五味子醇提药渣中粗多糖的提取及生物活性的研究（可编辑）

五味子醇提药渣中粗多糖的提取及生物活性的研究（可编辑） 五味子醇提药渣中粗多糖的提取及生物活性的研究 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定, 同意学位保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版, 允许论文被查阅和借阅。本人授权江苏大学可以将本学位论文的全部 内容或部分内容编入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密囹,在年解密后适用本授权书。 本学位论文属于 不保密口。 学位论文作者签名:障竹 指导教师签名茅雩歹巩 / 夕?年石月 妒释独创性声明 本人郑重声明:所呈交的学位论文,是本人在导师的指导下, 独立进行研究工作所取得的成果。除文中已注明引用的内容以外, 本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。 对本文的研究做出重要贡献的个人和集体,均已在文中以明确方式 标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名:纸徒中 日期:沁年‖月,五味子醇提药渣中粗多糖的提取及生物活性研究 ?姓 年月摘 要 摘 要 五味子为木兰科五味子 .的干燥成熟果实, 是我国传统中草药,具有保肝护肝、抗肿瘤、抗氧化和保护中枢神经系统等功效。 五味子中含有木脂素、多糖、挥发油等多种活性成分,但目前对五味子的利用主 要是木脂素,工业生产中醇提木脂素后的药渣一般作为废物丢弃,造成药用资源 的浪费。五味子多糖具有补肾养心、增强人体免疫等多方面的药理作用,但有关 五味子醇提药渣中多糖的研究未见报道。本文以五味子醇提药渣为原料,研究五 味子醇提药渣中粗多糖的提取工艺、免疫活性、五味子粗多糖和水提物的抗氧化 及抗肿瘤活性,为五味子多糖保健食品及药品的开发提供基础,为五味子药渣资 源化高效利用提供新。 主要研究内容和结果如下: 以五味子多糖的得率为考虑指标,在单因素试验的基础上,进行三因 素三水平正交试验,结果表明,各因素对多糖得率影响的先后次序为:温度料 液比时间,五味子多糖提取的最佳工艺条件为:料液比:,温度?,提 取时间,提取次数次,倍量乙醇醇沉,醇沉时间。此条件下,五味子 粗多糖的提取率为.%,得率为.“%,粗多糖中多糖含量为.%。五味 子水提物的得率为.%,水提物中多糖含量为.%。 研究了五味子粗多糖的体内免疫活性。结果表明,五味子粗多糖具有 良好的免疫增强作用。五味子未脱蛋白粗多糖在/和/剂量下, 能明显增强免疫抑制小鼠的腹腔巨噬细胞的吞噬功能.、.;在 /、/剂量下,能显著提高免疫抑制小鼠的血清溶血素水平.; 在/剂量下,能增加免疫抑制小鼠的胸腺指数和脾脏指数.、 .;在/剂量下,能增加免疫抑制小鼠的脾脏指数.。五 味子脱蛋白粗多糖在 /和/剂量下,均能极显著增强免疫抑制 小鼠的腹腔巨噬细胞的吞噬功能.:在 /、/剂量下, 能显著提高免疫抑制小鼠的血清溶血素水平.;在/剂量下,能 。 显著增加免疫抑鼠的脾脏指数.。 采用法、水杨酸法和邻苯三酚自氧化法研究了五味子粗多糖和江苏大学硕士 学位论文 五味子水提物的体外清除自由基活性。结果表明,五味子粗多糖和水提物都 具有 良好的清除自由基活性,水提物清除自由基能力优于粗多糖。五味子粗多糖 和水 提物清除自由基的值分别为./和./,当浓度为 /时,清除率分别达.%和.%;粗多糖和水提物清除羟自由基 的值分别为./、./,当浓度为 /时,清除率分别达 .%和.%;粗多糖清除超氧自由基的值为./,当浓度为 /, /时,清除率达.%;水提物清除超氧自由基的值为. 当浓度为/时,清除率达.%。 采用烘箱强化氧化法研究了五味子粗多糖和水提物的油脂抗氧化活 性。结果表明,五味子粗多糖和水提物均具有良好的油脂抗氧化活性,水提物 的 油脂抗氧化能力优于粗多糖。与空白组相比,.%粗多糖组和.%水提物组 对猪油过氧化的抑制率分别达.%和.%;与空白组相比,.%粗多糖 组和.%水提物组对大豆油过氧化的抑制率分别达到.%和.%。 研究了五味子粗多糖和水提物的脂质抗氧化活性。结果表明,五味子 粗多糖和水提物在体外均具有良好的脂质抗氧化能力,能有效抑制诱导的 红细胞溶血及肝匀浆中的生成,且呈一定的量效关系。五味子粗多糖和水 提物抑制小鼠红细胞氧化溶血的值分别为. /和. /;粗 /,当浓度 多糖和水提物抑制生成的值分别为./、. 为/时,抑制率分别达到.%和.%。 采用导致小鼠“阳虚”,建立小鼠衰老模型,研究了五味子粗多 糖和水提物的体内抗氧化活性。结果表明,五味子粗多糖能够显著提高小鼠 的抗 氧化能力,水提物也有一定抗氧化能力。与衰老组相比,粗多糖在 /和 /剂量下,均能提高小鼠血清活性.,在/剂量下, 能显著提高肝组织活性.。