fsh受体基因多态性在ivf-et 2ficsi中对卵巢反应性影响

fsh受体基因多态性在ivf-et 2ficsi中对卵巢反应性影响 上海交通大学 硕士学位论文 FSH受体基因多态性在IVF-ET/ICSI中对卵巢反应性的影响 姓名:夏丽娜 申请学位级别:硕士 专业:妇产科学 指导教师:孙晓溪 20090514 上海交通大学医学院硕士毕业论文 FSH 受体基因多态性在 IVF /ICSI-ET 中对卵巢反应性的影响 摘 要 目的:探讨在 IVF /ICSI-ET 中 FSH 受体基因多态性对控制性超排卵过 程中卵巢反应性及妊娠结局的影响。 :回顾性的本生殖中心 2007 年 1 月~2008 年 12 月因管性因 素、男性因素、混合因素及不明因素行 IVF /ICSI-ET 的患者共 223 例， 其中长超排卵 174 例，短方案超排卵 37 例，微刺激超排卵 12 例。 通过 PCR 扩增、酶切、纯化、基因测序分别测得 223 例患者 FSH 受体 基因在外显子 10 上第 680 位及 307 位的基因型，根据不同基因型分成 Asn680/Asn680、Ser680 /Ser680 、Asn680/Ser680;Thr307/Thr307、Ala307/Ala307、 Ala307/Thr307 各三组。比较 FSH 受体基因多态性在 223 例患者中的分布; 通过基因型分组，比较 174 例长方案超排卵患者的临床资料、卵巢对促 性腺激素的反应和最后的妊娠结局。 结果: 223 例患者中，FSH 受体基因 680 位点上 Asn/Asn 组占 52.0%, Ser /Ser 组占 12.1%，Asn/Ser 组占 35.9%;307 位点上 Ala/Ala 组占 12.1%, Thr/Thr 组占 48.4%，Ala/Thr 组占 39.5%。174 例长方案超排卵患者中 Ser680 4 上海交通大学医学院硕士毕业论文 /Ser680 组及 Ala307/Ala307 组的基础 FSH 值显著高于其余两组(P,0.05); FSH 受体基因 680、307 位点上多态性的改变与 OHSS 的发生无显著性差 异(P,0.05)。FSH 受体基因 680、307 位点上多态性的改变与临床妊娠 率无显著性差异(P,0.05)。 结论:在 IVF /ICSI-ET 控制性超排卵过程中，FSH 受体基因多态性 Asn680Ser、Thr307Ala 不能预测卵巢反应性，并与临床妊娠率无关。 关键词:体外受精-胚胎移植，卵泡刺激素，单核苷酸多态性，控制性 超排卵，卵巢反应性 5 上海交通大学医学院硕士毕业论文 EFFECTS OF FOLLICLE STIMULATING HORMONE RECEPTOR GENE POLYMORPHSIM ON OVARIAN RESPONSE DURING CONTROLLED OVARIAN HYPERSTIMULATON ABSTRACT Objective: To investigate the effects of different gene polymorphisms of follicle stimulating hormone (FSH) receptor on ovarian response during controlled ovarian hyperstimulation (COH) in IVF/ICSI patients. Methods: Retrospective study included 223 women who first underwent an IVF /ICSI cycle from 2007.1~2008.12, Ovarian stimulation was performed with GnRH agonists and gonadotropins using a long protocol in 174 of whom. Short protocol was used in 37 of whom and 12 of them were mini-stimulation protocol.All patients were under 40 years of age and the subjects with tubal, male, mixed or unexplained factor infertility were 6 上海交通大学医学院硕士毕业论文 included. Following analysis of genomic DNA of the patients, the FSHR gene polymorphisms at position 680 and 307 were divided into 3 groups respectively, Asn680/Asn680、Ser680 /Ser680 、Asn680/Ser680;Thr307/Thr307、 Ala307/Ala307、Ala307/Thr307.There was a comparison of the distribution of the different genotypes in infertility causes. The basic clinical parameters, ovarian response to gonadotrpins and pregnancy rate in 174 patients following long protocols were evaluated in different receptor isoform. Results: The distribution of genotypes in FSH receptor gene at position 680 was Asn/Asn 52.0%, Ser/Ser 12.1%, Asn/Ser 35.9%;at position 307,the distribution was Ala/Ala 12.1%, Thr/Thr 48.4%，Ala/Thr 39.5% in 223 patients. In patients who underwent long protocols，The homozygous Ser/Ser variant at codon 680 and Ala/Ala variant at codon 307 was significantly more prevalent in patients with elevated basal FSH(P,0.05);the distribution of FSHR genotype cannot predict which patients will develop OHSS. The distribution of FSHR genotype does not seem to influence pregnancy rate(P ,0.05). Conclusions: The gene polymorphisms of FSH receptor at position 680 and position 307 (Asn680Ser、 Thr307Ala) cannot be a marker to predict 7 上海交通大学医学院硕士毕业论文 development of OHSS during COH. The gene polymorphisms do not seem to influence pregnancy rate. Key words: IVF-ET，controlled ovarian hyperstimulation，FSH receptor, gene polymorphism，ovarian hyperstimulation syndrome 8 上海交通大学医学院硕士毕业论文 英文缩略词表 字母缩写 英文全称 中文解释 卵泡刺激素 FSH Follicle stimulating hormone LH luteinizing hormone 黄体生成素 SNP single nucleotide polymorphism 单核苷酸多态性 S Serine(Ser) 丝氨酸 N Asparagine(Asn) 天门冬氨酸 丙氨酸 A Alanine(Ala) T Threonine (Thr) 苏氨酸 IVF-ET In Vitro Fertilization-Embryo Transfer 体外受精-胚胎移植 ICSI Intracytoplasmic sperm injection 卵胞浆内单精子注射 多囊卵巢综合征 PCOS Polycystic ovarian syndrome PCR Polymerase chain reaction 聚合酶链反应 体重指数 BMI Body massive index OHSS Ovarian hyperstimulation syndrome 卵巢过度刺激综合征 1 上海交通大学医学院硕士毕业论文 上海交通大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明:所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立 进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究 做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意 识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名: 日期: 年 月 日 2 上海交通大学医学院硕士毕业论文 上海交通大学 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同 意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许 论文被查阅和借阅。