长江口纹缟虾虎鱼精子、卵子及受精过程扫描电镜观察

长江口纹缟虾虎鱼精子、卵子及受精过程扫描电镜观察 长江口纹缟虾虎鱼精子、卵子及受精过程扫 描电镜观察 第3O卷第4期 2008年11月 海洋渔业 MarineFisheries Vo1.30,No.4 NOV.,2008 文章编号:1004—2490(2008)04—0308—06 长江口纹缟虾虎鱼精子,卵子 及受精过程扫描电镜观察 章龙珍,陈丽慧,庄平,冯广朋,徐滨,赵优 (1.中国水产科学研究院东海水产研究所,农业部海洋与河口渔业重点开放实验室,上海200090; 2.大连水产学院生命科学与技术学院,大连116023; 3.上海海洋大学水产与生命学院,上海高校水产养殖E一研究院,上海200090) 摘要:采用电镜对长江口纹缟虾虎鱼成熟精子,卵子及受精早期精子入卵过程进行了观察.结果显示:纹 缟虾虎鱼成熟精子由头部和尾部两部分组成.头部呈圆形或近圆形,无顶体,细胞核长径为1.15?0.28m, 短径为0.97-4-0.22m,尾部鞭毛长为8.17?1.12txm.核膜外具有双层质膜,质膜面不平整,在核膜和双 层质膜中间有较大空隙存在.中心粒复合体位于植入窝内.袖套两侧分布有2—3个较大的线粒体.鞭毛为 典型的"9+2"结构,有侧鳍.成熟卵呈圆形,卵膜表面多沟和嵴,具单一受精孔,孔洞区外径约5/xm,孔内壁 呈螺旋嵴.在卵的植物极有一盘状突起,突起的中问为圆形,周边有呈网状结构的 粘丝与卵壳膜连接.纹缟 虾虎鱼精子入卵速度较快,受精过程较短,受精后10,18S完成精子入卯过程. 关键词:纹缟虾虎鱼;受精;扫描电镜 中图分类号:$961文献标识码:A Observationonspermatozoa,eggandspermpenetrationof Tridentigertrigonocephalusbymeans ofscanningelectronmicroscopy ZHANGLong—zhen,CHENLi.hui,ZHUANGPing,, FENGGuang—peng',XUBin',ZHAOYou' (1.EastChinaSeaFisheriesResearchInstitute,ChineseAcademy0厂 FisherySciences,KeyandOpenLaboratory 0厂MarineandEstuarineFisheries,Ministry0厂Agriculture,Shanghai200090,China; 2.CollegeofAqua— lifeScienceandTechnology,DalianFisheriesUniversity,DalianLiaoning116023,China; 3.CollegeFisheriesandAquaScience,ShanghaiOceanUniversity,E—institute o厂ShanghaiMunicipalEducationCommission,Shanghai200090,China) Abstract:Thematureeggs,spermatozoaandfertilizationprocessofTridentigertrigonoceph alustakenfromthe YangtzeEstuaryhavebeenobservedbymeansofscanningelectronmicroscopy.Itcametokn owthatthesperm 收稿日期:2008—08—15 基金项目:国家自然科学基金重大项目(30490234);国家科技基础条件平台 (2006DKA30470—0O4);中央级公益性 科研院所基本科研业务费专项资金(中国水产科学研究院东海水产研究所)资助 项目(2007M02);上海市高校水产养殖 学E一研究院建设项目(E03009);上海市长江口中华鲟自然保护区科研专项 作者简介:章龙珍(1954一),女,湖北谷城人,研究员,主要从事水生动物生殖生物学 和生理学研究.E-mail: longzhen2885@hotmail.corn 第4期章龙珍,等:长江口纹缟虾虎鱼精子,卵子及受精过程扫描电镜观察 oftrigonocephalusisbelongedintheflagellumform.Thespermaticheadisalmostroundinshapeand withoutacrosome.Thelongradiusis1.15? 