水提物在 /和/剂量 下,血清和肝组织含量与衰老组相比无明显差异。粗多糖在 /剂 量下,能显著抑制血清中的生成.、极显著抑制肝组织中的 生成.;在 /剂量下,能极显著抑制血清中的生成 .、显著抑制肝组织中的生成.。水提物在/剂 量下,能抑制血清中的生成.、显著抑制肝组织中的生成 ?摘 要 .? 采用比色法研究了五味子粗多糖和水提物的体外抗肿瘤细胞活 性。结果表明,五味子粗多糖和水提物对人肝癌细胞.、人肺癌细胞 和人食管癌细胞都有一定的抑制作用,但抑制率均未超过 %,没有明显的细胞毒性。 关键词:五味子醇提药渣;粗多糖;水提物;提取工艺;免疫活性;抗氧化活性; 体外抑瘤活性 苏大学硕士学位论文 ,, . , , , . , ,也. .? , .. : ., ,.坨 ?, .圮 : ?, ,. , , .%,.“% .%,..% .%,. . . : / /./、/, . /, .;. .. . ? ., :一’./. .% . % . ./ ./ ,;.% .% /, ./ ,; ./. % /, ?; ./ /, ..% ./.: . ? ’. .%一 .% , . % .%,、? ; .%? .% ,.% .%,谢 . . . :一 ?. ..、 / ./ ; /.% , .%,; ./ ./,. .. :一 . ; / /, .. /,. ; / /’ 、砸, ,、, ; / /,. ; /, . . . . .. :.’ % , 一、 ’ . : , , ,伽 ?目录 目 录 第一章绪论.多糖的研究进展 ..多糖的提取、分离纯化和含量测定?.. ..多糖的生物活性.. ..多糖类药物及保健品的开发利用现状..:??。 .五味子多糖的研究进展??.. ..五味子的研究概况??. ..五味子多糖的研究概况? .研究的目的和意义?. .本论文的主要研究内容?.. 参考文献第二章五味子醇提药渣中多糖的提取工艺研究.前言?. .材料与仪器..材料与试剂?一 ..主要仪器 .实验方法??. ..多糖的提取流程 ..多糖含量的测定方法? ..单因素试验??.. ..正交试验. ..干燥方式对多糖的影响 ..五味子粗多糖的理化性质检测 ..五味子水提物的提取及多糖含量测定??.. .结果和讨论?.. ..曲线的确定 ..单因素对多糖提取率的影响? 江苏大学硕士论文?.:: 的影响??。 理化性质..五味子水提物的多糖含量.本章小结参考文献??。 第三章五味子醇提药渣粗多糖的免疫活性研究 .前言?. .材料与仪器? ..材料与试剂?. ..主要仪器.实验方法?。 ..五味子药渣脱蛋白粗多糖的制备?.. ..小鼠腹腔巨噬细胞吞噬试验? ..小鼠血清溶血素抗体生成试验??。 ..对小鼠免疫器官脏器系数的影响试验??。 .结果与讨论一 ..小鼠腹腔巨噬细胞吞噬试验 ..小鼠血清溶血素抗体生成试验..对小鼠免疫器官脏器系数的影响? .本章小结??. 参考文献第四章五昧子醇提药渣粗多糖的抗氧化活性研究? .前言?. .仪器与材料?. ..材料与试剂?.. ..主要仪器??.. .实验方法..体外抗氧化试验??.. 目录 ..体内抗氧化试验. .结果与讨论?.. ..体外抗氧化活性 ..体内抗氧化活性 .本章小结??.. 参考文献??. 第五章五味子醇提药渣粗多糖的体外抗肿瘤活性研究.前言?. .材料与仪器?.. ..材料与试剂..主要仪器 .实验方法??.. .. 法的实验原理?. ..体外抗肿瘤试验 .结果与讨论..不同浓度样品对癌细胞抑制作用的影响..作用时间对?抑制 作用的影响??一 .本章小结??.. 参考文献 第六章与展望.主要结论 .工作展望??。 致谢?. 攻读硕士学位期间发表论文目录??. 第一章绪论 第一章绪论 .多糖的研究进展 多糖又称多聚糖,由单糖聚合成聚合度大于的极性大分 子,分子量为数万至数百万,是构成生命活动的四大基本物质之一,与生命的多 种生理功能密切相关。多糖是自然界含量最丰富的生物聚合物,几乎存在于所有 生物体中【】。多糖与免疫功能的调节、细胞与细胞的识别、细胞间物质的运输、 癌症的诊断与治疗等,有着密切的关系,具有能量储存、结构支持、防御功能和 抗原决定性等多方面的生物功能【】。最近又提出了细胞表面糖分子参与细胞一 细胞特异性识别的假说,发现多糖能控制细胞的分裂和分化、调节细胞的生长和 衰老,其糖链在分子生物学中具有决定性作用。由于组成多糖的单糖其种类繁多 目前已知的单糖有多种,而且糖基可在多个羟基上以两种可能的键型相 互连接氨基酸和甘氨酸只有一种连接方式,因此它能以最小的结构单元承载 最大的生物信息量。此外,多糖在食品工业、发酵工业及石油工业上也有着广泛 的应用。所以近年来多糖成为天然药物研究的一个热点,在多糖资源的开发、多 糖结构的和多糖药理作用的研究等方面做了大量的工作。 ..多糖的提取、分离纯化和含量测定 ...多糖的提取 大多数多糖存在于细胞壁内称胞内多糖,要使胞内多糖容易释放出来, 多糖提取的第一步是必须将动植物体粉碎。