本人授权上海交通大学可以将本学位论文的全部或 部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制 手段保存和汇编本学位论文。 保密?，在 年解密后适用本授权书。 本学位论文属于 不保密?。 (请在以上方框内打“?”) 学位论文作者签名: 指导教师签名: 日期: 年 月 日 日期: 年 月 日 3 上海交通大学医学院硕士毕业论文 FSH 受体基因多态性在 IVF-ET/ICSI 中对卵巢反应性的影响 引言 卵泡刺激素(follicle stimulating hormone，FSH)是女性重要的生殖激素，在卵 泡的生长过程中起重要作用，能够促进卵泡的生长、发育和成熟，并与促黄体生成 激素(luteinizing hormone，LH )共同作用使卵泡分泌雌激素。FSH通过表达在卵巢 颗粒细胞表面的FSH受体(FSH receptor，FSHR)介导生理功能。FSHR属于G蛋白偶联 受体超家族中的一员,由三部分构成:具有氨基端的细胞外域，由3个细胞内环和3个 细胞外环构成的7次跨膜区域和具有羧基端的细胞内域,FSHR的细胞外域具有与FSH 结合的特异结合区，细胞内域中含有大量的丝氨酸和苏氨酸残基[1]。FSHR信号传导 的主要途径是激活腺苷酸环化酶(cAMP)的产生，近来的研究表明，还可能存在其 它信号传导途径，包括细胞内钙离子的产生、有丝分裂原蛋白激酶(MAPK)途径, 以及产生肌醇三磷酸(IP3)途径[2]。 目前，在辅助生殖医学中，尿源性和基因重组的FSH被广泛应用于促排卵治疗 中。尽管临床有着化的促排卵方案，但经常会遇到内分泌背景相似的患者，促 排卵时卵巢反应性截然不同—低反应或卵巢过度刺激。因此，能够准确预测不同个 体的卵巢反应性，对于临床促排卵药物剂量的选择将是非常有价值的。目前，临床 上通常根据患者的年龄和基础FSH值来预测患者卵巢的反应性, 但卵巢年龄与实际 生理年龄并不总是一致的。基础FSH值即使在同一个个体中也会随着不同月经周期而 发生波动，因此能够找到其它不随月经周期改变的卵巢反应性的预测指标是十分具 有临床意义的。研究发现，当FSHR的基因发生突变时会造成明显的卵泡成熟障碍， 但在自然界中，FSHR基因突变的发生率极低[3]。近几年来通过基因芯片技术，检测发 现FSHR基因中存在大量单核甘酸多态性(single nucleotide polymorphism ，SNP)，可 2 上海交通大学医学院硕士毕业论文 能影响受体的活性，改变了激素对靶细胞的作用从而影响卵巢的反应性。 FSHR基因为单拷贝基因，位于人染色体2p21,p16区，该基因链中包含了10个 外显子和9个内含子，每个外显子和内含子间均为典型的边界序列，mRNA剪接修饰 后全部留在外显子上。其中第1,9外显子编码细胞外域，第10外显子编码细胞外域 的羧基端、跨膜区域以及细胞内域[4]。FHR基因上存在?700个同义或异义的SNPs, 目前被大家熟知的两个SNP，Ser680Asn、Ala307Thr是由Aittomaki等人首先描述。这 两个异义的SNP，均存在外显子10上，一个位于细胞内域的680位密码子，碱基由A 代替G(AGT?AAT)时，丝氨酸(Ser)变成天门冬氨酸(Asn)，对应的SNP为G2039A; 另一个位于细胞外域的307位密码子，碱基A代替了G( GCT?ACT)时，丙氨酸(Ala) 变成苏氨酸(Thr)，对应的SNP为G919A[5]。这两个不同位点的多态性可以形成四种不 同的等位基因:Thr307,Asn680(等位基因TN)， Ala307,Ser680(等位基因AS)， Thr307 ,Ser680(等位基因TS)和Ala307,Asn680(等位基因AN)。目前包括Simoni在内的众 多研究表明，Thr307主要与Asn680 连锁，Ala307主要与Ser680连锁[6]。 通过对不同人种的研究发现，在进行辅助生育技术促排卵反应时 FSHR 基因多 态性，特别是 Asn608Ser、Ala307Thr，与卵巢反应有一定联系，可能决定了正在接 受 IVF-ET/ICSI 治疗的患者的卵巢应答情况及最后的妊娠结局。 因此，为了探讨FSHR基因多态性对控制性超排卵过程中卵巢反应性的影响,本研 究主要通过比较FSHR基因在680、307位点上的多态性与IVF-ET/ICSI中控制性超排卵 中卵巢反应性和妊娠结局，了解FSHR基因多态性能否成为预测卵巢反应及反应程度 的指标，为今后临床合理用药及预防医源性并发症提供一定理论依据。 3 上海交通大学医学院硕士毕业论文 研究内容与方法 1. 研究对象 本研究为回顾性分析数据，选择 2007 年 1 月~2008 年 12 月在我院生殖医学中 心行 IVF /ICSI-ET 治疗的患者共 223 例，其中长方案超排卵 174 例，短方案超排卵 37 例，微刺激超排卵 12 例。 1.1 纳入标准: -40 岁，月经周期 25-35 天; ,年龄 25 ,因输卵管因素、男性因素、混合性因素(管性，男性因素)及不明原因性因素 行 IVF /ICSI-ET 治疗; ,第一次行 IVF /ICSI-ET 治疗; 1.2 排除标准: ,多囊卵巢综合症(PCOS)、子宫内膜异位症，输卵管积水; ,有卵巢或/和输卵管手术史: 2(材料与方法: 2.1 主要试剂及仪器 江苏康健医疗用品有限公司 乙二胺四乙酸(EDTA) 4 上海交通大学医学院硕士毕业论文 三磷酸脱氧核苷(dNTP)Promega 公司 申能博彩公司 DNA 聚合酶 申能博彩公司 PCR 缓冲液 琼脂糖 GENE TECH(上海) 有限公司 申能博彩公司 SAP 酶 BDT New England Biolabs 公司 PCR 扩增仪 Applied BioSystems 公司 9700 型 PCR 扩增仪 DNA 测序仪 Applied BioSystems 公司 3730 型 DNA 测序仪 2.2 超排卵方案 长方案超排卵:在月经周期第 21 d 皮下注射 GnRHa 1.25 mg (Decapetyl,法国), 月经第三天开始促排卵，rFSH( Gonal-F, Serono，瑞士)皮下注射，起始剂量 150-450 后通过阴道 B 超监测卵泡发育情况，调整 rFSH 剂量，当阴道 B 超下出现 IU/d，6 d 3 个或 3 个以上 18 mm 的卵泡时，给予 hCG 5000 IU 或 10 000IU( Profasi, Serono，瑞 士)肌注，并于 33-36 h 后在 B 超引导下取卵。根据精子质量决定选择 IVF/ICSI 方式， 按照实验室操作标准进行。按常规体外培养 48 h，取卵后第 3 d 进行胚胎移植，每次 移植胚胎不超过 3 个。黄体支持采用每日黄体酮 80mg 肌注。 短方案超排卵:采用促性腺激素释放激素激动剂(GnRHa)短方案行超促排卵。月 经周期第2d开始注射达必佳 0.1mg/天 (Decapeptyl， Ferring，德国)，第3d起加用果 纳芬(Gonal-F, Serono，瑞士)进行卵巢刺激。根据B超监测和血清E2及阴道B超结果适 当调整药物剂量。当2个或2个以上主导卵泡直径达到18mm时，肌注hCG5000-l0000 IU (Profasi, Serono，瑞士)。 微刺激超排卵:月经周期第3d开始注射HMG 150IU/天(珠海丽珠，中国)直至 主导卵泡直径达到18mm时，肌注hCG5000-l0000 IU (Profasi, Serono，瑞士)。 2.3 FSHR 基因 307 及 680 位点多态性的分析 5 上海交通大学医学院硕士毕业论文 2.3.1 外周血 DNA 的提取 提取患者静脉血 6ml，以.5mmol/l 乙二胺四乙酸(EDTA)100ul 抗凝，放置-70?冰箱冻存待测。采用蛋白酶 K 裂解和酚抽提法，提取基因 DNA， 在-20?保存。 2.3.2 FSHR 基因 307 及 680 位点 DNA 扩增及测序 对 FSHR 基因的第 10 外显子进行扩增引物的设计。