单增李斯特菌阳性样品细菌存活检测及VIDAS检测LMO效率

单增李斯特菌阳性样品细菌存活及VIDAS检测LMO效率 单增李斯特菌阳性样品细菌存活检测及 VIDAS检测LMO效率 中国卫生检验杂志2008年3月第l8卷第3期ChineseJournalofHealthLaboratoryTechnology.Mar2008;Vol18No3 【微生物检测】 单增李斯特菌阳性样品细菌存活检测及VIDAS检测LM0效率 陈慧燕,洪隽,李毅,洪程基 (1.浙江省温州市疾病预防控制中心,浙江温州325027;2.浙江大学原子核农业研究所,杭州310029) [摘要]目的:观察单增李斯特菌(Lmonocytohenes以下简称LMO)存活率,探讨LMO检测的方法.方法:用国标GB/ T4789—30—2003与MiniVIDAS平行检测.结果:10份阳性样品置冰箱(0?以下)存放12个月后,用国标GB/ T4789—30—2003检出8株菌株,检出率为80%,用MiniVIDAS法LMO阳性3份.结论:10件阳性样品存活率(国标法 检出率)为80%,而MiniVIDAS法阳性率仅为30%. [关键词】IAIO;存活率;MiniVIDAS;检测效率 [中图分类号]R378.994[文献标识码]A[文章编号]1004—8685(2008)03—0466—02 TestofsurvivalbacteriainL.monocytohenespositivesamplesandevaluationofVIDAS testingefficientcy ChenHui-yan,HongJun,LiYi,HongCheng-j~ (I.WenzhouCenterforDiseaseControlandPrevention,Wenzhou325027,China;2.Institute ofNuclearAgricultureSciences, ZhejiangUniversity,Hangzhou310029,China) [Abstract]Objective:ToobservethesurvivalrateofLmonocytohenes(I朋0f0rshort)anddiscussLM0testing methods.Methods:ParalleltestwasconductedbasedonNationalStandardGB/T4789—30 —20o3lJandMiniVIDASJ.Re? stilts:Afterthe10positivesampleshadbeenstoredinrefrigerator(below0?)foroneyear,8strainsweredetectedbyNational StandardGB/T4789—30—20o3,anddetectionrateWas80%.ThreepositiveLMOweredetectedbyMiniVIDAS.Concl usion: Thesurvivalrateoftlle10positivesamples(byNationalStandardMethod)iS80%.I1ledetect ionratebyNationalS~dard methodis80%.buttllepositiveratebyMiniVIDASmethodisonly30%. [Keywords]LMO;Survivalrate;MiniVIDAS;Testingefficiency LMO广泛存在于自然界中.不易被冻融,能耐受较高的渗 透压,在土壤,地表水,污水,废水,植物,青储饲料,烂菜中均 有该菌存在,所以动物很容易食人该菌,并通过口腔一粪便的 途径进行传播.据报道,健康人粪便中LMO的携带率为 0.6%,16%,有70%的人可短期带菌,4%,8%的水产品, 5%,10%的奶及其产品,30%以上的肉制品及15%以上的家 禽均被该菌污染.人主要通过食人软奶酪,未充分加热的鸡 肉,未再次加热的热狗,鲜牛奶,巴氏消毒奶,冰激凌,生牛排, 羊排,卷心菜色拉,芹菜,西红柿,法式馅饼,冻猪舌等而感染, 约占85%,9o%的病例是由被污染的食品引起的.该菌在 4~C的环境中仍可生长繁殖,是冷藏食品威胁人类健康的主要 病原菌之一.作者将2005年检测L|M0阳性样品10件冷冻 (4?以下)存放12个月后,采用国标法…与MiniVIDAS法进 行检测,评估其存活率及MiniVIDAS对LMO检测效率. 1材料与方法 1.1菌株 菌株LMO(CMCC54002),金黄色葡萄球菌(ATCC 6538),马红球菌均由浙江省CDC提供. 【作者简介]陈慧燕(1957一),女,副主任技师,主要从事微生物 研究. 1.2主要培养基 李氏增菌培养液(LB1,LB2),TSI,SIM半固体等由上海市 CDC提供,李斯特显色培养基等由浙江省CDC提供,API LISTERIA生化试剂条,VIDASLIS试剂条等为法国生物梅里 埃公司提供. 