嗜酸乳杆菌和乳酸链球菌混合培养及产物分析

嗜酸乳杆菌和乳酸链球菌混合培养及产物 嗜酸乳杆菌和乳酸链球菌混合培养及产物 分析 嗜酸乳杆菌和乳酸链球菌混合培养及产物分析 张帆,王建华,杨雅麟,滕达,刘立恒 (中国农业科学院饲料研究所基因31程室,北京,100081) 摘要嗜酸乳杆乳菌(LA)和酸链球菌(sL)在33~C培养48h的发酵液中抑菌(金黄色葡萄球菌ATCC25923) 效果最好;2菌混培20h后生物量和体系总产酸量远大干各自纯培养,乳酸含量一直上升,到24h达23.175 mg/L,乙酸含量一直稳定在12mg/L左右,变化不大,乳酸与抑菌关系密切.LA和SL两菌混培接种比例的抑 菌优先顺序为(1:1),(2:1),(1:2). 关键词嗜酸乳杆菌,乳酸链球菌,混合培养,抑菌,金黄色葡萄球菌 近年国内外研制微生物添加剂的思路是选择动 物性有益微生物群尤其是优势种群成员,培养并制成 活菌制剂,然后以投入方式使其回到原来的环境并发 挥益生作用.嗜酸乳杆菌和乳酸链球菌具有调节肠 道菌群,降低胆固醇,促进免疫等一系列的生理功能, 是微生态保健品及饲料添加剂的常用益生菌口. 研究中对此2菌共处的微生态关系作了初步探索. 1辅料与贲法 1.1菌株 1.1.1嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus) 购于国家农业微生物菌种保藏中心,简称LA. 1.1.2乳酸链球菌(Streptococcuslactisacidi) 简称SL,由山东宝来利来生物工程股份有限公 司赠送,斜面保藏管. 1.1.3指示菌一 标准型大肠杆菌(44103);沙门氏菌(533<C79 , 13>);大肠杆菌K88(CVCC195);大肠杆菌K99 (CVCC222);金黄色葡萄球菌(ATCC25923),均购于 中国兽医药品监察所. 1.2培养基 1.2.1MRS改良培养基 蛋白胨10g,酵母提取物5g,牛肉膏10g,葡萄 糖20g,乙酸钠5g,柠檬酸二铵2g,Tween801 mL,MgSO4?7H2O0.58g,MnSO4?4H2O0.05g, KHPO2g,琼脂粉17g,水1000mL,灭菌前自然 pH6.12,6.2,于121?,1×10Pa灭菌20min,用 于目标乳酸菌培养用培养基[4?. 第一作者:学士,助理研究员(王建华为通讯作者,Email wangjianhua@mail.caas.net.cn) 收稿日期:2006—09—29 1.2.2LB琼脂培养基 酵母提取物5.0g,蛋白胨10g,NaC110g,琼脂 17g,蒸馏水1000mL,pH值7.0,于121?,1×10. Pa灭菌20min.用作大肠杆菌培养用培养基. 1.2.3营养肉汁琼脂培养基 蛋白胨10.0g,牛肉提取物3.0g,NaCI5.0g, 琼脂18g,蒸馏水1000mL,pH7.0,用作金黄色葡 萄球菌培养用培养基. 1.2.4BPY琼脂培养基 牛肉提取物5.0g,蛋白胨10.0g,酵母提取物 5.0g,葡萄糖5.0g,琼脂18g,蒸馏水1000mL, pH7.0,用作沙门氏菌培养用培养基. 1.2.5SBA培养基(g/L) 胰蛋白胨20,酵母粉5,葡萄糖2,KHPO4,叠氮化 钠0.2,琼脂12,氯化三苯四唑(TTC)0.1,去离子水 1000mL,用作分离球菌用培养基. 1.2.6分离乳杆菌的SL培养基_8] 1.2.7分离乳球菌的M17培养基[g] 1.3主要仪器 戴安离子色谱仪(DionexBioLC,美国),生化培 养箱(LRH,250,A,广东省医疗器械厂),生物显微镜 (尼康),微量移液器(Eppendof,德国),超净工作台, 100mL点滴瓶若干,120mm×120mm培养皿. 1.4试验方法 1.4.1总酸度测定(NaOH滴定法) 取10mL发酵液,加入20mL去离子水和5滴 1酚酞指示剂,用0.1mol/LNaOH滴定至红色, 滴定体积数乘10,即为该发酵液酸度(.T). (1)0.1mol/LNaOH溶液的配制:称4g NaOH(分析纯)固体,用新煮沸并冷却的蒸馏水溶 解,并稀释至1000mL,摇匀定容,待用. (2)1(10g/L)酚酞指示剂:称取酚酞1g,溶于 l 2007年第33卷第6期(总第234期)l53 100mL95乙醇中,待用. 1.4.2乳酸,乙酸的测定 离子色谱法测定0,36h发酵液乳酸及乙酸含 量.