近年来采用超声波气流粉碎技术将动 植物或真菌孢子的细胞壁破裂,大大提高多糖的提取效率。由于动植物的细胞壁 大多由脂质包围,所以用机械粉碎后还必须脱脂,常用索氏提取器,乙醇回流~ 。多糖的提取方法很多,常用以下三种方法【.】: 热水提取法 这是目前多糖提取中最常用方法。它是根据大多数多糖在热水中溶解度较大 的性质进行提取,这种方法对多糖破坏最小。通常用沸水提取。提取液若必须采用离心法去残渣。有的 多糖粘度大,可在热水中加入%~%的尿素溶液,使多糖的构型改变这种 改变是可逆的,从而降低粘度,增加其在热水中的溶解度。 稀碱水溶液提取法 部分酸性多糖,或分子量较大的多糖,在热水中溶解度不大,但在稀碱溶液 中溶解度较大,所以常用%~%的溶液或溶液提取。用稀碱 溶液提取时,提取温度必须保持在?以下,否则多糖容易降解: 酶解法 将已粉碎的植物悬浮于水中,根据复合酶作用的最适条件,调节至最适温度 通常是?及最适通常是..,然后加入%~%复合酶, 反应,滤除残渣,滤液即为多糖提取液。该法已在多糖保健品如香菇多糖 保健品的制备中采用。但大多采用热水提取法及酶法相结合的办法,即先用热 水提取,然后残渣再用酶法提取,这样可大大提高多糖收率。 ...多糖的分离纯化 采用上述方法获得的多糖提取液都含有许多杂质,主要是无机盐、单糖、寡 糖、低分子量的非极性物质及高分子量的有机杂质如蛋白质、木质素。对于 无机盐、单糖、寡糖和低分子量的非极性物质可用透析法除去,透析时间一般不 大于,否则透析袋在无防腐剂存在下易长霉。对于带有电荷的阴离子及阳离 子即无机盐还可用离子交换树脂法去除。如大量的工业化去除离子,则可采 用离子交换树脂的混合床去除阴、阳离子【】。除蛋白质的方法传统上有 法,三氯乙酸法及酶法,植物多糖多采用三氯乙酸法,其效率高,多糖损失率低 【刀。植物多糖可能会有酚类化合物而颜色较深,需对其进行脱色,常用的脱色方 法有:离子交换法、氧化法、金属络合物法和吸附法纤维素、硅藻土、活性炭 等】。 纯化是将多糖混合物分离为单一的多糖组分。多糖的分离纯化方法除经典的 分离沉淀外,还有季胺盐沉淀法、金属络合物法、盐析法和制备性区域电泳法等 嗍。目前,植物多糖的分离纯化在细分阶段一般常用凝胶色谱法和离子交换色谱 法。色谱分离纯化多糖主要依据被分离多糖组分间的理化性质差异及其在固相载 体和流动相之间分布和流动速度的差异而达到分离目的。离子交换色谱法是通过 第一章绪论 载体表面带电基团与样品离子和淋洗离子进行可逆交换、离子偶极作用和离子吸 附实现色谱分离的【】。 ...多糖含量测定 多糖含量的测定常采用比色法或滴定法。比色法的使用历史悠久,世纪 年代就先后报道了咔唑.硫酸法、葸酮.硫酸法和苯酚.硫酸法测定多糖含 量,目前使用最广泛的是后两种。其原理是根据多糖在硫酸的作用下水解成单糖 分子,并迅速脱水生成糠醛衍生物,再将其与苯酚或蒽酮缩合成有色化合物,在 适当的波长和一定的浓度范围内,吸收值与糖浓度呈线性关系,从而可通过比色 测定其含量。钟方晓等【】研究发现葸酮.硫酸法测定多糖含量时稳定性较差,线 性关系不理想,所测数据差异较大,而苯酚.硫酸法测定多糖含量时稳定性较 好, 吸收度在..之间线性关系良好,为较理想的多糖含量测定方法。 滴定法主要是采用还原滴定法,此法是多糖水解成还原性的单糖后, 以次甲基兰做指示剂,用标定过的碱性酒石酸酮溶液直接进行还原滴定,根据样 液消耗的体积计算其含量。本法快速简便,不需精密仪器,对所有多糖均适用。 但此法需在沸腾状态下滴定,温度和滴定速度对结果影响较大,且此法是一种还 原滴定法,不能排除还原糖的干扰。后来又有报道采用间接碘量法测定多糖含量, 可消除还原性杂质对测定结果的干扰【。 近年来,高效液相色谱法越来越多地用于测定植物中的多糖,它 分析速度更快,可以直接进样不必制备成衍生物,而且有较高的分辨率‘。此 外还有气相色谱法】、薄层扫描法【】、高效毛细管电泳法 【”】等,可根据药材所含多糖及其化学成分的性质进行选择。 ..多糖的生物活性 二十世纪六十年代以前,多糖多作为动植物细胞的支持物或能量储存物而被 研究。近三十年来,由于分子生物学的发展,人们逐渐认识到糖及其复合物分子 具有极其重要的生物功能,它与免疫功能的调节、细胞与细胞的识别、细胞物质 的运输以及癌症的诊断与治疗都有着密切的关系,并且多糖作为药物其毒性极 小。多糖的生物活性研究目前主要集中在以下几个方面:性。大多数多糖的抗肿瘤活性 是通过激活机体的免疫系统而起作用,不是直接杀死肿瘤细胞。灰树花多糖【、 云芝多糖【、银耳多糖【、茯苓多糖、人参多糖【明以及羊栖菜多糖【】等都具 有显著的免疫增强作用和抗肿瘤作用。 ...降血糖活性 降血糖功能也是植物多糖的重要功能之一。研究发现有的多糖虽然不会增加 机体中胰岛素的分泌,但它能显著提高肝脏中葡糖激酶、己糖激酶和磷酸葡 萄糖脱氢酶的活性,降低血浆甘油三酯及胆固醇的水平【。部分多糖是.