0.28mm.Theshortradiusis0.974-0.22mm.Thelengthof flagellumis8.174-1.12mm.Thesurfacesofnucleusmembraneandplasmamembranearenoteven.The spacebetweenthemembraneofthenucleusandcytoplasmisrelativelylarge.Theimplantationfossais relativelyshallow.Thecentriolarcomplexisconsistedofproximalcentrioleandbasalbody.Thereare2—3 mitochondriaonthetwosidesofthecentralspaceofsleeve.Thecentralstructureofthetailisaxonemewhich formedatypical9+2pattern.Thematureeggoftrigonocephalusissphaeroid.withonlyonemicropyle. Theoutsideofmicropyle'Sdiameterisabout5p,m,andwithspiralcristaesontheinternalwal1.Therearelots ofcristaesandditchsonthesurfaceofmatureeggs.Thereisadish— liketuberinthevegetalpole,themiddle ofwhichisrotundity.Thecireumjacentfilamentsconnectedtuberwiththeegg-membranepresentednetlike configuration.Thepenetrationofspermintotheeggsisquickandtheprocessofthefertilizationisshort,the timeofpenetrationneeds10to18s. Keys:Tridentigertrigonocephalus;fertilization;scanningelectronicmicroscopy 纹缟虾虎鱼(Tridentigertrigonocephalus)属鲈形目(Perciformes),虾虎鱼科(Gobiidae), 缟虾虎鱼属 (7}identiger).为沿岸底栖性鱼类,广盐性,广泛分布于亚洲东北部太平洋沿岸,俄罗 斯东西伯利亚,黑 龙江河口,朝鲜半岛,中国和日本均有分布,在我国主要见于黄渤海,东海,台湾海峡,南海等水域,同时 也是长江口浅滩咸淡水水域中广泛分布的优势种?.由于它摄食底栖生物,同时又是许多经济鱼类 的饵料生物,在食物链中处于中游,地位重要;长江口虾虎鱼科又是国家一级重点保护动物中华鲟 (AcipensersinensisGray)幼鱼的主要饵料生物,其重量百分比达到50.54%E43,虾虎鱼的丰歉直接影响到 当年降海洄游中华鲟幼鱼成活率的高低,对保护中华鲟具有重大意义. 国内外关于硬骨鱼类精子入卵的研究已有较多报道J,硬骨鱼类精子人卵的方式和途径基本相 似,但不同种类之间仍有特异性.有关鲈形目鱼类受精过程扫描电镜的受精生物学研究仅在尼罗罗非 鱼(Tilapianilotica)J,黑鲷(Sparusmacrocephalus)等方面作过报道.但是目前有关纹缟虾虎鱼受精 生物学方面的研究尚未见报道.本文通过对纹缟虾虎鱼精,卵及精子人卵过程进行了初步观察和研究, 旨在掌握其精子人卵过程的生物学现象,为其今后开展人工繁殖,资源增殖积累基础资料和提供理论依 据,亦为长江口中华鲟幼鱼栖息地幼鱼饵料资源的修复奠定一些基础. 1材料与方法 1.1实验材料 2007年4月,6月从上海崇明岛收集野生的纹缟虾虎鱼488ind,从中挑选出健康正常,发育成熟 的雌雄性亲本各1O余ind,在室温条件(204-1oC)下进行干法人工授精.取纹缟虾虎鱼成熟未受精卵 及授精后不同时间(1S,2S,4S,6S,8S,10S,12S,14S,16S,18S,20S,30S,40S,50S,60S)的受精卵样 品,每个时段取50—8O粒. 1.2实验方法 电镜样品的制备:将固定的精液经3000r/min离心5min,弃上清液,再加等量2.5%的戊二醛.3O min后将沉淀精子从离心管中剥离出来,用2.5%的戊二醛中保存,置4?