按以下流程处理样品:培养后发酵液一去蛋白一 离心一稀释一取10L上柱.去蛋白的程序:取5 mL发酵液,加入10mL无水乙醇,离心8000r/ rain,8rain,去沉淀,得上清液. 1.4.3活茵计数法 采用涂布法,用微量进样器取100L稀释度不 同的菌悬液滴于平板上,涂布均匀,密封,编号,倒置, 34~35?下培养计数. 1.4.4接种模式 表1混菌接种比例(v/v) 编号 1 2 3 4 5 LA/sL/%接种比例(LA:SL) 3 —— 1.5 1 2% 3 1.5 2 1 2实验结果 2.1抑菌特性复壮 菌株LA和SL以任意比混合,液体培养28h,取 出1mL依次稀释到10,10,10.,10,10,10,10, 涂平皿,培养26h,挑选长势良好的LA和SL单菌 落,纯培养48h,再以任意比混合培养,涂平板,再挑 选,再纯培养一然后以1:1混合连续培养转接2次, 作抑菌圈平板观察,与复壮前对照比较,选取抑菌优 势菌株做进一步研究.复壮选择的指示菌为:标准型 大肠杆菌(44103),大肠杆菌K88(CVCC195),沙门 氏菌(代号:533<C79—13>),金黄色葡萄球菌 (ATCC25923). 2.2两乳酸菌混合培养最佳温度的确定 接种量3;静置培养温度31?,33?,35?, 37?;培养时间48h.由于嗜酸乳杆菌最佳培养温度 为37?C,乳链球菌最佳培养温度为3O?,二者培养 温度相差较大,LA与SL混培时需寻找一个共同的 最佳适应温度.实验表明无论那种接种模式,33?培 养48h,发酵液抑菌(金黄色葡萄球菌ATCC25923) 效果最好,说明此温度为最佳混培温度(图1). 2.3两种乳酸菌混合培养接种模式的选择 根据各自条件活化5种指示菌:配500mL相应 培养基,灭菌,分装(100mL/瓶),加入指示菌液2 uL/mL培养基一吸取30mL此培养基于12Omm 54』—2007Vo1.33No—.6(Total234) 3335 混合培养温度FC (指示菌:金黄色葡萄球菌ATCC25923) 图1不同温度下LA和SL混培液抑菌效果 ×120mm平皿,冷却,凝固,把灭菌牛津杯置于培 养基上,每孔加入280L发酵上清液(6O00r/min) (SL,LA及LA+SL混培发酵液),置于3O?生化培 养箱,24h后观察抑菌圈大小. 2菌共处生长的最佳接种模式是LA:SL(1: 1),在33?下抑菌圈最大,其代谢产物对病原菌尤其 是金黄色葡萄球菌抑制效果最明显(图2).复壮后 菌株混培转接2次,其发酵液抑菌圈比原始菌株的 大,效果明显,说明其抑菌物质含量高. (指示菌:金黄色葡萄球菌ATCC25923) 图2混合培养接种模式与抑菌关系(33?) 2.4混合培养与纯培养时发酵液对金黄色葡萄球菌 (ATCC25923)的抑制效果 图3两菌混合培养与纯培养液对金黄色 葡萄球菌(ATCC25923)的抑制圈图 发酵上清液对标准型大肠杆菌(44103)和沙门氏 菌(533~C79—13>)有一定抑菌作用,但透明圈较 小且混浊,不透明;对大肠杆菌K88,K99抑制效果也 舯50 ,词匿粗嚣 不明显,但对金黄色葡萄球菌(ATCC25923)抑制最 明显,抑菌圈大;LA:SL接种模式(1:1)和(2:1) 抑菌效果比模式(1:2)要好(图3);牛津杯放置培养 基上比埋在其中的发酵液扩散效果更好. 2.5两菌混合培养和纯培养的生物量,产酸量变化 在相同接种方式和培养温度下,混培后生物量及 产酸量并不相同;混培2菌在O,12h相互适应,生长 和产酸差异都不明显,16~20h后混培生物量(图4) j四 靛 g 蝴 士H 图4两菌混合培养与纯培养的生物量曲线 } 面 图5两菌混合培养与纯培养的酸度曲线 o4812l62024283236 时间/h 图6LA和SL(1:1)混培液的有机酸含量 图7LA和SL(1:1)混培(24h)液中乳酸的 离子色谱图(23.175mg/L) 霸霍墨圜 和体系的总产酸量(图5)明显大于各自纯培养的结 果;在0~36h内,乳酸含量不断增加,24h达23.175 rag/L(图6,图7).