受体 激动剂,通过第二信使将信息传递至线粒体,从而使糖的氧化利用加速,引起降 血糖作用【。目前发现具有降血糖作用的多糖很多,如从植物羽叶白头树中获 得的多糖口;从沙篙籽中获得的多糖【】;从小豆中获得的多糖【】:从高等真菌 中获得的多糖【】等。 ... 抗氧化、抗衰老活性 通常情况下,多糖的抗衰老作用与提高免疫功能、清除体内氧自由基及抗脂 质过氧化密切相关。李晓莉等【研究发现,枸杞、人参、银杏叶、天麻水提液 均可降低小白鼠体为的含量。沙棘多糖‘、茶叶多糖四等均具有清除超氧 自由基和羟自由基的作用。菟丝子多糖有抗衰老作用,其机制可能与提高免疫功 能,清除氧自由基及抗脂质过氧化有关】。 ...抗辐射活性 研究表明,多糖还具有一定的抗辐射作用,它主要通过修复受损的造血组织, 增强机体的免疫功能和清除自由基等作用来有效地减轻辐射对机体的的伤害。黑 木耳多糖在抗辐射方面可以通过修复造血组织,增加白细胞数目,明显提高受 射线照射小鼠的存活率和存活时间【。南沙参多糖可以明显地恢复受射线照 射后大鼠血清产生抗体的能力,增强免疫力,起到很好的抗辐射作用【。螺旋 藻多糖、芦荟多糖都可提高受射线致死剂量照射小鼠内的存活率,促进小鼠 造血干细胞和粒单系祖母细胞的增殖和分化,促进受到辐射损伤的小鼠造血系统 的恢复,增强小鼠的抗辐射能力‘’。 ...抗炎活性 第一章绪论 脆弱类杆菌的夹膜多糖、具有显著的生物活性,在体外具有细 胞增殖活性,在体内具有抗脓肿形成作用。还具有促有丝分裂能力【。微 生物来源的多糖对小鼠叉菜胶关节肿胀有明显抑制作用,对佐剂型关节炎、 多发性关节炎有明显预防作用,它是通过抑制免疫细胞因子.来达到消炎作 用【。知母多糖能显著抑制角叉菜胶致大鼠足趾肿胀及大鼠棉球性肉芽肿增 生 动物模型的炎症反应,其抗炎作用通过肾上腺素分泌较高水平的糖皮质激素 及抑 制炎症组织的合成或释放实删。 此外,多糖还具有调节性功划、减肥删及抑菌【等多种生物活性。 ..多糖类药物及保健品的开发利用现状 总的来说,多糖的应用可分为两类:一类是在医药领域,利用多糖的抗原性、 抗肿瘤等活性制备疫苗或新药;另一类是在保健食品领域,活性多糖作为功 能性 因子调节或增强人体免疫功能或抗肿瘤、抗氧化、降血糖等保健作用。 迄今为止,在我国已投放市场的多糖药物主要有:香菇多糖注射液用于治 疗慢性肝炎及肿瘤治疗的辅助药、猪苓多糖注射液增强免疫功能,同乙肝疫 苗结合治疗慢性乙肝、云芝多糖胶囊用于治疗慢性乙型肝炎、癌症辅助治疗、 免疫功能低下的老年病等、黄芪多糖增强免疫功能、保肝等作用、灰树花多 糖增强免疫功能、肿瘤治疗的辅助药等。保健品主要有以下几个系列: 功能性口服液类,如灵芝口服液、猴头菇口服液、桑糖口服液桑叶、脑心舒 口服液蜜环菌等;保健茶类,如灵芝乌龙茶、新世纪保健茶桑叶等; 保健滋补酒类,虫草枸杞保元酒、松茸酒、香菇特酿酒等;保健胶囊 类,学者灵芝宝、虫草胶囊等。随着人们生活水平的提高,保健食品的需求将 有 较大幅度的增长。 国外对多糖的研究也十分重视,目前有多种植物多糖已经在临床治疗上用于 肿瘤的辅助治疗和减轻化疗的副作用【】。美国 教授领导的 实验室经过多年的研究,分离出种经过冻干后不再降解的、由键连接 的活性黏多糖 ,并已获得美国的批准,作为一种生物制剂广 泛用于治疗胃肠道、免疫类疾病以及癌症、艾滋病等,疗效显著【?。 学硕士论文 ..五昧子的研究概况 五味子 ..为木兰科植物五味子的干燥果 实,是著名的滋补性中药,因其果实甘、酸、辛、苦、咸五味俱全,故名五味 子。 又名五梅子、玄及、会及、山花椒等。其呈不规则的球形或扁球形,直径, 表面红色、紫红色或暗红色,皱缩,显油润;有的表面呈黑红色或出现“白霜”。 果肉柔软,种子个,肾形,表面棕黄色,有光泽,种皮薄而脆【列。它具有 保肝护肝、抗肿瘤、抗氧化和保护中枢神经系统等功效,能改善人的智力活 动, 提高工作效掣。临床用于敛肺、滋肾、生津、收汗、涩精、治肺虚喘咳,口 干作咳,自汗,盗汗等症【。 五味子含有多种活性成分,主要包括木脂素、挥发油、有机酸、多糖以及一 些维生素、矿质元素和生物碱类【,但目前对五味子活性成分研究主要集中在 木脂素类,对其它成分的研究相对较少。 木脂素木脂素为五昧子主要活性成分,属于脂溶性成分,种类多,主 要有五味子素、五味子甲素、五味子乙素、五味子醇甲、伪丫.五味子素、戈米辛 、五味子丙素、五味子酯甲等。提取方法有溶剂提取法和超临界萃取法。 溶剂法有回流法、索氏提取法、超声提取法等,常用的提取溶剂有甲醇、乙醇和 氯仿】。超临界萃取作为一种新兴的绿色提取技术,目前已应用于提取五 味子木脂素【,且超临界萃取五味子木脂素的提取率高于溶剂提取法。 五味子挥发油的研究主要集中在成分分析,戴好富等【】用 挥发油 .分析五味子挥发油,共检出个组分,鉴定了其中的个,主要成分 为.月桂烯、丫.杜松烯、.杜松烯、橙花叔醇、.杜松醇等。 多糖五味子粗多糖含有五味子总多糖和种以上氨基酸及种以上 微量元素‘。