1.3主要仪器 全自动快速免疫检测仪(MiniVIDAS),ATB细菌生化鉴定 仪为法国梅里埃公司产品,恒温培养箱,生物显微镜(油镜)等. 1.4样品来源 2005年食品污染物调查中LM0阳性样品1O件,冷冻于 冰箱(4?以下). 1.5检验方法 1.5.1国标法按GB/T4789—30—2003…进行李氏增菌培 养液(LB1,LW2)两次增菌后,将LB2培养物转种到李斯特显 色培养基平板,挑取灰蓝或蓝色带晕小菌落做镜检,动力,生 化,cAMP试验,溶血试验及APILISTERIA生化试剂条确认. 1.5.2MiniVIDAS法 1.5.21VIDASLIS【2]:第一次增菌取25g(mI)样品加于225ml LB1增菌培养液中,3O?24h培养,第二次增菌取第一次增菌培 养液Q1ml加入lOmlLff2增菌培养液中,3O?24h培养,进行 MiniVIDAS法检测.按VIDAS机作业指导,取500加入VI_ DASLIS试剂条上机检测,同时用阳性菌株进行对照. 1.5.2.2菌落计数及上机:标准菌株LMO(CMCC54002)接种 中国卫生检验杂志2008年3月第18卷第3期 Chine~J0umal0fHealmLabomto~rrechn0l0gy,Mar2008;VdI8?03467 血平板上35?48h培养,挑选单个菌落配制成1麦氏度的菌 液(用麦氏比浊仪比浊),将1麦氏度的菌液按以下0.5,0.05, 0.025,0.01,0.005浓度稀释,按VIDAS机作业指导书,取 500加入VIDASHS试剂条上机检测.同时将1麦氏度的 菌液按10倍递增稀释,分别取相应的稀释度各0.1|rIl加入到 李斯特显色培养基,每一稀释度2只平皿,用L型玻棒推匀, 置35?48h培养,计数菌落数. 2结果 2.1LMO阳性率 10份阳性样品,国标法检出8株LM0,检出率为80%, MiniVIDAS法阳性率为30%,见表1. 表1国标法与MiniVII)AS法检测结果的比较 P:表示阳性;N.表示阴性 2.2茵落计数结果 1麦氏度菌液经L玻棒涂布培养结果相当于4.5×10. ef~ml. 2.3不同浓度茵液MiniVIDAS测定结果 将1麦氏度稀释不同浓度菌液经MiniVIDA~次测定平 均结果见表2. 表2不同浓度菌液MiniVII)AS测定结果 P:表示阳性;N:表示阴性 3讨论 3.1LM0在冷冻条件的存活 10份阳性样品置冰箱(4?以下)存放12个月后,仍有8 份样品检出LM0,存活率为80%,说明冷冻不能杀死它.冷藏 即食食品可能携带李斯特菌的原因,首先,这类食品一般在冰 箱中存放的时间较长,给李斯特菌的繁殖提供了条件.同时, 这类食品在加工过程中易遭受二次污染,在零售店和家庭存 放时也容易受到交叉感染.其次,李斯特菌对生存环境的适 应性比较强,能在冰箱冷藏室内生存较长时间,而且比较耐 盐,能在含6.5%氯化钠的肉汤中生长繁殖,在10%甚至更高 浓度的氯化钠溶液内仍可存活甚至繁殖.2000年李小春等曾 对温州市的速冻食品进行了李斯特菌检测,在21种速冻食品 中检出LMO3株J.众所周知李斯特菌,尤其食品在冷藏过 程中潜在着增菌的危险,本实验也证实这一点. 3.2MiniVIDAS法 检测结果阳性率并不理想,VIDAS法对LMO检出率不理 想.10份阳性样品MiniVIDAS法阳性率仅为30%.即使是 纯培养也需要较大的细菌量,即10cfu/|rIl细菌量也没有达到 MiniVIDAS的响应值.作者仅对45件样品进行国标法,改良 方法及MiniVIDAS法同时进行检测,结果分别检出【朋O7份 阳性,9份阳性及0份阳性J.与本次试验基本相近.Mini VIDAS法作为LMO的筛选法有待进一步探讨. 在LM0的日常检验中,传统分离方法不仅耗费时间长, 检验步骤繁琐,而且特异性不强,这就增加了检验的难度. 1989年Bessesea等运用扩增李斯特菌溶血素基因中386bp 的PCR方法检测单核细胞增生李斯特菌,DNA检测量低于 25ng,即少于1000个菌体,特异性强,能检测出50株不同的 单核李斯特菌,而不与12株非单核李斯特菌和12种非李斯特 菌属的细菌发生反应.荧光定量PCR既有传统PCR的特异 性好,灵敏度高,时间短的优点,又可以结合荧光探针,在荧 光PCR仪上显示结果,方便快捷,可以在1—2h内得出初筛 结果,为实验室检验带来极大的方便. 为此,我们应努力探讨对LMO检出特异性强,检出率更 高且简便易行的检测方法. [参考文献] [1]GB/~789.30—20o3.食品卫生检验方法微生物分册[s]. [2]上海祥和科学技术有限公司.生物梅里埃李斯特菌属操作. [3]李小春,陈慧燕,金茜.温州市速冻食品李斯特菌检测[J].中国 卫生检验杂志,1999,9(1):49—5O. [4]陈慧燕,洪程基,李毅,等.食品中李斯特菌检测方法探讨及药敏 结果分析[J].中国热带医学杂志,20o6,6(5):770—772. [5]张蓓,沈立松.实时荧光定量PcR的研究进展及其应用[J].国外 医学一生物化学与检验分册,20o3,24(6):327—328. (收稿日期:2007—11—28)