素中洛伐他丁的含量检测: 经检测红曲黄色 5 水溶性红曲红色素 UV-VIS 图吸收峰 素中洛伐他丁的含量为 0.8 9mg /kg,其液相色谱图见图 8。 Figure 5, UV-VIS absorption peak of water-soluble red pigment component 2. 5 洛伐他丁含量的测定 2.5 .1 色谱分析条件 色谱柱,C18 柱( 250mm ×4 .6 0mm) ; 流动相,甲 醇水? ( 928,vv) ,加少量磷酸作改善剂; 检测波长,?? 238nm; 流 速,1.0 mL /min; 柱温为室温。 图 8 红曲黄色素的高效液相色谱图 2.5 .2 实验条件选择 Figure 8, HPLC chromatogram oyfe llow pigment 检测波长: 紫外吸收光谱测定表明,洛伐他汀在波长 238nm处吸收峰最明显 ,故检测波长选用 238nm。 230nm、238nm、246nm处 有 3 个 特 征 紫 外 吸 收。由 于 波 红曲浅色级分的液相色谱图: 经检测和计算红曲浅色 组分的极性,否则会由于洗脱剂在固定相上被吸附,迫使样 级分浅色级分中洛伐他丁的含量达到 60%以 上,液相色谱 品一直保留在流动相中,在这种情况下,组分在柱中移动的 图见图 9。 非常快,很少有机会建立起分离所要达到的化学平衡,影响 分离效果。另外,所选择的洗脱剂必须能够将样品中各组 分溶解,但不能同被分离组分竞争与固定相的吸附。如果 被分离的样品不溶于洗脱剂,那么各组分可能会被牢牢的 吸附在固定相上,而不随流动相移动或移动很慢。根据以 上原则和溶剂极性的大小,洗脱剂可以选择不同的洗脱方 式,3 种不同的洗脱方式见附表。 附表 硅胶柱层析的 3 种不同的洗脱方式 Attached table, Three elution methods of silica gel column chromatog- raphy 图 9 浅色素的高效液相色谱图 黄色组 浅色组 醇溶性红色组 水溶性红色组 Figure 9, HPLC chromatogram olifgh t color pigment 洗脱方式 分洗脱剂 分洗脱剂 分洗脱剂 分洗脱剂 无水乙醇: 冰醋酸 醇溶性红曲红色素中洛伐他丁含量检测: 经检测醇溶 方式一 乙酸乙酯 无水乙醇 蒸馏水 ( 101,?性红曲红色素中洛伐他丁的含量约为 0.1 6mg/ kg,其液相 vv)? 方式二 正乙烷 乙酸乙酯 蒸馏水 色谱图见图 10。 80甲醇 %乙醇乙酯: 石油醚 方式三 乙醇乙酯 无水甲醇 蒸馏水 ( 11,? vv)? 根据实验效果和从经济安全的角度考虑,选择方式 3 进行洗脱,即黄色组分用乙酸乙酯石油醚 (11,?? vv) 洗 脱,浅色组分用乙酸乙酯进行洗脱,醇溶性红? 色组分用无水 甲醇洗脱,水溶性红色组分用蒸馏水洗脱。 2.6 .2 层析柱的影响 实验采用 30mm × 800mm( 内径,长度) ,45mm × 550mm ( 内径,长度)2 种不同规格的柱子进行对比性实验, 图 10 醇溶性红色素的高效液相色谱图 结果发 现 30mm × 800mm( 内径,长度)规格的柱子更容 易Figure 10, HPLC chromatogram of alcohol-solublere d pigment 将红曲色 素各组分的颜色区分开来,不容易发生沉降串色 水溶性红曲色素中洛伐他丁的含量检测: 经检测水溶 等,而且洗 脱色素组分时也比较均匀,而 45mm × 性红曲色素中洛伐他丁的含量为 0.0 6mg/ kg,其液相色谱 550mm( 内径,长度) 规格的柱子容易发生串色,不易区分 图见图 11。 各种组分。因此实验 采用 30mm × 800mm( 内径,长度)规 格的柱子进行分离。 2.6 .3 流速的影响 在洗脱过程中,样品在柱内的下移速度太快会造成各 种颜色的色素串色发生沉降现象,但是也不能太慢( 甚至过 夜) ,因为吸附表面活性较大,时间太长会造成某些成分被 破坏,使色谱扩散,影响分离效果。通常洗脱液流出速度控 制在 5 , 10 滴 /min,若洗脱液下移速度太慢,可适当加压或 用水泵减压。 图 11 水醇溶性红色素的高效液相色谱图3 结论 Figure 11, HPLC chromatogram owaf ter alcohol-soluble red pigment 硅胶柱层析分离技术可以快速、有效的将红曲米浓缩 物中的红曲黄色素、醇溶性红曲红色素、洛伐他丁以及水溶 2. 6 讨论 性红曲红色素 4 种组分分离开来,这样可以填补长久以来 2.6 .1 洗脱剂的影响 食用色素化学成分不明确,色调不够鲜艳,溶解性不好,产 品品种比较单一等的缺陷。使红曲色素的种类更加广泛, 在硅胶柱层析分离中,洗脱剂的选择是一个重要的因