引物的序列:引物一 F15’-CTCTATGCCATCTTTACCAA-3’,R15’-AATGTGTAGAAGCACTGTCA-3’( 含 盖 引 物 二 Asn680Ser A/G), F2 5’-CCAGGATGCTGATAAACC-R1 3’, 5’-AAACTCATCATTTCTACCCT -3’(含盖 Ala307Thr A/G)。PCR 反应体系为 10ul， 包括有消毒三蒸水 6.4ul，10×PCR 缓冲液 0.8ul，2.5mol/l 的三磷酸脱氧核苷(dNTP) 1ul，10umol/L 引物(双项游引物)0.72ul，5U/ul 耐热 DNA 聚合酶 0.1ul，基因组 DNA1ul。将上述混合液混匀并短暂离心后放置到 PCR 扩增仪中。共 35 个循环后在 94?预变性 30 秒，55?退火 30 秒，72?延伸 1 分钟，72?后延伸 7-10 分钟。将所 得的 PCR 片段与已知相对分子质量的片段产物一起在 2,琼脂糖凝胶上电泳，判断 片段扩增结果。再将 PCR 扩增片断 1.5ul 加入 SAP 酶形成 SAP 反应液，最后将 Bigdye 荧光标记终止底物、消毒三蒸水、单项引物 0.5ul 的混合液加入 SAP 反应液，经过 35 个循环，得到最终扩增产物，将产物进行纯化，溶解后进行基因测序，观察患者 第 307 及 680 密码子上的碱基变化情况。PCR 克隆扩增及基因测序由上海交通大学 Bio-X 中心完成。 2.4 血 FSH、E2 值测定:化学发光法 3(统计内容及分组: 6 上海交通大学医学院硕士毕业论文 根据患者所测得的 FSHR 基因 680 及 307 位的多态性将 223 例患者分成 Asn680/Asn680、Ser680 /Ser680 、Asn680/Ser680;Thr307/Thr307、Ala307/Ala307、Ala307/Thr307 各三组。收集各组患者的病例资料，包括年龄、不孕时间、不孕原因、体重指数、 基础 FSH 值、窦卵泡数、超排卵药物的剂量、超排卵的天数、HCG 注射日雌激素水 平、HCG 注射日子宫内膜厚度、获卵数、受精数、卵裂数、平均移植胚胎数、移植 胚胎的累积胚胎评分、临床妊娠数、卵巢过度刺激综合征发生数，计算出受精率、 卵裂率、移植累积胚胎平均评分、临床妊娠率、轻、中重度卵巢过度刺激的发生率。 ,临床妊娠的标准:B 超下显示妊娠囊或心管搏动。 ,胚胎评分按 Edward 标准:每个胚胎的形态学评分乘以分裂球数。累积胚胎 评分(Cumulative embryo score，CES)为植入的胚胎乘以该胚胎的评分相加后得到。 本研究中使用的胚胎评分为平均胚胎评分，即累积胚胎评分/移植的胚胎数(mean score of transferred embryos ，MCES)。(见表 1) 表1 胚胎质量评价标准(Edward标准) Table 1 Evaluation of embryo quality according to Edward criteria 胚胎分级 镜下形态学 评分 ?级 卵裂球大小均等，透亮，无碎片 4 分 ?级 卵裂球大小不均，碎片<10% 3 分 ?级 卵裂球大小不均，碎片 10,50% 2 分 ?级 卵裂球大小不均，碎片>50% 1 分 ,OHSS 的分度标准根据:根据 Golan 等标准，包括临床表现、体征、超声和 实验室检查，将 OHSS 分为 3 度和 5 级。(见表 2) 7 上海交通大学医学院硕士毕业论文 表 2 Golan 5级分类法 Table 2 The degree and grade of OHSS according to Golan criteria OHSS 级别 轻度 中度 重度 腹胀不适 1 1 级症状加恶心 2 呕吐及(或)腹泻 卵巢增大直径 5-12cm 轻度症状加 3 超声发现腹水 中度症状加临床腹水征及(或) 4 胸水或呼吸困难 所有上述症状加血容量减少血 5 液浓缩，血粘度增加，凝血异 常，肾灌注减少，肾功能减退 4.统计学处理 结果采用例数(百分比)和均数?标准差(x?s)表示，应用 SPSS11.0 软件进行 统计学处理，多组间均数差别用单因素方差分析(ANOVA)检验，组间率采用卡方 <0.05 认为差异具有显著性。 检验。P 值 8 上海交通大学医学院硕士毕业论文 结果 1(223例进行超排卵治疗患者FSHR基因多态性的分布 1(1 FSHR基因多态性的分布 223例不孕症患者中680位上FSHR基因型分别为NN组 52.0%(n=116), SS组 12.1%(n=27), NS组 35.9%(n=80);在307位点上分布为AA组 12.1%(n=27), TT组 48.1%(n=108)，AT组 39.5%(n=88)。复等位基因型的分布上，NN680TT307(46.19%)、 SS680AA307(10.31%)、NS680AT307(32.29%)这三组复等位基因型出现的频率明显高 于其它等位基因组，具有显著差异性(P,0.01)。(见表3、图1) 表3 FSHR基因307及680位等位基因的分布 Table 3 The allelic combination frequencies for codon 680 and codon 307 of FSH receptor 总计 Ala307/Ala307 Thr307/Thr307 Ala307/Thr 307 0(0%) 103(46.19%) 13(5.83%) 116(52.0%) Asn680/Asn680 23(10.31%) 1 (0.45%) 3 (1.35%) 27(12.1%) Ser680/Ser680 4 (1.79%) 4 (1.79%) 72(32.29%) 80(35.9%) Asn680/Ser680 总计 27(12.1%) 108(48.4%) 88(39.5%) 223(100%) 9 上海交通大学医学院硕士毕业论文 NNAA NNTT NNAT SSAA SSTT 0 SSAT 32.29% NSAA 46.19% NSTT NSAT 1.79% 5.83% 1.79% 1.35% 0.45% 10.31% 图1 FSHR基因307及680位等位基因的分布 Figure 1 The allelic combination frequencies for codon 680 and codon 307 of FSH receptor 1(2 根据FSHR基因680及307位点多态性各分成三组，比较各组在不孕因素、窦卵 泡数、基础FSH值中的分布。 223例患者中，680及307位基因多态性改变在不孕因素的分布上均无显著性差 异(Pa=0.640;Pb=0.657)。在窦卵泡数比较中，680及307位各组基因型之间无显著性 差异(Pa =0.730;Pb=0.565);在基础FSH值比较中，SS680(8.9?2.5 IU/l)、AA307(8.6?1.3 IU/l)两组均比其余两组高，但无明显统计学差异(Pa =0.205;Pb=0.567)。(见表4、表 5) 10 上海交通大学医学院硕士毕业论文 表4 223例患者FSHR基因680、307位多态性在不孕因素中的分布 Table 4 Infertility factors subdivided according to the distribution of FSHR genotypes at position 680 and 307 680位基因多态性 307位基因多态性 NN680 SS680 NS680 AA307 TT307 AT 307 管性因素(%) 40 (34.5) 6 (22.2) 32 (40.0) 7 (25.9) 36(33.3) 35 (39.8) 男性因素(%) 38(32.8) 9 (33.3) 20 (25.0) 7 (25.9) 36 (33.3) 24 (27.7) 混合因素(%) 37(31.9) 12(44.4) 27(33.8) 13(48.1) 35 (32.4) 28(31.8) 不明原因(%) 1 (0.9) 0(0) 1 (1.3) 0(0) 1 (0.9) 1 (1.1) P 值 P=0.640 P=0.657 Pa为680位基因多态性的比较值;P b为307位基因多态性的比较值 表5 223例患者FSHR基因680、307多态性在基础FSH值、窦卵泡数中的分布 Table 5 Basal FSH levels and antral follicle count subdivided according to the distribution of FSHR genotypes at position 680 and 307 680位基因多态性 307位基因多态性 P值 P值 NN680 SS680 NS680 AA307 TT307 AT 307 窦卵泡数(个) 11.4?4.9 12.0?4.6 11.2?4.2 11.8?4.4 11.1?4.6 11.7?4.6 P=0.730 P=0.565 基础 FSH 值 8.1?2.5 8.9?2.5 8.0?2.1 P=0.205 8.6?1.3 8.1?2.5 8.0?2.4 P=0.567 (IU/l) Pa为680位基因多态性的比较值;P b为307位基因多态性的比较值 2. 