食品微生物检验——单增李斯特菌.doc

食品微生物检验——单增李斯特菌.doc 食品中单增李斯特检测技术 李斯特氏菌属包括七个种: 单核细胞增生李斯特氏菌 绵羊李斯特氏菌 英诺克李斯特氏菌 威尔斯李斯特氏菌 西尔李斯特氏菌 格氏李斯特氏菌 默氏李斯特氏菌 其中单核细胞增生李斯特氏菌对人类致病性强，绵羊李斯特氏菌对人类也有一定的致病性，其余李斯特氏菌无致病性。 单核细胞增生李斯特氏菌是一种人畜共患病的病原菌。 1 它能引起人畜的李氏菌的病，感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。 它广泛存在于自然界中，食品中存在的单增李氏菌对人类的安全具有危险，该菌在4?的环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一，因此，在食品卫生微生物检验中，必须加以重视。 μmх1.0-2.0μm,直或稍弯，两端钝圆，常呈V字该菌为革兰氏阳性短杆菌，大小约为0.5 型排列，偶有球状、双球状。 兼性厌氧、无芽胞，一般不形成荚膜，但在营养丰富的环境中可形成荚膜，在陈旧培养中的菌体可呈丝状及革兰氏阴性。 该菌有4根周毛和1根端毛，但周毛易脱落。 该菌营养要求不高，在20--25?培养有动力，穿刺培养2,5天可见倒立伞状生长，肉汤培养物在显微镜下可见翻跟斗运动。 该菌的生长范围为2--42?(也有报道在0?能缓慢生长)，最适培养温度为35--37?，在pH中性至弱碱性(pH9.6)、氧分压略低、二氧化碳张力略高的条件下该菌生长良好，在pH3.8,4.4能缓慢生长，在6.5% NaCl 肉汤中生长良好。 在固体培养基上，菌落初始很小，透明，边缘整齐，呈露滴状，但随着菌落的增大，变得不透明。 在5-7%的血平板上，菌落通常也不大，灰白色，刺种血平板培养后可产生窄小的β-溶血环。 在0.6%酵母浸膏胰酪大豆琼脂(TSAYE)和改良Mc Bride(MMA)琼脂上，用45度角入射光照射菌落，通过解剖镜垂直观察，菌落呈兰色、灰色或兰灰色。 该菌触酶阳性，氧化酶阴性。 发酵多种糖类，产酸不产气。 如发酵葡萄糖、乳糖、水杨素、麦芽糖、鼠李糖、七叶苷、蔗糖(迟发酵)、山梨醇、海藻糖、果糖。 2 不发酵木糖、甘露醇、肌醇、阿拉伯糖、侧金盏花醇、棉子糖、卫矛醇和纤维二糖。 不利用枸橼酸盐，40%胆汁不溶解。 吲哚、硫化氢、尿素、明胶液化、硝酸盐还原、赖氨酸、鸟氨酸均阴性。 VP、甲基红试验和精氨酸水解阳性。 该菌对理化因素抵抗力较强。 在土壤、粪便、青储饲料和干草内能长期存活。 对碱和盐抵抗力强，60-70?经5-20min可杀死，70%酒精5min、2.5%石炭酸、2.5%氢氧化钠、2.5%福尔马林20min 可杀死此菌。该菌对青霉素、氨苄青霉素、四环素、磺胺均敏感。 李斯特氏菌(Listeria)是条件致病菌，大多为散发病例，也可因污染食品而爆发。 本菌能产生一种溶血素性质的外毒素。能引起人和牛、绵羊等动物的脑膜炎，可使家兔豚鼠等实验动物感染引起血中单核细胞增高。 可引起婴儿及新生儿的化脓性脑膜炎或脑膜脑炎，死亡率可达70%。子宫内感染的新生儿可导致新生儿李斯特氏菌病、流产、死胎或习惯性流产。 SN 0184-93 出口食品中单核细胞增生李斯特氏菌检验方法 样品:冷冻样品，2,5?解冻，不超过18h 若不能及时检验，应置于,15 ?保存。 非冷冻易腐样品应尽可能及时检验。 若不能及时检验，应置于4 ?冰箱保存，在24h之内检验。 两次增菌: 巴氏消毒乳、乳制品、冷冻水产品、冻肉及其它加工食品应该前增菌。 25g，225ml改良缓冲蛋白胨水，均质。 3 30 ?培养18,24h，移取1ml接种于100ml增菌培养液(EB)中，30 ?培养24、48h，分别进行分离。 直接增菌: 生乳、鲜肉以及未经加工处理过的样品。 25g，225ml 增菌培养液，30 ?培养24和48h，分别进行分离。 分离: 划线接种于MMA或者OXA平板，35 ?培养24,48h。 斜射光镜检。 MMA平板: 蓝色或者兰灰色,扁平圆润，稍有凸起,边缘整齐 菌落较小，约为0.5mm左右 OXA平板: 4 菌落呈黑色，直径1mm， 在其周围形成一个黑色环。 从MMA或OXA上挑取5个可疑菌落，接种TSA-YE平板，进行纯培养。 纯化菌落再转接到TSB-YE肉汤，35?培养24h。 进行生化试验。 