薛梅等【采用水提醇沉法从五味子中提取多糖,并测定其含量为 .%。 其它主要有柠檬酸、苹果酸、酒石酸、琥珀酸等【】有机酸,有明显的 祛痰作用。五味子果实中还发现有甾醇、维生素、,树脂、鞣质及铁、锰、 硅、磷等矿物质。 次。合并次滤液,用薄膜旋转蒸发器浓缩,用硫酸一苯酚法测得三次提取率分 别为.%、.%、.%,总多糖含量为.%。薛梅等‘用水提醇沉法提取五 味子多糖,将五味子粉碎后,置索氏提取器中,依次用石油醚?~?、乙 醚和%乙醇回流提取,用苯酚一硫酸比色法测得多糖含量为.%,平均 回收率为.%。李巧云等嘲在单因素实验的基础上进行正交实验,研究了料 液比、温度、时间对多糖提取率的影响,结果显示,料液比:,温度?, 时间为水浸提五味子多糖的最佳工艺,用葸酮一硫酸法测得多糖提取率为 .%。谭晓红等【】采用煎煮法提取五味子多糖,硫酸一苯酚法测得多糖含量 为 .%。 .采用不同的提取纯化工艺,对粗多糖的提取效果会产生影响。同时,多糖在 纯化过程中的损失也会使测得的多糖含量有所差别,以及产地、采收季节等 因素 的影响。 五味子多糖的纯化 五味子多糖的纯化一般要经过醇析、脱蛋白、脱脂、脱色等步骤。张兰杰等 将提取得到的粗多糖经过醇析、法脱蛋白,将脱蛋白后的溶液用四倍 %乙醇沉淀,沉淀用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤进行脱脂,随后进行活性碳脱 色,并用纤维素柱色谱进行分离,分离出两种多糖组分,紫外、红外光谱 分析表明两种多糖具有不同的化学组分,但尚未研究多糖水解的详细过程及 多糖 的单糖组成。李巧云等四对提得的粗多糖采用改进的醇析方法进行醇析,得 到 的粗多糖的白度较高,减少了脱色步骤,用酶法结合法脱蛋白,使重复 试验次数大大降低,利用溶液浓度扩散效应除去小分子杂质,并用红外光谱 对多 糖进行了初步鉴定。 江苏大学硕士论文 级法,用乙醇为沉淀剂,将五味子煎煮液中的多 糖分成级,测量不同分级多糖的含量。结果表明,五味子多糖主要集中在% 乙醇和%乙醇分级的两个级别,占近%的多糖。 ...五昧子多糖的生物活性 保肝作用 濉大员等嗣研究发现五味子粗多糖可使四氯化碳肝损伤 小鼠的显著下降,肝糖元含量显著提高,并可使中毒小鼠戊巴比妥 钠睡眠时间显著缩短,表明五味子多糖对肝损伤有良好的保护作用。进一 步研究表明,多次灌胃给药,对中毒小鼠肝中丙二醛含量具有显著降 低作用,并能显著抑制小鼠肝匀浆脂质过氧化反应,能促进正常小鼠的胆汁 分泌 和部分肝切除后肝的再生,表明的保肝作用与其对抗脂质过氧化、促进肝 再生和利胆作用有关‘。 免疫促进作用 李岩等‘研究发现能增加免疫抑制小鼠胸腺和脾脏重量。此外,对正 常小鼠也可使其免疫器官的重量增加,明显增强网状内皮系统对印度墨汁 的吞噬能力‘,并可显著提高正常小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬百分率和图示指数, 促进溶血素肌溶血空斑形成,促进淋巴细胞转化。 清除自由基及抗氧化作用 五味子多糖能明显降低中毒小鼠肝组织丙二醛含量,具有抗脂质过氧 化作用【。黄玲等蚓采用肿瘤移植的动物模型,测定荷瘤小鼠血液总.超氧化物 歧化酶、丙二醛,结果表明,五味子多糖可使小鼠血浆 水平明显升高,水平明显下降,说明五味子多糖可以抑制自由基的产生, 有一定的抗脂质过氧化作用。门向红等【研究发现能明显提高老年大鼠血 清、和.活性,提示具有改善体内自由基代谢紊乱的作 用。 抗衰老作用 苗明三【研究发现五味子多糖具有较好的抗衰老作用,可使衰老小鼠已萎 缩的胸腺及脾脏明显增大增厚,胸腺皮质细胞数及脾淋巴细胞数明显增加,脾小 第一章绪论 结增大,使衰老小鼠已退行性变得神经细胞恢复正常,且可使神经细胞胞体增大, 可明显促进衰老小鼠神经细胞的发育。能明显降低老年大鼠血清含 量,并提高血清活性。说明既能减轻脂质过氧化物对组织或细胞的 损伤,又能增加机体对自由基损伤的防御机能。揭示可通过改善自由基代 谢发挥抗衰老作用【删。 抗肿瘤作用 黄玲等【,删采用肿瘤移植的动物模型,研究五味子多糖的抑瘤率及对免疫器 官的影响,结果表明高浓度的五味子多糖有较好的抑瘤作用,可在一定程度上使 瘤细胞退变、凋亡,使瘤内炎细胞增多,瘤周浸润部瘤细胞部分退变,有轻度抑 瘤形态学表现。五味子多糖合并环磷酰胺有较强抑瘤作用抑瘤率达.%。五味 子多糖能抑制肿瘤的生长,其抑瘤作用可能不是直接杀死瘤细胞,而与细胞凋亡、 活化免疫细胞有关。五昧子多糖能提高荷瘤小鼠的活力,抑制自由基的产 生,具有一定的抗脂质过氧化作用,这是五味子多糖抑制 荷瘤小鼠瘤体生 长的原因之一【。李明珠等‘】研究发现五味子粗多糖对.移植性肿瘤生长也 有抑制作用,多糖浓度为/时,对荷瘤小鼠的存活延长率为.%。 . 保护白细胞作用 研究表明,可剂量依赖性对抗环磷酰胺所致的白细胞减少,对骨髓造 血机能具有保护作用,其原因可能是对已生成的白细胞具有保护作用,使 白细胞的破坏和丧失减少,也可能是通过促进脾脏间质细胞的增生,发挥代偿性 髓外造血功能所致。