174例长方案超排卵患者基因多态性的分布 2.1 比较680及307位点上不同基因型之间的临床资料 11 上海交通大学医学院硕士毕业论文 由表4可知，680及307位点的基因多态性在不孕因素的分布上无显著性差异(P, 0.05)。因此我们筛选了174例进行标准长方案超排卵的患者(116例患者行IVF治疗， 58例患者进入ICSI周期)，分析FSHR基因多态性与卵巢反应性的影响。 在 680 位三组基因型比较中，年龄、体重指数(BMI)、不孕时间、窦卵泡数、 促性腺激素使用天数，这些临床资料均无显著性差异(P,0.05)。 SS 组的基础 FSH 值(8.4?1.6 IU/l)明显高于 NN 组(7.4?1.8IU/l)和 NS 组 (7.4?1.6 IU/l)，具有显 著性差异(Pa=0.014;Pb=0.018)。在促性腺激素剂量的比较上，SS 组所需要的促性 腺激素( 2211?708IU)要高于 NN 组( 2081?641IU)及 NS 组(2077?590IU)，但 无显著性差异(P=0.640)。HCG 注射日血雌激素水平、子宫内膜厚度、获卵数的比 较上，SS 组各项指标值均要比 NN 组及 NS 组低，在统计学上无显著性差异(P,0.05)。 三组基因型受精率、卵裂率以及平均胚胎评分在统计学上无显著性差异(P>0.05)。 进入 ICSI 治疗的患者共有 58 例，其中 NN 组 25 例，占 43.1%，SS 组 9 例，占 15.5%， NS 组 24 例，占 41.4%，无显著性差异(P=0.065)。(见表 6) 12 上海交通大学医学院硕士毕业论文 表6 680位点上NN、SS、NS三组的临床资料及卵巢反应性的比较 Table 6 Characteristics of patients according to the codon 680 of FSHR genotypes NN(n=89) SS(n=24) NS (n=61) 总计(n=174) P值 51.1% 13.8% 35.1% 100% 31.1?4.1 31.3?3.5 31.4?3.3 31.2?3.7 P=0.873 年龄(y) 21.2?2.1 20.8?2.2 21.5?3.8 21.3?2.8 P=0.618 BMI 3.9?2.5 4.2?2.4 4.0?2.1 3.9?2.3 不孕时间(y) P=0.860 7.4?1.8 8.4?1.6 7.4?1.6 7.6?1.7 基础FSH值 Pa=0.014 (IU/l) Pb =0.018 窦卵泡数(个) 13.0?4.1 12.6?4.4 12.4?3.8 12.7?4.0 P=0.614 2081?641 2211?708 2077?590 2097?631 P=0.640 Gn剂量(IU) 11.8?1.5 11.8?1.7 11.5?2.1 11.7?1.8 P=0.552 Gn天数(d) 8971?4944 8278?4794 9001?5062 8886?4943 P=0.811 HCG日E2值 (pmol/l) 9.4?1.9 9.1?1.8 9.6?1.9 9.5?1.9 HCG日子宫内 P=0.434 膜厚度(mm) 13.8?6.4 12.8?5.9 15.0?7.6 14.1?6.8 P=0.348 获卵数(个) 72.1?22.6 76.3?20.0 75.6?19.9 73.9?21.3 P=0.504 受精率(%) 95.4?10.6 91.8?19.6 97.0?7.1 95.5?11.4 P=0.159 卵裂率(%) 胚胎累积评分 31.2?17.6 34.3?16.1 31.1?16.3 31.6?16.9 P =0.700 移植胚胎数 1.8?0.7 2.0?0.6 1.9?0.7 1.9?0.7 P=0.447 (个) 平均胚胎评分 17.0?6.1 18.2?11.5 16.1?5.4 16.9?6.9 P=0.476 25(43.1) 9(15.5) 24(41.4) ICSI比例(%) P=0.065 a为NN组与SS组比较;b为SS组与NS组比较;c为NN组与NS组比较;有显著性差异，具有统计学意义(P<0.05， ANVOA and 卡方检验)。 13 上海交通大学医学院硕士毕业论文 在 307 位三种基因型的比较上可以看到:AA 组、TT 组、AT 组在年龄、体重指 数、不孕时间、窦卵泡数的比较上均无显著性差异(P,0.05)。AA 组(8.6?1.4 IU/l) 在基础 FSH 值上明显高于 TT 组(7.5?1.8 IU/l)与 AT 组(7.3?1.6 IU/l)，具有显著 性差异(P a =0.004，P c =0.001)。在促性腺激素的使用天数、HCG 注射日血雌激素水 平、子宫内膜厚度、促性腺激素剂量的比较上三种基因型均无显著性差异(P，0.05)。 在获卵数上，AA 组(12.7?5.1)低于 TT 组(13.3?6.1)及 AT 组(15.6?8.0)，但无 显著性差异(P=0.063)。三组基因型受精率、卵裂率以及平均胚胎评分在统计学上无 显著性差异(P>0.05)。进入 ICSI 治疗的 58 例患者中 AA 组 10 例，占 17.2%，TT 组 22 例，占 37.9%，AT 组 26 例，占 44.8%，无显著性差异(P=0.057)。(见表 7) 14 上海交通大学医学院硕士毕业论文 307 307 307 表7 307位点上AA、TT 、AT三组的临床资料及卵巢反应性的比较 Table7 Characteristics of patients according to the codon 307 of FSHR genotypes AA(n=25) TT(n=83) AT(n=66) 总计(n=174) P值 14.4% 47.7% 37.9% 100% 30.1?3.5 31.5?4.0 31.2?3.5 31.2?3.7 P=0.636 年龄(y) 21.2?3.5 21.1?2.1 21.5?3.4 21.3?2.8 P=0.756 BMI 4.2?2.3 4.0?2.6 3.8?2.0 3.9?2.3 不孕时间(y) P=0.846 8.6?1.4 7.5?1.8 7.3?1.6 7.6?1.7 基础FSH值 P a =0.004 P c =0.001 (IU/l) 窦卵泡数(个) 12.6?3.9 13.2?4.1 12.7?4.0 P=0.551 12.2?4.2 2125?655 2022?566 2097?631 P =0.408 2204?714 Gn剂量(IU) 11.9?1.7 11.8?1.6 11.6?2.1 11.7?1.8 P=0.802 Gn天数(d) HCG 日 E2 值 8138?4015 8840?4704 9227?5554 8086?4944 P=0.642 (pmol/l) HCG 子宫内 9.3?1.8 9.5?1.9 9.5?2.0 9.5?1.9 P=0.908 膜厚(mm) 12.7?5.1 13.3?6.1 15.6?8.0 14.1?6.8 P=0.063 获卵数(个) 76.6?20.3 71.5?23.4 76.0?18.8 73.9?21.3 受精率(%) P=0.349 92.1?19.3 94.8?11.0 97.5?6.7 95.4?11.4 卵裂率(%) P=0.100 累积胚胎评分 35.9?14.3 31.5?17.2 30.0?17.4 31.6?16.9 P=0.335 移植胚胎数 2.1?0.4 1.9?0.7 1.8?0.8 1.9?0.7 P=0.331 (个) 平均胚胎评分 18.2?11.1 16.8?6.1 16.4?5.5 16.9?6.9 P=0.542 10(17.2) 22(37.9) 26(44.8) P=0.057 ICSI比例(%) a为AA组与TT组比较;b为TT组与AT组比较;c为AA组与AT组比较;有显著性差异，具有统计学意义(P<0.05， ANVOA and 卡方检验)。 2.2 680及307位基因多态性在OHSS发生组及非OHSS发生组之间的分布 15 上海交通大学医学院硕士毕业论文 经长方案超排卵的174例患者，根据临床表现、血生化指标、B超辅助检查，可以 分成OHSS发生组(n=22)及非OHSS发生组(n=152)。OHSS发生组与非OHSS发生 组相比，基因组NN、SS、NS在680位上的分布频率无显著性差异(Pa=0.394);同样 的，基因组AA、TT、AT在307位点上的分布频率在也无显著性差异(Pb=0.065)。等 位基因Asn680、Ser680在OHSS发生组及非OHSS发生组中的分布无显著性差异 (P>0.05);等位基因Ala307、Thr307在OHSS发生组及非OHSS发生组中的分布无显著 性差异(P>0.05)。