甲醛固定石蜡包埋组织DNA检验2例

甲醛固定石蜡包埋组织DNA检验2例 , / , 中国人民公安大学(自然科学版) 2006箜塑0'鱼』堕生墨塑盟巫!ndTechnology)总第5O期Sum50 0引言 甲醛固定石蜡包埋组织DNA检验2例 袁丽,鲁涤,杨雪 (中国政法大学证据科学教育部重点实验室(筹),北京100040) 在一些民事案件(如商业保险骗保案,医疗 纠纷案)中,成功对石蜡包埋组织进行DNA分型 来判断其归属问,对于案件解决至关重要.而目 前国内医院及科研机构大多使用10%普通甲醛固 定人体组织,DNA降解严重,提取高质量的DNA 并进行PCR—STR分型较为困难.本文作者对日常 受理案件中2例甲醛固定石蜡包埋组织进行DNA ,现报道如下. 1案例 案例1:李某,男,在一家医院行肠镜检查, 病理诊断为直肠腺癌,之后行直肠癌根除术,但切 除组织经病理检查未发现有病变.故李某将术前诊 断为直肠腺癌的切片和蜡块借出,到本室要求将术 前蜡块组织与其本人比对,判断是否为同一个体, 从而确定院方有无医疗过错. 案例2:姚某,女,在一家医院诊断为子宫原 位癌,并行子宫次全切除术.术后病理检查未发现 有癌变.因此姚某将这家医院告上法庭,对被告医 院提供的蜡块是否为其本人组织样本有疑问,法院 委托本室进行鉴定.经双方同意选取一块诊断为原 位癌的蜡块包埋组织与姚某的血液样本进行同一认 定. 2方法 2.1预处理 挖取小米粒大的石蜡包埋的组织,尽量剔除组 织周围石蜡,放人0.5mL离心管中.加入5001xL DDW,65~C保温10min脱蜡,弃除液体.同时设 置蜡块空白处对照样本. 2.2DNA的提取 向每个离心管中加入1501xL的5%Chelex一 100和41xLPK(20mg/mL),56保温过夜,次13 再加21zLPK(20mg/mL),再消化4h,振荡后, 100?8min,130o0rp?min离心3min,4~C备用. 人血液样本经Chelex一100提取法提取样本DNA. 2.3PCR扩增 采用Identifiler荧光复合扩增.采用101xL反应 体系,热循环条件:95预变性11min;94~C 1rain,59?1min,72?1min,循环次数为3O次, 最后60~C延伸45min.同时扩增9947A阳性对照, 水和蜡块空白对照. 2.4上样检测 取1.5IxLPCR产物与121xL甲酰胺(for- mamide),0.4L内标(LIZ)混合后,经过ABI 310DNA自动测序仪电泳荧光检测,使用GeneS. can(3.1.2)和Genotyper软件分析得出基因分型 结果. 2.5线粒体测序 在上样检测后发现案例1中甲醛固定石蜡包埋 组织DNA分型不理想,进而对其线粒体DNA (MitochondrialDNA,简称mtDNA)测序.首先, 用mtDNA高变区I(HVI区)引物扩增提取的组 织和人血样本DNA,扩增产物纯化后用BigDye试 剂盒进行正,反向测序反应,测序反应产物在ABI 3100型遗传分析仪上检测. 作者简介袁丽(1971),女,江西九江人,硕士,主要从事法医DNA工作. - 34? 丽鲁涤杨雪:甲醛固定石蜡包埋组织DNA检验2例 3结果 两案件中蜡块组织PCRSTR分型结果见图1 和图2. 案例1中只有小片段的STR基因座有分型, 且与李某比对样本同一基因座的等位基因分型不 同.线粒体DNA测序结果:测得蜡块组织的mtD- NAHVI区轻链序列:16212G,162233',16227G, 16234T,16278T,16309G,16362C;比对样本 mtDNAHVI区轻链序列为:16129A,16223T, 16362C. 案例2中甲醛固定石蜡包埋组织得到完整的 PCR—STR分型结果,与姚某血液DNA分型一致. 一_I?暮 ,参 攀一._l_|攀 图1案例1腊块组织PCR—STR分型结果 一 露 … 蔓}:= 蔫擘 …?釜蔓鬣童蕊 图2案例2腊块组织PCR—STR分型结果 4讨论 与从新鲜组织中提取基因组DNA相比,从普 通甲醛固定石蜡包埋组织中DNA提取质量较差. 本文中对蜡块处理较为简便,直接挖取小米粒组织 并尽量剔除石蜡,65~C保温熔化沾附在组织上石 蜡,并弃除液体,排除石蜡的干扰.在提取过程 中,增加PK的用量,过夜消化,充分提取DNA. 有研究明…,10%普通甲醛固定4天以内的人体 组织,DNA被破坏程度低,基本上能检出完整的 STR基因型.在案例2中,蜡块组织能得到完整的 分型,与其固定时间短有关,而在案例1中的蜡块 组织无论怎样优化提取和扩增方法,仍得不到满意 的图谱,影响DNA模板的完整性及扩增效率,原 因可能是:(1)普通甲醛易在空气中氧化成甲酸 而偏酸性,DNA在酸性环境中不稳定,易降解; (2)在固定过程中,嘌呤基之间及碱基与组蛋白 之间形成甲基桥,造成DNA的交联,DNA变性时 双链无法打开,影响PCR扩增.随着普通甲 醛固定组织时间的延长,检出率降低,并出现等位 基因不平衡扩增,丢失,Pull—up峰等现象,此时 应综合考虑,谨慎判读,不能仅依据峰高的有效域 值来判定结果. 线粒体DNA具有高拷贝,高灵敏度的特点, 适合于降解和微量检材的检验.碱基多态性主要存 在线粒体DNA控制区的二个高变区(HVRI和 I1),具有高度的个体差异性,尤其是HVRI,同一 人群不同个体问存在差异,人群与人群也存在差 异,这种序列多态性可用于个体识别.线粒体 DNA测序在案件1中发挥了重要作用,当不能获 得理想的蜡块组织PcR—STR分型时,对线粒体 DNA测序,蜡块组织和李血液的HVRI序列不 一 致,可以排除蜡块组织是李某的组织二者 线粒体DNA序列一致,则应了解线粒体DNA单倍'\,一 型的统计学群体数据,并充分考虑到线粒体DNA 母系遗传的特点. 参考文献 [1]王坚,刘开会,徐俊波,等.不同染色切片及不同组 织固定方法对检测STR基因座的影响[J].刑事技 术,2003(2):24—26. [2]SatoY,SugieR,TsuchiyaBeta1.Comparisonofthe DNAextractionmethodsforpolymerasechainreactionam— plicationfromformalinfixedandparaffin—-embeddedtis- sues[J].DiagnMolPathol,2001,10(4):265—271. [3]RomerRL,JustonAC,BallantyneJ,eta1.Theapplica— bilityofformalin—fixedandparaffinembeddedtissuesin forensicDNAanalysis[J].JForensicSci.,1997.,42 (4):708—7l4 (责任编辑李记松) ? 35-