确切的机制有待进一步深入研究【’?。 其他作用 五味子多糖给小鼠按、/多次灌胃,能明显提高小鼠的耐缺氧能 力,具有抗疲劳作用【】。陈文静等【】以氮芥类烷化剂环磷酰胺诱导出现微核的 小鼠骨髓嗜多染红细胞数目和染色体畸变率为指标,观察五味子多糖的抗突变作 用。结果表明,五味子多糖高/、中/、低/剂量组对于 环磷酰胺诱导的微核率都有抑制作用;对小鼠骨髓染色体畸变有抑制作用。 .研究的目的和意义 五味子为木兰科五味子 .,俗称 江苏大学硕士论文 北五味子的干燥成熟果实,被卫生部列入“可用于保健食品名单,为常用 滋补强壮药,其主要活性成分有木脂素、多糖和挥发油。但目前对五味子的利 用主要是木脂素,对多糖和挥发油利用少。工业上五味子一般采用乙醇提取, 获得五味子浸膏,制成单方或复方片剂、颗粒剂、丸剂、胶囊和口服液等剂型。 而经乙醇提取木脂素后的五味子药渣一般作为废物丢弃,造成药用资源的浪费 和环境污染。 多糖是当今研究的热点课题之一,许多多糖具有免疫调节、抗肿瘤和抗衰 老等多种活性,并且对机体的毒副作用小,因此科研工作者正致力于从植物、 动物和微生物中发现具有重要活性价值的多糖。 五味子多糖是五味子中的一种活性成分,易溶于水而不溶于低极性的有机 溶剂,给综合利用五味子提供了可能。己研究发现五味子多糖具有多种活性, 有重要的研究和开发应用价值,但未见五味子醇提药渣中多糖的研究报道。为 充分利用五味子资源,本论文研究了五昧子醇提药渣粗多糖的提取工艺及其生 物活性,并与水提物进行对比,为五味子功能食品及抗肿瘤辅助药物的开发提 供基础,为五味子药渣的资源化利用提供依据,具有重要的理论研究意义和实 际应用价值。 .本论文的主要研究内容 本论文研究的主要内容: 研究五味子醇提药渣中粗多糖的水提工艺。考察水提多糖六个因素对五 昧子多糖提取率的影响,确定最佳水提工艺条件。 研究五味子粗多糖的理化性质。 研究五味子粗多糖及脱蛋白后粗多糖的体内免疫活性。 研究五味子粗多糖和五味子水提物的体内、体外抗氧化活性。 研究五味子醇提药渣中粗多糖及水提物的体外抗肿瘤活性。 本论文行文路线: 第一章绪论 参考文献 【】张兴涛,高贵珍.多糖研究进展【】.宿州学院学报,,: 【】 ’..七 , , . :【】 , .. ,:【】 . ,:? 【】王顺春,方积年,徐长卿.多糖的分离纯化及结构分析【】.中国药学杂志,, :? 【】中科院上海药物研究所.中草药有效成分提取及分离【】.上海:上海科 学技术出版社, :. 【】李知敏,王伯初,周菁,等.植物多糖提取液的几种脱蛋白方法的比较分析 【】.重庆大学 学报,,: 【】方积年.多糖的分离纯化及其纯度鉴别与分子量测定【】.药学通报,:: .【, . ,,: 【】钟方晓,任海华,李岩.多糖含量测定方法比较【】.时珍国医国药,,: . 学硕士论文 【】吴锦文.碘量法测定灵芝等多糖制品中多糖的含量阴.食用菌,: . 【】 , ,: 【】. ,: . 【】凌笑梅,张娅婕,张桂英,等.鳖甲提取物中氨基酸、微量元素及多糖含量的测定【】.中 国公共卫生,,: 】褚新红,陈光芝,于学娟,等.薄层扫描法测定亮菌糖浆中亮菌多糖的含量【】.中成药, ,:?, 【 】 , , .,:? 【. . 一 】 ,/ 【】.,,: . 【】刘燕,林瑞超,李波.云芝多糖抗肿瘤作用研究进展【】.中成药,,:. 【 】徐文清,高文远,沈秀.银耳孢子多糖抑制肿瘤及放射增效作用的研究】.中国生化药 物杂志,,: .【 】 , . , : 【】陈地龙,刘永刚,王亚平,等.人参多糖对细胞增殖抑制及诱导分化的实验研究 【】.第三军医大学学报,,: 【】季宇彬,高世勇,张秀娟.羊栖菜多糖诱导肿瘤细胞凋亡的研究【】.中国 中药杂 志,,:?【】 , ,. 【】. : , ,, 【】 ./ : , 忉. , . 民 【】 【 【 【 【】 【】蔡曦光,许爱霞,葛斌,等.菟丝子多糖抑制衰老小鼠模型中氧自由基域的 作用【】.第 三军医大学学报,,:? 】樊黎生,龚晨窖,张声华.黑木耳多糖抗辐射效应的动物实验【】.营养学报,, :? 葛明珠,赵丽莉,任少林.南沙参多糖对小鼠免疫器官辐射损伤的防护【丁. 中草 药,, : 【】孙鹏,胡君艳,李瑞强.螺旋藻多糖的结构及生物学研究叨.中国生化药物杂志,,: 【吴利,何莉芳,何伟清.芦荟多糖的药理作用研究进展【】.中国中医药科技,,: . . 【】 , , , . : , 【】王蓉,吴剑波.多糖生物活性的研究进展【】.国外医药抗生素分册,,:. 【】 陈万生,韩军,李力,乔传真.知母总多糖的抗炎作用【】.第二军医大学学报,, : 【】 罗琼,黄晓兰,李卓能,等.枸杞多糖对雄性大鼠性功能及生殖功能的影响【】.营养学 报,,: .【】 ’ , ’大学硕士论文 ,,: . . , , 【】 ? . ,:. , 【 :. ,: 【】 李松,吴青华,陈畅,等.多糖抗肿瘤活性的最新研究进展唧.