(见表8) 表8 680及307位基因组及等位基因在OHSS发生组、非OHSS发生组的分布 Table 8 Genotypic and allelic frequencies for codon 680 and codon 307 of FSH receptor in OHSS patients and non-OHSS patients 基因组分布 等位基因分布 680位 307位 680位 307位 680 680 680 307 307 307 680 680 307 T307 NN SS NS AATT AT N S A 54.5% 4.6% 40.9% 0.0% 45.5% 54.5% 75.0% 25.0% 27.3% 72.7% OHSS (n=12) n=1) n=9) n=0) n=10) n=12) ) n=11) n=12) n=32) ((((((n=33(((组 50.7% 15.1% 34.2% 16.4% 48.1% 35.5% 67.8% 32.2% 34.2% 65.8% 非 (n=77) (n=23) (n=52) (n=25) (n=73) (n=54) (n=206) (n=98) (n=104) (n=200) OHSS 组 a b a b P值 Pa为680位基因多态性在OHSS发生组及非OHSS发生组中的比较值;P b为307位基因多态性在OHSS发生组及非 OHSS发生组中的比较值 2.3 680及307位基因组及等位基因在轻度OHSS、中重度OHSS组中的分布 表8中OHSS发生组中SS680的分布频率(4.6%)低于NN680(54.5%)、NS680(40.9%) 两组，在307位点上，OHSS发生组中AA307的分布频率低于TT 307(45.5%)、AT307 (54.5%)两组，根据Golan对OHSS的3度5级分类法(见表2)，将22例OHSS的患者分 成轻度、中重度两组，其中轻度11例，中重度11例。22例患者中SS68、 AA307这两组 基因组分布频率低于其余4组，但在轻度及中重度OHSS患者中的分布无显著性差异 (P>0.05)。等位基因Ser680、Asn680、Ala307、Thr307分布频率在轻度、中重度OHSS 16 上海交通大学医学院硕士毕业论文 上无显著性差异(P>0.05)。(见表9、图2)、 680、307位基因组及等位基因在轻、中重度OHSS患者中的分布 表9 Table 9 Genotypic and allelic frequencies for codon 680 and codon 307 of FSH receptor according to the clinical severity of the OHSS 基因组分布 等位基因分布 680位 307位 680位 307位 680 680 680 307 307 307 680 680 307 T307 NN SS NS AATT AT N S A 54.5% 0% 45.5% 0% 36.4% 63.6% 51.5% 45.5% 58.3% 46.9% 轻度 (n=6) (n=0) (n=5) (n=0) (n=4) (n=7) (n=17) (n=5) (n=7) (n=15) OHSS组 54.5% 9.1% 36.4% 0% 54.5% 45.5% 48.5% 54.5% 41.7% 53.1% 中重度 (n=6) (n=1) (n=4) (n=0) (n=6) (n=5) (n=16) (n=6) (n=5) (n=17) OHSS组 a b a b P值 a b P 为680位基因多态性在OHSS发生组及非OHSS发生组中的比较值;P 为307位基因多态性在OHSS发生组及非 OHSS发生组中的比较值 100% Asn680 80% Ser680 60% allelic Ala307 frequency 40% Thr307 20% 0% mild OHSS moderate and severe OHSS 图2 680、307位点等位基因在轻，中度OHSS患者中的分布 Figure 2 Allelic frequencies for codon 680 and codon 307 of FSH receptor according to eh clinical severity of the OHSS 17 上海交通大学医学院硕士毕业论文 2.4 680及307位基因型在妊娠结局上的分布 174 例长方案超排卵患者中，160 例患者进行新鲜胚胎移植(14 例患者进行全胚 冷冻)，最后共有 56 例临床妊娠，其中单胎妊娠 41 例，双胎妊娠 13 例，三胎妊娠 2 例。临床妊娠率在 680 位点上的分布分别为 Asn/Asn 组 33.3%(n=27)，Ser/Ser 组 34.8% (n=8)，Asn/Ser 组 37.5%(n=21);在 307 位点上的分布为 Ala/Ala 组 36.0%(n=9)， Thr/Thr 组 35.9%(n=28)，Ala/Thr 组 33.3%(n=19);基因多态性的改变在临床妊娠 率上无显著性差异(Pa=0.881，Pb=0.947)。(见表 10) (表10)680、307位基因多态性在临床妊娠率中的分布 Table 10 Distribution of FSHR genotypes at position 680 and 307 in clinical pregnancy rate 680位基因多态性 307位基因多态性 680 NN SS680 NS680 AA307 TT307 AT307 临床妊娠率 33.3% 34.8% 37.5% 36.0% 35.9% 33.3% (27/81) (8/23) (21/56) (9/25) (28/78) (19/57) Pa=0.881 Pb=0.947 P值 Pa为临床妊娠率在680位多态性中比较;Pb为临床妊娠率在307位多态性中比较 18 上海交通大学医学院硕士毕业论文 讨论 在辅助生育技术中，IVF-ET经过30多年的发展，目前已经达到较成熟的水平， 但IVF-ET术后的临床妊娠率仍维持在30%左右，分娩率不超过20%[7]，另一方面在为 患者解决不孕问题的同时，其安全性及危险性一直受到人们的关注，包括医源性的 卵巢过度刺激综合征、卵巢扭转、血栓形成、出血、感染等。如何能够在避免，或 者减低医源性并发症危害的同时提高IVF-ET的成功率，这是目前全世界的生殖医学 专家都在研究的课题。目前发现在IVF-ET过程中评估卵巢的反应性是整个周期中至 为关键的一项内容，因为能够准确预测不同个体的卵巢反应性，对于临床超排卵药 物剂量的选择将是非常有价值的，可以根据预测结果选择合理的剂量来获得理想数 目及质量的卵子，同时预防医源性卵巢过度刺激综合征的产生。目前，临床上通常 根据患者的年龄和基础FSH值来预测患者卵巢的反应性。但是基础FSH值即使在同一 个个体中也会随着所处月经周期的不同而发生波动，因此能够找到不随月经周期变 化而能够预测卵巢反应性的指标是十分具有临床意义的。FSH是女性最重要的生殖激 素之一，能够促进卵泡的生长发育及促进雌激素的产生，通过与其特异性的受体 (FSHR)结合而发挥生理作用。已有的研究发现，卵巢对促性腺激素的反应性受遗 传基因调控，在FSHR基因中发现单核苷酸多态性(SNP)，与进行辅助生殖技术中的 卵巢刺激反应有一定联系。 自从Aittomaki等首先描述FSHR基因外显子10上的两种异义的单核苷酸多态性 Asn680Ser， Ala307Thr 以来，目前已经有许多关于FSHR多态性的报导。根据FSHR基 因在680及307位点上的不同基因型可以形成四种等位基因型:等位基因TN，等位基 因AS，等位基因ST和等位基因NA。其中等位基因NT和SA是普遍存在的，在人群中 发生率约为95,，而NA及ST在不同人种中的发生率都较低。Simoni等通过DNA PCR 实验发现，在欧洲白种人和新加坡华人中，FSHR基因多态性表达中最常见的是NT 型等位基因，均为60%左右，而和欧洲白种人相比，新加坡华人中SA型等位基因型 19 上海交通大学医学院硕士毕业论文 的发生率比较低。对于ST和NA这两种在理论上存在的等位基因型的比较上，而在新 加坡华人中的发生率均比欧洲白种人高。Satoko Sudo [8]等对522名日本女性的研究发 现，和白种人相比， NT型(64.5%)发生频率明显高于SA型 (33.5%)，这与Simoni 等的研究是一致的。在我们对223例中国不孕女性的研究发现，中国女性等位基因中 纯合子NN680TT307型(46.19%)、杂合子NS680AT307型(32.29%)、纯合子SS680AA307 型(10.31%)的发生频率明显高于其它几组，没有发现纯合子NN680AA307型，纯合 子SS680TT307型仅占0.4%(见图1)。这与之前的报道相一致的结论，表明在不同人种中， FSHR基因中Asn680主要与Thr307连锁，Ser680主要与Ala307连锁。但目前报道的样本量 均在600人以下，尚未见更大量样本及更多人种的相关报道，因此在进行FSHR多态 性的比较上为避免人种背景差异，许多研究中心都集中于同一人种的比较。 FSHR基因680位多态性已经成为了研究的热点。