乙酸含量变化不大,培养期内一 直稳定在12mg/L左右(图6).表明乳酸与抑菌关 系可能更密切和更重要. 3结论 关于嗜酸乳杆菌和乳酸链球菌混合和纯培养的 实验结果表明,此2菌混培可加快有机酸产生,发酵 液抑菌强度增大,2菌在混合培养阶段及同一体系中 能相互共处,互相促进生长.本研究结果可作为包含 有此2菌的复合益生菌制剂生产实践制定发酵工艺 时参考. 参考文献 1KarinH,BarbelHH.Factorsaffectingthefermentative lacticacidproductionfromrenewableresources[J].En— zymes&MicrobialTechnol,2000,26(1):87~107 2KazuhitoA,TakeoK,HiroyukiU,eta1.SomeLactoba— cillusL—lactatedehydrogenasesexhibitcomparablecatalyt— icactivitiesforpyruvateandoxa1oacetate[J].JBacteriol, 2001,183(1):397,400 3布坎南RE,吉本斯NE.伯杰细菌鉴定手册(第八版, 中译本)EM].北京:科学出版社,1984.8O5,806 4王建华主编.新型安全饲料添加剂研制与开发EM].北京: 科学出版社,2005,102,108,147,154,256,261 5闫征,王昌禄,顾晓波.pH值对乳酸菌生长和乳酸产 量的影响I-J].食品与发酵工业,2003,29(6):35,38 6张帆,王建华,刘立恒,杨雅麟,滕达,嗜酸乳杆菌培 养条件及其生物学特性研究[J],食品与发酵工业,2005, 31(3):43,45 7张帆,王建华,刘立恒等.菊粉寡糖促进嗜酸乳杆菌生 长的研究[J].食品与发酵工业,2004,30(4):49,51 8张帆,刘立恒,滕达,等.植物乳杆菌和戊糖片球菌活 菌计数检测[J].饲料广角,2002,21:38,39 9张帆,王建华.粪链球菌特性及活菌数检测方法[J].中国 饲料,2002,23:18,19 1O张香美,江汉湖,董明盛.双歧杆菌与嗜酸乳杆混合培养 时微生态关系研究[J].安徽农业技术师范学院, 1999,13(2):5,10 ll凌代文,东秀珠.乳酸菌分类鉴定及实验方法EM].北京: 中国轻工业出版社,1999.84,127 12郭兴华.益生菌基础及应用EM].北京:北京科学技术出 版社,2002.45,65 13黄庆生,王加启.饲料乳酸菌类益生素的作用机制和应用 [J].动物营养,2002,14(4):12,17 14黄忠,周响艳,王建华,等.中草药益生菌联合制剂研 制I-J].中国畜牧兽医,2004,(5):7,9 15潘康成,何明清.我国微生物添加剂研究及应用[J].兽药 与饲料添加剂,2002,7(4):35,37 !生苤塑鲞苤塑(星苤塑!I55 ?如m50 ?uv咖如甾墨怔 FOODANDFERMENTATIONINDUSTRIESl ConditionOptimizationandProductAnalysisforCo-cultivationofLactobacillus acidophilusandstreptococcuslactisacidi ZhangFan,WangJianhua,YangYalin,TengDa,LiuLiheng (GeneEngineeringLaboratory,FeedResearchInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100081) ABSTRACTThemicro— ecologica1relationshipbetweenLactobacillusacidophilusandStreptococcuslactis