中国生化药 物杂志, ,: 【】 国家药典委员会.中华人民共和国药典】.北京:化学工业出版社,: 应国清,俞志明,单剑峰,等.北五味子有效成分的研究进展叨.河南中医,,: 【】 . 】。.,.,. .. ,: 【】韩学忠.五味子多糖提取纯化、分级及应用【】.中医药学报,,:? 【】李晓光,高勤,翁文,等.五味子有效部位及其药理作用研究进展】.中药 材,, :?. 【】叶宇红,张运达.降酶灵胶囊中五味子浸膏提取工艺【】.抗感染药学,,:?. 】田明,黄玉芬,杨晓明,等.五味子不同提取工艺活性成分的研究【】.中医药信息, ,:. 【】 . ,,: 【】戴好富,谭宁华,周俊,等.北五味子挥发性化学成分研究明.中草药,,: 【】李岩,曲绍春,孙文娟,等.北五味子粗多糖对环磷酰胺所致小鼠免疫功能低下的保 护作用【】.白求恩医科大学学报,.:? 【】薛梅,周静,王鲁石.五味子多糖的提取及含量测定【】.陕西中药,.: 【】李建平,单安山.五味子的生物学作用与应用【】.中国畜牧兽医,,: 【】张兰杰,张维华,赵珊红.北五味子果实中多糖的提取与纯化研究【】.鞍山师范学院 学报,.似: 【】李巧云,居红芳,翟春.五味子粗多糖提取工艺的研究阴.食品科学,.: 第一章绪论 】谭晓红,王治宝,李如章.北五味子中多糖含量的测定】.河北北方学院学报医学 版,.: 【】濉大员,高普军,吕忠智,等.北五味子粗多糖保肝作用的药理研究【】.吉林中医药, 【】 高普军,朴云峰,郭晓林,等.北五味子粗多糖保肝作用的机理【】.白求恩医科大学学 报。 .: 【】濉大员,于晓风,吕忠智,等.枸杞子、北五味子和黄精三种粗多糖的增强免疫与抗脂 质过氧化作用叨.白求恩医科大学学报,.:. 【】 苗明三,方晓燕.五味子多糖对正常小鼠免疫功能的影响【】.中国中医药科 技,.:黄玲,陈华,张捷平.五味子多糖对荷瘤小鼠血液和的影响【】.福建中医 学院学报,.:? 【 向红,刘立,谢海泉,等.北五味子粗多糖对大鼠自由基代谢的影响明.吉林中医 药,.: 【】苗明三.五味子多糖对衰老模型小鼠的影响【】.中国医学学报,.: 【】孙文娟,吕文伟,于晓凤,等.北五味子粗多糖抗衰老作用的实验研究川.中国老年学 . 杂志, : 【】 黄玲,陈玲,张振林.五味子多糖对荷瘤小鼠体抑制作用的病理学观察【】.中药 材,.: 【】黄玲,张捷平,陈华.五味子多糖对 荷瘤小鼠抑瘤作用的研究【】.福建中医学院 学报,. : 【】 曲绍春,孙文娟,李岩,等.北五味子、黄精、白鲜皮粗多糖升白细胞作用的研究【】.吉 林中医药。: 【】 罗基花,胡尚嘉,黄唯莉,等.五味子粗多糖升白细胞作用的初步观察【】.吉林医学院 学报。.:. 【】 陈文静,王艳杰,季宇彬.五味子多糖的抗突变作用研究【】.上海医药,,: . 】 李明珠,王艳杰。徐放.五味子粗多糖抑制肿瘤和抗突变作用的实验研究【】. 黑龙江 , 中医药,,: 江苏大学硕士论文 第二章五昧子醇提药渣中多糖的提取工艺研究 .前言 五味子为临床常用中药,已有两千多年的药用历史,为中医常用滋补强壮药。 但目前对五味子的利用主要是木脂素,对多糖和挥发油研究相对较少。研究发现, 五味子多糖具有保肝、免疫促进、清除自由基及抗氧化等作用,有重要的研究和 应用价值。工业生产中,每年都有大量的五味子醇提木脂素后的药渣被作为废弃 物丢弃,使得五味子中多糖等有效成分得不到充分利用,造成药用资源的浪费和 环境的污染,目前还未见从五味子醇提药渣中提取多糖的文献报道。因此,从五 味子醇提药渣中提取多糖对综合利用五味子、保护环境具有重要意义。 本实验选择用水作溶剂进行提取,用苯酚.硫酸法检测多糖。根据整个提取 工艺流程的经济性、多糖得率等方面的因素,对五味子醇提药渣中粗多糖的提取 工艺进行研究,考察粗多糖的理化性质,并研究五味子醇提药渣中水提物的 提取, 为五味子药渣的综合利用提供基础。 .材料与仪器 ..材料与试剂 五味子醇提药渣:镇江中兴药业有限公司提供,经镇江市药检所陈黎主任药 师鉴定为 果实药渣。 苯酚溶液的配制:称取苯酚纯苯酚为针状无色结晶,水浴加热后溶 解,加铝片.先用:的盐酸除去铝片表面的氧化铝后再称量使用,加氢 氧化钠.,蒸馏收集的馏分;%苯酚:苯酚分析纯,重蒸馏试 剂加水使之溶解,可置冰箱中避光长期保存;%苯酚:临用前以% ‘ 苯酚配制;医用酒精:%;其他试剂均为分析纯。 第二章五味子醇提药渣中多糖的提取工艺研究 ..主要仪器 电子天平 北京塞多利斯仪器有限公司 巩义市予华仪器有限责任公司 .型循环水式真空泵 .型数显恒温水浴锅 巩义市予华仪器有限责任公司 .型旋转蒸发器 巩义市予华仪器有限责任公司 . 电热恒温鼓风干燥箱 上海一恒科学仪器有限公司 . .冷冻干燥机 北京博医康实验仪器有限公司 昆山市超声仪器有限公司 数控超声波清洗器 .可见分光光度计 北京瑞利分析仪器公司 . 型真空干燥箱 上海一恒科学仪器有限公司 .实验方法 ..多糖的提取流程 五味子醇提药渣在?烘箱中放置烘干。