Sudo等 (2002)对522名日本女 [9] 性的研究中发现NN型占41%，SS型占12%，NS型占47%;Laven等 (2003)对148名 NS型占45%;同样对于欧洲人种 荷兰女性的研究中发现NN型占16%，SS型占39%， 的研究，Dimitris 等[10] (2006)对125名希腊女性的研究发现NN型占27%，SS型占34%， NS型占35.9%。在我们的研究中发现，在680位点上NN型占52.0%，SS型占12.1%， NS型占37.5%(见表2)。这与Sudo等对日本女性的研究结果相似，与Laven和Dimitris 对680位多态性在欧洲人群分布的研究有一定的差异，表明在FSHR基因680位多态性 的分布存在人种差异，但目前还没有研究将这种人种差异有效的进行量化。目前不 同人种的研究中却得出了一个相似的结果:基础FSH值在680位基因多态性上具有显 著性差异。基础FSH值通常指的是月经周期第2~3天血FSH的水平，当卵巢储备下降 时卵巢抑制素产生下降，对垂体的抑制作用减弱，垂体分泌FSH增加，因此基础FSH 的上升，预示了卵巢储备的下降，对外源性促性腺激素的刺激反应低下[11]。Jong Kwan Jun等[12]对行IVF-ET的韩国女性的研究中，SS型患者基础FSH值(8.2?0.9 IU/l)明显高 于NN型(5.7?0.3 IU/l)及NS型(6.3?0.3 IU/l)(P,0.01);同样在Dimitris及Jorg Gromoll 等[13]的研究也得出了同样的结论。在我们长方案超排卵的174例患者中，SS组的基础 FSH值(8.4?1.6 IU/l)明显高于NN组(7.4?1.7 IU/l)及NS组 (7.4?1.6 IU/l)，具有 显著性差异(Pa=0.014;Pb=0.018)。(见表6)。在整个超排卵的过程中SS组需要更多促 20 上海交通大学医学院硕士毕业论文 性腺激素,在HCG注射日，SS组中的血雌激素水平、获卵数均要比其它两组低，但在 统计学上无显著性差异(P,0.05)。表明在整个超排卵过程中，具有SS基因型的FSHR 对FSH的作用可能存在一定程度的“抵抗”或敏感度下降，导致FSH与靶细胞有效作用 的阈值升高，因此需要更多的促性腺激素才能达到与其它两组相同的超排卵效果， 表明卵巢储备功能下降。Hermann等[14]进行的研究中，对NN及SS组分别予以150IU/d FSH后，发现SS组女性中的血雌激素明显低于NN组，当将SS组的FSH增加至225IU/d， 这种低反应才被纠正，该项实验不仅证实了之前的结论，同时还表明FSHR基因多态 性与卵巢敏感性的关系需在大剂量外源性FSH刺激时才能被证实。对引起这种低反应 现象的可能机制为，FSHR 羧基末端含有大量Ser和Thr残基，认为是发生磷酸化反应 的潜在底物,在680位上，Ser残基可以发生磷酸化而影响受体活性，而Asn残基可引 出发生糖基化的保守序列，对受体蛋白在细胞表面表达起重要作用，因此在FSHR 羧 基末端氨基酸的Asn?Ser改变会降低受体的结合力，减弱信号的传递，从而降低 FSHR生物学活性，影响激素与靶细胞的作用，导致血清高FSH值，产生卵巢低反应。 既然SS680基因型倾向于导致卵巢低反应，因此我们可以推测具有NN680基因型的 FSHR是否易导致卵巢高反应，引起更多卵巢过度刺激综合征(OHSS)的发生。我 们对22例发生OHSS的患者与152例未发生OHSS的患者进行比较，发现680位基因多 态性在这两组中的分布没有显著性差异(P=0.394)(见表8)。这与Catarina[15]等及 Kerkela[16]等人的研究结果相一致，表明FSHR基因680位多态性的改变与OHSS的发病 无关。这与之前所得到的结论:SS680基因型易引起卵巢低反应产生了矛盾，可能的 解释就是Ser680增加卵巢刺激中发生异常反应的风险，最后造成低反应还是高反应还 可能与其它基因的多态性有关，即决定卵巢反应敏感性的基因不在FSHR上，FSHR 的多态性仅构成其中一个基因标志，其与临近的某个或多个基因之间形成连锁不平 衡，导致卵巢对外源性FSH刺激的不同反应。在发生OHSS的22例患者中，根据Gloan 等人的3度5级标准,轻度OHSS患者有11例，中重度OHSS患者有11例，通过对FSHR 基因680位上等位基因分布频率的比较(见表9)，可以发现，中重度OHSS患者中的Asn680 (48.5%)的分布频率与轻度OHSS组中的分布频率(51.5%)相接近,没有显著性差 异(P=0.728)，这与Caroline等[17]的研究结果不一致，在她们的研究结果中680位多态 21 上海交通大学医学院硕士毕业论文 性的改变与OHSS的发生无关，但Asn680在中重度OHSS组中的分布明显高于其在轻度 OHSS组的分布，表明Ser680Asn多态性不能预测卵巢反应性，但Asn680可以预测发生 OHSS严重程度的一项指标。由于样本量的大小以及人种的差异，对于这个结论还是 需要进一步论证。 在 307 位多态性的比较上，Achrekar 等[18]在印度女性中发现， AA 型占 14%， TT 型占 24%，TA 占 68%，我们的研究结果与之相似，AA 型占 12.1%，TT 型占 48.4%， TA 型占 39.5%见(表 3)，表明在亚洲人群中 307 位上多态性分布可能以纯合子 TT307 和杂合子 AT307 为主。在年龄、体重指数、不孕时间、窦卵泡数、促性腺激素使用天 数上均无显著性差异(P>0.05)。AA 组(8.6?1.4 IU/l)的基础 FSH 值明显高于 TT a =0.004;P c =0.001) 组(7.5?1.8 IU/l)与 AT 组(7.3?1.6I U/l)，具有显著性差异(P (见表 7)。在 HCG 注射日，AA 组的血浆雌激素水平、子宫内膜厚度、获卵数均要比 其它两组低，无显著性差异(P,0.05)。这与 680 位上得到的结果是相同的。同样， 我们也可以推测 AA307 基因型是否能成为预测卵巢低反应的一项指标。由于之前的研 究肯定了 Ala307 主要与 Ser680 连锁，而 Ser680 增加了卵巢刺激中发生异常反应的风险， 因此 AA 组中的卵巢低反应是 680 及 307 两个位点的协同作用还是拮抗作用尚需进 一步实验证实。Achrekar 等人还发现 AA307 组的妇女中有 85%的可能性会发生 OHSS， 增加了 OHSS 的发生风险，而我们的研究提示 307 位多态性的改变与 OHSS 的发生 无显著性差异(P=0.392)。由于对于 307 位多态性的研究相对较少，因此将来还需 要更大样本的临床资料来证实 AA307 基因型与卵巢反应性的关系。 目前临床上用来判断影响IVF-ET妊娠成功率的因素主要包括反映移植胚胎质量 的衡量指标—胚胎评分;作为子宫容受性的评价指标—HCG日子宫内膜的厚度;患 者年龄以及卵巢反应性。Ellen R.Klinkert等[19]对105例选择长方案进行IVF治疗的女性 的研究发现，FSHR基因多态性改变与卵巢反应性无关，但在临床妊娠率中，SS680 基因型明显高于NN680型及NS680型，三者之间有显著统计学差异(P=0.008)。在我们 的研究中，FSHR基因多态性的改变同样与卵巢反应性无关。由表6及表7可见，680 及307位多态性的改变在患者年龄、胚胎平均评分、HCG日子宫内膜厚度的比较上均 无显著性差异(P,0.05)。SS680组及AA307组中虽具有较高的获卵数、受精率及胚胎 22 上海交通大学医学院硕士毕业论文 平均评分，但与其它各组比较无统计学意义(P,0.05)。680及307位多态性的改变在 临床妊娠率的比较上无显著性差异(P,0.05)，与其余几组相同，临床妊娠率均在 30%-40%之间。因此，临床妊娠成功是众多因素共同作用的结果，不可能依据某种 单一的因素来决定，目前没有一明确的标志物来预示妊娠结局。 综上所述，本研究结果提示，FSHR基因680、307位多态性的改变与卵巢反应性 之间无明确影响，在临床妊娠率的比较上，FSHR基因多态性的改变同样无显著性差 异。但是，由于实验方法和种族的差异，在一些实验结论上还存在争议。例如，FSHR 不同基因型显示出的活性差异(包括降调节、亲合力、受体表达的改变)还没有完 全得到实验证明; FSHR基因附近是否有其它基因多态性，形成连锁不平衡进而影响 卵巢反应;不同人种间多态性的分布是否存在一定量化关系等。在将来的研究中， 可以通过颗粒细胞等合适的细胞进行体外培养或者基因敲除技术来明确FSH刺激敏 感性差异的机制，使FSH受体基因多态性能够在辅助生育技术中对促性腺激素剂量的 选择提供依据，优化不孕症的治疗，同时能够减少或者预防OHSS的产生，在减少治 疗费用的同时提高IVF /ICSI的成功率。 23 上海交通大学医学院硕士毕业论文 结论 1. FSH 受体基因多态性中，Thr307 主要与 Asn680 连锁，Ala307 主要与 Ser680 连锁。 2. FSH 受体基因 680、307 位多态性在不孕因素中无显著性差异。 3. FSH受体基因中，多态性SS680的基础FSH值显著高于NS680及NS680;多态性AA307 的基础FSH值显著高于TT307及AT307。 