acidiwerestudiedinwayofCO— cultivationintermsofacidproductionandbacteriuminhibition:Themaxi— muminhibitionagainstStaphylococcusaureusATCC25923wasreachedwhentheirCO— cultivationwasrunat 33? for48h.Thebiomassandtotalorganicacidproductionwasmuchhigherthanthatofanyoneoftheir individua1purecultivation,inwhich1actatereached23.175mg/Lat24h,andacetatewaskeptatabout12 mg/Lduringtheentirecultivation.Theformerresultwasmorerelatedtoinhibitionagainstbacteria.Thein— oculationsizeratioofLactobacillusacidophilusandSrP声 ococc"slactisacidiwasrankedas1:1,2:1and 1:2onpurposeofinhibitionagainstbacteria. KeywordsLactobacillusacidophilus,Streptococcuslactisacidi,CO— cultivation,inhibitionagainstbacteria, Staphylococcusaureus 帑- l糖 糍i烘蟾食品衙星玩三市场特性. 蠡. 在2007年3月发布的《2006~2007年中国休闲食品行业市场研究》中显示,随着现代人生活节奏的加快,生 活水平的提高,对各种烘焙食品的需求也不断增加,烘焙食品市场前景更加广阔.目前花样繁多的饼干,蛋黄派,薯条,膨化食 品正受到越来越多的年轻人的欢迎.烘焙食品呈现如下市场特性: (1)竞争残酷,品牌是关键.烘焙企业最大的竞争力在于品牌,品牌形象越好,市场竞争力也就越强.就目前的市场情况而 言,烘焙食品行业的竞争可以说是极端残酷.纵观糕点等烘焙食品市场的发展现状,可颂坊,一品轩走的是中高档路线,主要针 对消费能力较高的消费群体,因此产品是要满足消费者对产品味道,口感的要求;雪贝尔等争夺的是学校,大卖场的市场份额; 琳琅则是以物美价廉为优势;除了这几个品牌,还有大大小小的小规模蛋糕坊,西饼店,它们在一定程度上也会影响烘焙食品行 业的销售. (2)中高端市场成为争夺焦点.饼干,薯片产品是发展较快的品种,然而,近年来,国内外品牌的竞争异常激烈.国外大品 牌和港台知名企业强势进入,给国内品牌树立了积极的榜样,康师傅,上好佳等国内知名大品牌与达能,卡夫,乐事等外资品牌 始终在竞争,他们不断提高产品质量,加快新产品的研发,加大营销推广力度,抢占中国休闲食品市场份额.国内的品牌除康师 傅,上好佳等实力较强的全国性品牌外,子弟等地方性品牌也在逐渐崛起,它们将从低端产品的开发渐渐向中高端产品延伸. 随着市场准入的实施,烘焙食品行业进入"门槛"的提高,国内焙烤市场竞争逐步从打"价格战"的恶性竞争,步入以产品质 量和产品研发为核心的良性竞争轨道.随着消费者收入的增加和品牌意识的增强,一些产品品质低,缺乏特色的企业会渐渐退 出市场舞台. (3)生产趋于专业化,标准化.随着国家行业标准的不断出台和实施,不少企业在行业标准基础上制定了更严格的原料,加 工,生产工艺,产品,检测等一系列标准,来保证产品的高品质.为了进一步保证产品的品质,不少烘焙企业在新产品研发和恢 复传统产品生产时,开始与食品科研机构,高等院校以及相关行业进行专业技术的沟通交流,在基础原料,食品添加剂,生产工 艺,包装材料,包装机械以及食品机械等方面加强专业化协作攻关,为产品的创新,产品质量产量的提高,工艺改良等方面提供 了有力的支持,使得烘焙食品行业的生产逐渐走上专业化,标准化道路. 总的来说,国内烘焙食品的发展越来越迅速,产品质量逐步提高,品种丰富多样,在我国较为发达的地区,烘焙食品行业的 水平与国际水准差距正大幅缩小,产品越来越贴近普通消费者的日常生活,焙烤食品行业的发展将继续为国家经济发展作出重 要贡献. 56I!Q!::鱼!Q191! I