下备用.样品经PBS液漂洗 3次后,用2%的锇酸固定,各级酒精梯度脱水,Epon812树脂包埋,ULTRACUTE超薄切片机切片,厚度 为70—80nm.样本经醋酸铀和柠檬酸铅染色,置HITACHIH-600型透射电镜观察并拍照. 扫描电镜样品的制备:将样品用2.5%的戊二醛固定1.5h,pH7.4的PBS液漂洗3次,l%的锇酸 固定1.5h,PBS液洗一次,梯度酒精脱水,醋酸异戊酯过渡,自然干燥,喷金,JEOL-6380LV扫描电镜观 察 310海洋渔业2008焦 2结果 2.1纹缟虾虎鱼精子的外部形态 纹缟虾虎鱼成熟精子由头部和尾部组成. 2.1.1头部 精子头部顶端无顶体,由细胞核,中心粒复合体,袖套,线粒体等组成(图版l-1).精子细胞核很 大,长径为1.15?0.28p.m,短径为0.97?0.22m,呈圆形或近似圆形,几乎占据了头部的整个空问. 核膜外具有双层质膜,靠近核膜的为内层质膜,其外的为外层质膜,双层质膜表面不平整,呈波浪状,在 核膜和双层质膜中间有较大空隙存在(图版I_2).在细胞核下端,核质内陷形成沟状植入窝,中心粒复 合体位于植人窝内,近端中心粒位于沟状植入窝的上段,基体位于植入窝的下段.袖套位于核下端,呈 一 筒状,围绕轴丝形成袖套腔(图版I-1).在袖套腔两侧,大约2,3个较大线粒体排列成环状,在线粒 体的外面有外层质膜包被(图版I一2).由于外层质膜将细胞核和线粒体包在一起,所以,纹缟虾虎鱼精 子无明显的中段结构. 2.1.2尾部 精子的尾部由一条细长的鞭毛构成,鞭毛的核心结构是轴丝,为典型的"9+2"结构 ,4). (图版I一3 尾部的起始端位于袖套腔中,鞭毛从袖套腔中伸出.鞭毛的细胞质膜与袖套膜一侧相连,另一侧不相 连.在鞭毛的两侧有不规则侧鳍分布,鞭毛长为8.17?1.12tzm. 2.2纹缟虾虎鱼成熟卵的外部形态 纹缟虾虎鱼成熟卵属粘性卵,在低倍扫描电镜下观察呈圆形,直径450,650m(图版I.5).卵表 面不光滑,高倍镜下可见到卵膜表层形成许多沟和嵴.在卵的动物极一端有一呈圆锥形嵌入,即受精孔 (又称卵膜孔,micropyle),孔洞区外有一椭圆形线状隆起,长径约5m,短径约4m.在受精孔上方有 个半膜状覆盖物,呈半透明状(图版I-6).在卯的植物极附着粘丝,着生点为一盘状突起,基部直径稍 大,约为150m,顶部稍窄,直径约为110m,高约为35m(图版I.5).突起的中间为一实心圆形,圆 形正中间有一个直径约为10tzm的深度凹陷,圆形周边是粘丝以5,8圈编制成的网状结构(网孔径约 5.5Ixm)与卵壳膜紧密相连接,粘丝其余部分呈游离状,粘丝较多,约200根(图版I一7,8).卵子入水 后,粘丝能够牢固地粘在光滑的玻璃面上,粘着面积大,卵子不易脱落.近百粒卵观察显示,纹缟虾虎鱼 成熟卵子仅有1个受精孔. 2.3精子入卵时序 授精1,2S,受精孔半膜状覆盖物消失,受精孑L口呈开放态,精孔内壁呈螺旋嵴,精子还未到达受精 孔附近(图版I一9). 授精4,6S,可见有精子到达受精孔附近,并且头部与受精孔相向,正准备穿人受精孔,在受精孔周 围有些物质突起(图版I.10). ,18S,大部分样品的受精孔口被球状胞质物质堵塞,受精孔口被封闭,被堵授精10 在受精孔外的 精子还未解体(图版I.11). 授精30,60S,卵膜表面和受精孔周围有大部分余精解体,有精子头,尾的残迹和凝集成一团絮状 物(图版I.12). 3讨论 3.1卵膜孔类型和特殊覆盖物 根据光镜的比较研究,Riehl等?把鱼的卵膜孑L分为三种类型:深的凹陷和短的孔道;浅的凹陷和 长的孔道;只有一孔道而无明显的凹陷.根据电镜的观察结果,纹缟虾虎鱼的受精孑L属于第三种. 纹缟虾虎鱼卵的受精孔上方有个半膜状覆盖物,在其它鱼类中未见类似结构.张筱兰等..在研究 黑鲷精子入卵早期过程时发现精子在游抵卵膜孔时,卵孑L管内,外已有了凝固的膜絮状前絮状物,此物 第4期章龙珍,等:长江El纹缟虾虎鱼精子,卵子及受精过程扫描电镜观察311 可能是精孔细胞解体后遗留下来或由卵膜孔,卵孔管分泌的小肽类物质,具有激活精子和诱导精子入卵 功能.黄永松等?对尼罗罗非鱼刚产出的成熟卵子,进行活体观察时,也发现卵膜孔外区域有一些透 明物质,当切片观察时,在相对应的卵膜孔外面也覆盖着一层"附属膜",具有诱导精子人卵的作用. Linhart等?