4. FSHR 基因多态性 Asn680Ser、Thr307Ala 不能作为预测卵巢反应性的指标。 5. FSHR 基因 680、307 位多态性在临床妊娠率上无显著性差异。 24 上海交通大学医学院硕士毕业论文 参考文献 [1] Simoni M,Nieschlag E,Gromoll J. Isoforms and single nucleotide polymorphisms of theFSH receptor gene:implications for human reproduction [J]. Hum Reprod ,2002,8(5):413-421 [2] Alfredo UA,Carlos T. Structure-function relationship of follicle-stimulating hormone and its receptor [J].Hum Reprod,1998,4(3):260,283 [3] Joop SE,Annemarie GM, Dwi AS,et al. Follicle-stimulating hormone receptor polymorphisms in women with normogonadortropic anovulatory infertility [J]. Fertil Steril,2003,80(4):986-992 [4] Asatiani K,Gromoll J,Eckardstein SV,et al.Distribution and function of FSH receptor genetic variants in normal men [J].Andrologia,2002,34(3):172,176 [5] Axel PN. 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FSH receptor genotype is associated with pregnancy but not with ovarian response in IVF [J].Reprod BioMed ,2006,13(5):687-6957 26 上海交通大学医学院硕士毕业论文 致谢 值此论文顺利完成之际，我要向两年来给与我关心、鼓励和帮助的诸多老师、 同学和我的家人致以深深的谢意。 在此谨向我尊敬的导师孙晓溪主任致以诚挚的谢意～两年来，孙老师在学习、 工作和生活上给与了我无数细心的关怀与教诲，导师开拓进取的创新精神，严谨求 实的治学态度、渊博的理论知识、敏锐的科研思路、宽以待人的处世态度一直影响 着我，令我收益匪浅，将成为我永远的学习榜样。值此，我在体会着成长与进步的 快乐时，却发现任何文字都难以表达我对恩师的感激之情，谨祝恩师身体健康，工 作顺利，桃李满天下～ 感谢国际和平妇幼保健院科教科的漆琨老师、高永涛老师、张黎文老师等医学 院各位老师的关心和帮助。 感谢国际和平妇幼保健院生殖中心全体老师在我的课题研究中给予的无私支 持。 衷心感谢将在百忙中抽出时间审阅本论文的专家教授，感谢各位老师对我的论 文提出宝贵建议，为我今后的学习和研究开拓思路。 感谢师姐王娴静、严晓、陈丹妮等的关心和帮助，大学期间朝夕相处的同学也 是宝贵的财富，感谢室友让我得到了日积月累的真挚友情。 最后，特别感谢我的父母和家人养育和栽培之恩无以回报，你们给予我极大的 支持、鼓励和帮助，让我无后顾之忧安心学业，祝愿你们永远健康快乐～ 27 上海交通大学医学院硕士毕业论文 附录 1 在校期间发表文章 《卵泡刺激素受体基因多态性的研究进展》， 《国际生殖健康/生育杂志》, 已接受, 第一作者 28 上海交通大学医学院硕士毕业论文 附录 2 综述 卵泡刺激素受体基因多态性的研究进展 夏丽娜综述孙晓溪审校 【摘 要】卵泡刺激素是人类重要的生殖激素，通过其受体介导生理功能。目前在卵 泡刺激素受体基因中发现大量单核苷酸多态性，特别是Asn 680Ser，可能影响受体活 性，引起卵巢功能差异，并与辅助生殖技术中的卵巢刺激反应有一定联系。为进行 卵巢刺激的患者测定基因多态性，定做个体化的卵巢刺激方案具有临床意义，可以 优化不孕症的治疗，减少医源性疾病的产生，但仍需要更多的临床实验来检验其有 效性。 【关键词】卵泡刺激素受体;基因多态性;卵巢反应;卵巢过度刺激综合征 Advance on Gene Polymorphism of Follicle Stimulating Hormone Receptor XIA Li-na，SUN Xiao-xi. The International Peace Maternity & Child Health Hospital, School of the Medicine, Shanghai JiaoTong Universit，Shanghai 200030，China 【Abstract】Follicle stimulating hormone(FSH)plays an important role in human reproduction，and its action is mediated by FSH receptor.Up to date,researches investigated that single nucleotide polymorphisms(SNPs) of follicle stimulating hormone receptor,especially gene polymorphism at position 680, may be a predictive genetic marker of ovarian hyper- or hyporesponse of corresponding COH cycles.However,further studies are necessary to determine whether it is possible to apply this relationshiop to the 29 上海交通大学医学院硕士毕业论文 pre-cycle evaluation of individual genetic predisposition in terms of prevention either ovarian hyperstimulation syndrome(OHSS)or a low ovarian response. 【Key words】Follicle stimulation hormone receptor;Single nucleotide polymorphism;Ovarian response;Ovarian hyperstimulation syndrome 卵泡刺激素(follicle stimulating hormone， FSH)是人类重要的生殖激素， 通过卵泡刺激素受体(FSH receptor，FSHR)介导其生理功能。早期对FSHR基因的 研究多集中在基因突变上，但在自然界中基因突变的发生率极低，而FSH受体FSHR基 因多态性在人群中的分布较广，可能影响受体活性，引起卵巢功能差异，并与辅助 生殖技术(ART)中的卵巢刺激反应有一定联系。本文将对FSHR基因多态性的研究进 展进行综述。 FSHR的功能、结构和信号传导机制 FSH是人类重要的生殖激素,生理作用主要为:?直接促进卵泡的生长、发育和 成熟。?和促黄体生成激素(luteinizing hormone，LH )共同作用使卵泡分泌雌 激素。?促进精原细胞的增生以及正常精子的产生。其生理功能通过表达在卵巢颗 粒细胞以及睾丸Sertoli细胞表面的受体来介导。FSHR是属于G蛋白偶联受体超家族 中的成员,由3部分构成:具有氨基端的细胞外域，由3个细胞内环和3个细胞外环相 连接形成的7次跨膜区域以及具有羧基端的细胞内域[1]。细胞外域具有与FSH结合的特 异结合区，细胞内域含有大量的丝氨酸(serine Ser)和苏氨酸(threonine Thr) 残基。FSHR信号传导的主要途径是激活环磷腺苷(cAMP)的产生，导致特定阶段的 mRNA转录。近来的研究表明，还可能存在其他信号传导途径，包括细胞内钙离子的 产生、有丝分裂原蛋白激酶(MAPK)途径,以及肌醇三磷酸(IP3)的产生，但是这 些信号传导途径的生理作用目前还未能肯定[2]。 FSHR基因的特点 一、FSHR基因的构成和位置 FSHR基因为单拷贝基因，位于人染色体2p21,p16区，有54k碱基的核间距，可 以编码695个氨基酸残基。该基因链中包含了10个外显子和9个内含子，每个外显子 30 上海交通大学医学院硕士毕业论文 和内含子间均为典型的边界序列，mRNA剪接修饰后全部留在外显子上。其中第1,9 外显子编码细胞外域，第10外显子编码细胞外域的羧基端、跨膜区域以及细胞内域[3]。 二、FSHR基因突变的类型 FSHR基因上突变基因存在活性突变和失活突变两种 [4]。活性突变仅在切除垂体 后仍有精子发生的男性中发现 ，突变的基因有Asp567Asn和Thr449Ala两种，位于跨 膜区域。