称取适量五味子药渣子 圆底烧瓶中,加入一定量的水,在一定温度下进行一定时间的提取,提 取液经过减压浓缩得浓缩液,浓缩液用一定量%乙醇醇沉,‘冰箱中静置过 夜,抽滤,冷冻干燥后即得粗多糖样品.。 ..多糖含量的测定方法 采用苯酚?硫酸法测定总的多糖含量。 标准曲线绘制 精密称取?干燥至恒重的葡萄糖,用蒸馏水溶 解并定容到。精密量取葡萄糖标准溶液.,.,.,.,.,., .置容量瓶中,加蒸馏水定容。吸取.糖液至试管中,再分别 加入%重蒸苯酚溶液.,摇匀,然后加浓 .,充分摇匀,于室 温?下放置,另以蒸馏水为空白对照,在处测定吸光度,以浓 度为横坐标,吸光度为纵坐标绘制标准曲线,建立回归方程。 原料中多糖含量的测定称取适量五味子醇提药渣于?、料液比:、 硕士论文 乙醇醇沉,醇沉时间,得到粗多糖。 根据上述方法测定粗多糖中多糖浓度,再根据公式.计算求得原料中多糖的 含 量为.%。 多糖含量?/聊×% 式中: :称取的用于分析测定的粗多糖质量; :溶解定容后的体积曲; .多糖的校正系数,?.; :由回归方程计算所得多糖的浓度/。 样品中多糖含量的测定 称取粗多糖样品.,用蒸馏水定容于 容量瓶中。吸取.于试管中,按标准曲线步骤操作,测其吸光度, 根据标准曲线计算多糖含量。按下式计算多糖提取率和粗多糖得率: ? 多糖提取率塑焉翥誊薯彗毳警×,。。%; ? 粗多糖得率鬻×。。%。 ..单因素试验 影响多糖提取率的主要因素有醇沉时间、醇沉浓度、料液比、温度和提取时 间等。本实验醇沉时间选择、、、四个水平,乙醇倍数选择倍、 倍、倍、倍、倍量五个水平,料液比选择:、:、:、:、:五 个水平,温度选择、。、。、。、。五个水平,时间选择、、 、、五个水平,提取次数选择、、、、五个水平按提取流程分别 进行单因素试验。 ..正交试验 根据单因素试验结果,以多糖提取率为考察指标,选取料液比、温度、提取 时间作为考察因素,各取个水平,提取次,进行正交实验,优化五味子 粗多糖的提取工艺条件,用苯酚?硫酸法测定多糖含量,统计试验结果。 .. 的五 .. 溶液 茚三酮反应取.%多糖溶液.置试管中,加.%茚三酮溶液., 混匀,煮沸,观察颜色变化。以蒸馏水为阴性对照,.%的甘氨酸溶液 为阳性对照。 反应取.%多糖溶液.置试管中,加%的仅.萘酚乙醇溶液 试剂,将试管倾斜,沿试管壁慢慢加浓硫酸.后直立试管, 观察浓硫酸与糖溶液交接面颜色的变化。以蒸馏水为阴性对照,.%淀粉溶液 为 阳性对照。 ..五昧子水提物的提取及多糖含量测定 称取适量烘干的五味子醇提药渣于圆底烧瓶中,固液比:,提取 温度,提取时间,连续回流提取次,提取液经过减压浓缩得浓缩液, 冷冻干燥后即得水提物产品。根据..方法测定计算多糖含量,计算多糖得率。 .结果和讨论 ..标准曲线的确定 葡萄糖标准曲线如图.所示,在~/范围内,葡萄糖浓度与吸收 值呈良好的线性关系。经计算得回归方程:..相关系数 .。 江苏大学硕士论文 ?????????????????????????????????????????????????????一 . . . ?. 《 。. 型. 整. . . 浓度/ 图.标准曲线 . ..单因素对多糖提取率的影响 ...醇沉时司的影响 五味子醇提药渣,料液比:,温度,提取次,每次, 倍量乙醇醇沉,不同醇沉时间对多糖提取率的影响见图.,可知醇沉时间对多 糖提取率影响不大,综合考虑取为宜。 ...醇沉浓度的影响 五味子醇提药渣,料液比:,温度,提取次,每次,醇沉 时间,不同醇沉浓度对多糖提取率的影响见图.,在实验范围内,倍量的 乙醇醇沉效果最好。 ? 辞 誉 鬈 篓 裂 嗽 盛 熏醇沉时间 醇沉倍数 图. 醇沉浓度对多糖提取率的影响 图.醇沉时间对多糖提取率的影响 .. ..第二章五味子醇提药渣中多糖的提取工艺研究 ...料液比的影响 五味子醇提药渣,温度,提取时间,提取次,倍量乙醇醇沉, 醇沉时间,不同料液比对多糖提取率的影响见图.,可知液料比的上升会 增加多糖的溶出量,当液料比达到以后上升的幅度趋于平缓。由于提取液在 后续工艺中须经过浓缩步骤,初期加水量过大会使后续 浓缩能耗增加,效率降低,因此综合考虑,在实际提取过程中料液比:较为合 适。 ...温度的影响 五味子醇提药渣,料液比:,提取时间,提取次,倍量乙醇醇 沉,醇沉时间,不同温度对多糖提取率的影响见图.,可知温度对五味子 多糖的提取率有显著的影响,多糖提取率随温度的上升伴而显著上升,在 条件下多糖的提取率几乎是时提取率的两倍,因此温度为最佳。 提取时间的影响 五味子醇提药渣,料液比:,温度,提取次,倍量乙醇醇 沉,醇沉时间,不同提取时间对多糖的提取率的影响见图.,可知随着提 取时间的增加,五味子多糖提取率有所增加,但后提取率有所下降,因此, 提取时间最佳。 ? ? 主 静 ? 鬟 糖 一曩一哥苷裂舞蚺 们 掩 加 ? 提取温度? 液料比倍 图.液料比对五味子多糖提取率的影响 图.温度对五味子多糖提取率的影响 ....