典型运动镜检: 从TSA-YE平板挑取生长良好的菌落于洁净载玻片上。 用0.85%灭菌生理盐水制成悬浮液。 在显微镜下用油镜观察。 短棒状杆菌，显微镜下可见轻微旋转和翻滚。 过氧化氢酶: 5 过氧化氢酶又称接触酶，能催化过氧化氢分解成水和氧。 菌落,平板,1滴3,的过氧化氢。 阳性。 过氧化氢酶实验也可以在试管中进行 革兰氏染色镜检: 革兰氏阳性 溶血试验: 6 7,羊血琼脂平板，划分小格，刺种菌落。 做阳性对照和阴性对照(英诺克李斯特氏菌)。 35 ?培养24,48h，于明亮处观察。 单核细胞增生李斯特氏菌在刺种点产生窄小的透明β溶血环 尿素酶(Urease)试验: 有些细菌能产生尿素酶，将尿素分解、产生2个分子的氨，使培养基变为碱性，酚红呈粉红 色。 穿刺接种尿素酶琼脂斜面，35?培养5天，逐日观察，阴性。 硝酸盐还原试验: 某些细菌能够把培养基中的硝酸盐还原为亚硝酸盐。 亚硝酸盐与乙酸反应生成亚硝酸。 硝酸与对氨基苯磺酸作用，形成偶氮苯磺酸。 偶氮苯磺酸与α萘氨结合，形成红色的N,α苯氨偶氮苯磺酸 接种硝酸盐肉汤，35?培养5天， 加入0.2ml试剂A，再加入 0.2ml试剂B，轻摇混合。 红色:阳性 没有颜色变化:加入少量锌粉 ,变红,阴性(硝酸盐未被还原) ,不变,阳性(亚硝酸盐已经分解成氨和氮) 甲基红(Methyl Red)试验: 某些细菌在分解葡萄糖过程中产生丙酮酸，进一步分解中，可产生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，可使培养基PH值下降至pH4.5以下，使甲基红指示剂变红。有些细菌产酸量少，培养基的pH保持在6.2以上，指示剂呈现黄色 V-P试验: 7 某些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养基中能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸缩合，脱羧成乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境下，被空气中氧氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物，称V,P(+)反应。 操作: 接种MR-VP肉汤，35?培养48h。 移取1ml于洁净试管，加入5, α,萘酚溶液6ml， 再加入10,氢氧化钾溶液0.2ml，轻摇1min，静置20min VP-阳性反应:红色 剩余培养液继续培养2d， 加入甲基红指示剂5滴。 -阳性反应:红色 MR 三糖铁(TSI)琼脂试验: 本试验可同时观察乳糖和蔗糖发酵产酸或产酸产气(变黄);产生硫化氢(变黑)。葡萄糖被分解产酸可使斜面先变黄，但因量少，生成的少量酸，因接触空气而氧化，加之细菌利用培养基中含氮物质，生成碱性产物，故使斜面后来又变红，底部由于是在厌氧状态下，酸类不被氧化，所以仍保持黄色。 三糖铁试验: 接种三糖铁琼脂，35?培养5天。 斜面和底层产酸，不产生硫化氢。 (发酵葡萄糖和蔗糖) 糖酵解试验 不同微生物分解利用糖类的能力有很大差异，或能利用或不能利用，能利用者，或产气或不产气。可用指示剂及发酵管检验。 接种0.5%糖类发酵管。 35?培养24,48h，阴性继续培养到5天。李斯特氏菌不产气。 8 葡萄糖:阳性 麦芽糖:阳性 七叶苷:阳性 甘露醇:阴性 鼠李糖:阳性 木糖:阴性 动力观察: 穿刺接种半固体动力培养基， 室温(20,25?)培养2,5天，逐日观察。 有动力。 自穿刺线向四周蔓延生长， 呈典型伞状生长，底部为弯月牙状 协同凝血试验:企业可不做。 血清学检验:企业可不做。 9 小鼠毒力试验:企业可不做。 结果报告: 阳性结果:检出单核细胞增生李斯特氏菌 阴性结果:未检出单核细胞增生李斯特氏菌 这是李斯特的协同溶血实验。(cAMP) 两条竖线，左面是马红球菌，右面是金葡。 三条横线，上面是单增，中间是一种非溶血李斯特，下面是绵羊李斯特。 结果:单增在靠近金葡处溶血增强。 绵羊在靠近马红处溶血增强。 溶血实验: 10 从左向右依次是: 单增，窄小的 贝塔 溶血环。 绵羊，大的透明 贝塔 溶血环。 无溶血环的李斯特。 溶血实验局部放大照片。 从左向右依次是: 单增，窄小的 贝塔 溶血环。 11 绵羊，大的透明 贝塔 溶血环。 无溶血环的李斯特。 12