失活突变可存在细胞的不同位置，细胞外域中有Ala189Val、Lle160Thr、 Asn191Lle、Asp224Val和Pro346Arg，这些突变能完全改变受体结构，导致信号传导 发生障碍，不介导生理功能;跨膜区域的失活突变Ala419Thr、Arg573Cys和 Leu602Val，使受体功能降低，减弱信号传导，但对大剂量的激素刺激还是有反应的。 女性中的失活突变可降低受体与FSH的结合力，减弱信号传导，导致卵巢性不孕，男 性中，失活突变可能会造成一定程度的生精功能障碍，但不会引起精子缺乏或者不 育 [4]。因此，失活突变在性别、部位、程度、功能序列上的改变都与临床表现有关。 十余年研究表明，自然界中FSHR基因突变率极低[5]。通过基因芯片技术检测在 FSHR基因中发现大量单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)，可 能影响受体生物学活性，引起卵巢功能差异，近来已成为研究的热点。 FSHR基因多态性的特点 一、FSHR基因多态性的组成 FSHR基因上存在,700个同义或异义的SNPs，平均每个SNP的核间距是282k碱基， 大部分SNP位于内含子上，1个位于启动区，5个位于外显子10上，外显子上的5个SNP 都是单个碱基的置换，编码相应的氨基酸置换位点(Ala307Thr,Arg524Ser， Ala665Thr,Ser680Asn)，在392位上的SNP是沉默不表达的。目前被大家熟知的两种 异义SNP由Aittomaki等首先描述，都存在外显子10上。细胞内域的680位密码子，当 碱基A代替G(AGT?AAT)时，丝氨酸(Ser)变成天门冬氨酸(Asn)，对应的SNP为 G2039A;细胞外域的307位密码子，当碱基A代替G(GCT?ACT)时，丙氨酸(Ala) 变成苏氨酸(Thr)，对应的SNP为G919A [4-6]。这2个SNP可以形成4种等位基因: Thr307-Asn680(等位基因TN)， Ala307-Ser680 (等位基因AS)，Thr307-Ser680(等位基 因TS)和Ala307-Asn680(等位基因AN)。等位基因 TN和AS在人群中发生率约为95,， 31 上海交通大学医学院硕士毕业论文 而AN及TS在不同人种中的发生率都较低[5]。Simoni等发现，欧洲白人及新加坡华人中 多态性表达主要是TN和AS型，其中TN型最为常见，均占60,左右。Sudo等[6]对日本女 性研究发现，和欧洲白人相比，亚洲人群中TN型发生频率明显高于AS型，多态性分 布可能存在人种差异，目前尚无全面的、更大样本的对不同人种的多态性分布进行 比较的报道。 二、FSHR基因多态性在性别中的表达 Thr307主要和Asn680 连锁，Ala307主要与Ser680连锁[7]。Pengo等[8]对288例健康白人 男性680位多态性研究发现，精液参数、基础FSH值、睾甾酮和抑制素B水平，在 Asn680Asn、Asn680Ser、Ser680Ser 3组比较上无明显差异。FSHR基因多态性对男性不育 症的分析没有意义，不能作为预测FSH作用的一项指标。Asatiani等的研究也证实以 上结论。而de Koning等[9]研究表明，FSHR基因多态性Asn680Ser与女性卵巢功能有关。 因此，目前的研究都集中在Asn680Ser多态性与卵巢功能的联系上。 三、FSHR基因多态性的作用机制 FSHR基因羧基末端含有大量Ser和Thr残基，认为是发生磷酸化反应的潜在底物。 理论上，羧基末端氨基酸的改变会降低受体的结合力并且减弱其信号的传递，从而 降低FSHR生物学活性，导致血清高FSH值。Ser或Asn构成FSHR基因680位密码子，Ser 残基可以发生磷酸化影响受体翻转，Asn残基可引出发生糖基化的保守序列，这可能 对受体蛋白的翻译后加工及表达于细胞表面起重要作用[10]。FSHR基因680位的两个基 因亚型的亲和力不同，可以导致受体不同的生物学活性，影响激素与靶细胞的功能。 另外也有研究推测，真正影响基因不在FSHR基因上，FSHR基因的多态性仅构成 一个基因标志，与其临近的某个真正的影响基因之间存在连锁不平衡，导致卵巢功 能差异的形成。 FSHR基因多态性与卵巢功能的关系 一、FSHR基因多态性与卵巢源性疾病的关系 Sudo等发现NS680基因型在多囊卵巢综合征(PCOS)患者中的分布显著高于正常患 者组(P ,0.05)。Laven等[5]对PCOS患者基因型的分析也支持Sudo的结论。,,é,,,,,é 32 上海交通大学医学院硕士毕业论文 ,,,,等[10]却发现PCOS患者中，多态性的分布没有意义，卵巢早衰(premature ovary failure,POF)与基因多态性也没有对应关系。可见，这些卵巢疾病与FSHR基因多态 性是否有关联，尚需要进一步验证。 二、FSHR基因多态性与IVF中卵巢反应性关系 许多研究显示在体外受精(IVF)中FSHR基因多态性，特别是Asn680Ser，与ART 中的卵巢刺激反应有一定联系，影响正在接受IVF治疗的患者的卵巢应答情况及妊娠 结局。Loutradis等[11]在进行IVF治疗的女性中发现，卵巢功能不良(ovarian dysfunction，OD)者中SS680基因型的分布高于NS680及NN680(分别为45.5%、22.7,、 680 31.8,)，而在卵巢反应良好者(good response，GR)中NS 型的分布和明显高于 其余两组。同样的，Jun等[12]对韩国行IVF-ET的女性(排除PCOS、子宫内膜异位症以 及卵巢手术史)研究发现， SS680组的基础FSH 值显著高于NS680及NN680组，促排卵过程 组的血雌激素低于其余2组。 中SS680组需要更多的促性腺激素,但在hCG注射日，SS680 这些研究结果表明在IVF促排卵过程中，具有SS680基因型的受体易产生卵巢低反应， 对FSH的作用可能存在一定程度的“抵抗”或敏感度下降，导致FSH与靶细胞作用的阈 值升高，需要更多的促性腺激素才能达到同样的效果[13]，这与Gromoll等[14]的研究结 论相同。现有的卵巢刺激方案，可能会使一些患者接受过量FSH刺激，有产生卵巢过 度刺激综合征(OHSS)的危险。Daelemans等[15] 则通过对IVF后发生OHSS、未发生OHSS 680 及对照组女性的研究中发现,OHSS发生人群中Ser 分布频率明显增多。这个结论是出 乎意料的，之前的研究表明，Ser680在卵巢低反应中发生率高。可能的解释是FSHR基 因680位多态性与OHSS的发病无关，Ser680增加卵巢刺激中发生异常反应的风险，最后 引起卵巢低反应还是高反应还可能与其他基因的多态性有关。,,,,,,等[16]及 等[17]的研究结果也表明FSHR基因680位多态性的改变与OHSS的发病无关。 Daelemans等还发现Asn680在重度OHSS组中的分布显著高于其在轻度、中度两组的分 布，认为 Asn680可以作为预测OHSS严重程度的一项指标。在妊娠结局的比较上，目前 的研究结果还存在不同争议。Jun的研究中，NN680基因型的临床妊娠率高于SS680及NS680 型。Ellen等[18]发现，SS680基因型在临床妊娠率及胚胎移植率中均明显高于NS680及NN680 33 上海交通大学医学院硕士毕业论文 型(P值分别为0.008及0.003)。 另外, FSHR基因的其他多态性位点上也有一些研究成果。Achrekar等[19]通过对 印度裔女性的研究，发现在307位上,与TT307,TA307组相比，AA307基因型易引起卵巢高反 应，增加OHSS的发生风险。Binder等的研究表明，杂合子Thr160/ Ile160在进行ART人 群中表达率低，可能是导致不孕的因素之一。 为每例患者量身定做个体化的卵巢刺激方案是非常具有挑战性的，通过为即将 进行卵巢刺激的患者测定基因型，根据卵巢敏感度基因的不同而给予个性化的FSH剂 量，减少OHSS等医源性疾病的产生。由于研究方法和人种的差异，目前的研究结果 中还存在一些争议，仍需要更大样本量，更多人种参与的临床实验来证实在卵巢刺 激前测定FSHR基因多态性作为一项常规诊断的有效性。 总之，FSHR基因多态性与卵巢功能的相关性的研究还处在基础阶段，许多研究 发现FSHR基因Ser680Asn多态性与IVF中卵巢反应有关，但尚需进一步全面的研究来证 实是否为直接影响因素。例如采用颗粒细胞等更合适的细胞进行体外培养实验或寻 找FSHR基因附近是否有其他影响基因。遗传药理学的出现则开创了以单个患者遗传 易感性(genetic predisposition)为基础改善用药合理和不合理之间平衡的新研 究领域[20]。明确FSH刺激敏感性差异的机制，能够有助于更好地治疗一些卵巢源性疾 病，同时在ART中针对不同的个体应用最优化的卵巢刺激方案，预防并发症的发生， 减少治疗费用，提高IVF的成功率。 34 上海交通大学医学院硕士毕业论文 参考文献 [1] Ulloa-Aguirre A, Timossi C. 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