在研究白鲟(Psephurusgladius)精子入卵时发现,在精子入卵前,受精孔四周有细胞质突起 或絮状物,推测该物质可能刺激受精.授精1,2S时,纹缟虾虎鱼卵的受精孔上方的半膜状覆盖物消 失,受精孔口呈开放态,半膜状覆盖物消失有利于精子人卵.授精4—6S时,在受精孔的周围有物质突 起,推测这些物质可能也有引导精子靠近的作用. 3.2成熟卵的形态 纹缟虾虎鱼成熟卵的表面不光滑,存在许多沟和嵴,这和金鱼(Carassiusauratus)?,暗纹东方纯 (Fuguobscurus)?,黑鲷的卵表面存在沟或嵴的形态相似,而有别于赤眼鳟(Squaliobarbuscurriculus Richardson)的卵壳表面无明显的沟或嵴,以及索氏六须鲶(Silurussoldatovi)卵表面类似叶片的网 状结构.由于纹缟虾虎鱼卵表面没有类似于赤眼鳟J,暗纹东方鲍_I,黄颡鱼(Pseudobagrus fulvidraco)等所具有的均匀分布的大量用来与外界进行气体交换的TL4,管或微孔,所以推测纹缟虾 虎鱼卵表面的沟和嵴除了具有增加粘性的功能外,还增加了卵子的通透性,加大了卵和外界进行气体和 离子交换的面积的作用. 纹缟虾虎鱼成熟卵表面还有一个特殊结构,即卵的植物极有一盘状突起粘着丝,粘丝和卵壳膜以网 状结构相连接.天津大银鱼卵(ProtosalanxhyalocraniusAbbott)的赤道位置绕有一圈相互缠绕的卵膜 丝,大银鱼的卵膜丝具有粘着性和加强生殖隔离的保障作用?.张开翔和戈志强等认为大银鱼 的卵膜丝还有保持受精卵在整个发育过程中具备良好的环境条件的作用.纹缟虾虎鱼成熟卵的粘丝起 着粘着的作用,一般纹缟虾虎鱼生活的区域涨退潮时水流比较急,纹缟虾虎鱼卵的网状结构的粘丝比非 网状结构的粘丝更结实,牢固,使粘丝和卵壳膜之间的联系更紧密结实,能把卵紧紧地黏着在固着物上, 不易被流水冲走.纹缟虾虎鱼卵的粘丝的这种特殊结构体现了对环境的适应性,是物种长期进化的结 果. 3.3精子入卵的机械动力作用 硬骨鱼类的受精是精子穿过卵膜上的受精孔与卵的质膜发生融合而完成两性配子结合的,因此 硬骨鱼类的受精与受精孔的特殊结构密不可分.纹缟虾虎鱼的受精孔内壁呈螺旋嵴结构,该结构与暗 纹东方纯的受精孔内壁结构相似,只是旋幅度较大.大鳞副泥鳅(Paramisgur~ll,$dabryanus)的受精 孔呈现有规则的涡旋状凹陷结构,涡旋方向为逆时针;脂鲤(Astyanaxbimaculatuslacustris)和黄颡鱼 卵膜上以受精孔为中心分布大量辐射状沟嵴;尼罗罗非鱼的精孑L壁呈现阶梯状纹路,约有l0,12 级.诸多研究表明,鱼类卵子不论是受精孔区的辐射状沟嵴结构或涡旋状凹陷结构,还是受精孔内 壁螺旋状结构或阶梯状纹路,都为精子快速滑向受精孔提供了物理学动能. 3.4精子入卵时间 不同鱼类在受精后精子入卯时问亦有差异.赤眼鳟需8—18sJ,鲤(Cyprinuscarpio) 需2,25 s,史氏鲟(Acipenserschrenckii)需50—120s,黄颡鱼需5,20Sl17],索氏六须鲶(Silurussoldatovi)受 精后30,60S完成精子人卵过程?,尼罗罗非鱼授精60S,精孔管被一团物质堵塞, 精子被挤压在精孔 管壁上不能进入卵内,黑鲷完成精子人卵过程需要10—15s_l.纹缟虾虎鱼受精10,18s,大部分 样品的受精孔口被球状胞质物质堵塞.Brummet等和张筱兰等..分别在研究底鲔(Fundulus heteroclitus)和黑鲷时认为精子入卵之后受精孔内出现的堵塞物可能是皮质小泡迅速分泌的硫酸粘多 糖,结构蛋白和酶之类物质.推测纹缟虾虎鱼受精孔的球状胞质堵塞物可能也是皮质小泡分泌的类似 物质迅速涌向受精孔外形成的,具有阻止余精继续人卵的作用,是构成受精屏障,保证单精受精的重要 物质之一.纹缟虾虎鱼完成受精过程只需lO一18S,这说明纹缟虾虎鱼受精时间比大部分鱼类短,在进 行人工繁殖时,精卵拌和要快速完成,且应适当地增加精子的比例,以便提高受精率和孵化率. 312海洋渔业2008年 参考文献: [1]庄平,王幼槐,李圣法,等.长江VI鱼类[M].上海:上海科学技术出版社,2006:216—217. 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