虎纹蛙病毒TFV感染HepG2细胞侵染途径研究(可编辑)

虎纹蛙病毒TFV感染HepG2细胞侵染途径研究(可编辑) 虎纹蛙病毒TFV感染HepG2细胞侵染途径研究 中山大学 硕士学位论文 虎纹蛙病毒(TFV)感染HepG2细胞侵染途径的研究 姓名:刘东 申请学位级别:硕士 专业:食品安全生物学 指导教师:何建国 20091212中山大学硕士学位论文 虎纹蛙病毒感染细胞侵染途径的研究 硕士生: 刘东 导师: 何建国教授 专业: 食品安全生物学 摘要 世界各地有许多养殖鱼类遭受虹彩病毒感染而造成经济上的 损失。本文研究了虹彩病毒科蛙病毒属的虎纹蛙病毒入侵细胞初期的机 制,有利于我们更加详细的了解虹彩病毒的生活周期、感染途径及其受体, 为虹 彩病毒的防治奠定理论基础。 本研究以虹彩病毒科蛙病毒属的虎纹蛙病毒为材。首先我们制备了 囊膜蛋白 的抗体,并鉴定了抗体的特异性。然后利用反转录, 间接免疫荧光 和免疫印迹 分别从核酸水平和蛋白水平证实了能感染细胞。进一步研究了弧? 感染的结合动力学和感染动力学,发现病毒与细胞结合以及感染细胞都 需要约。根据肌动蛋白抑制剂细胞分裂素和动力蛋白抑制剂能抑 制病毒的感染的结果,我们推测出感染细胞可能参与的两条内吞途径: 网格蛋白介导的内吞途径和胞膜窖介导的内吞途径。 利用作用于内体的化合物、和处理 细胞后,病毒感染量明显减少,表明成功感染细胞需要经历一个内体 酸化过程,这与网格蛋白介导的内吞途径后期相一致。但是利用抑制网格蛋 白包 被小窝在膜上的聚集的药物处理细胞,以及网格蛋白内吞途径中的重要蛋 白的显性失活载体转染细胞后,病毒感染细胞的量变化不大,表明病毒并 非以网格蛋白介导的内吞途径进入细胞的,只是经历了一个内体过程。 为了进一步研究病毒是以何种方式进入到细胞中的, 我们研究发现胞膜窖 脱落促进物 对病毒感染具有促进作用,表明病毒进入细胞会经历胞 膜窖过程。而胞膜窖途径需要胆固醇的参与,这与我们的实验结果胆固醇剔 除剂虎纹蛙病毒感染细胞的方式研究使病毒感染量明显减少相一致.采用胞膜窖 的主要组成蛋白 的竞争性抑制剂来抑制 的功能,病毒感染量的减小揭示了病毒 感染是依赖于窖蛋白的。进一步,通过激光共聚焦显微技术分析了与 共同内化情况,两者共定位的结果表明是以胞膜窖途径进入细胞的。这些结 果共同表明了感染细胞是通过窖蛋白依赖的胞膜窖途径进入细胞。 综述所述,病毒进入细胞是依赖于胞膜窖形成的囊泡,而囊泡脱落后参与到 了网格蛋白途径下游的内体环境中。据此我们推测感染细胞是通过胞 膜窖介导的病毒内化途径之后,胞膜窖囊泡被迅速转移到内体环境之中去的. 目 前这种途径只在一些营养物质吸收的过程中有被报道过,从未有病毒感染细 胞利 用此途径的报道。 关键词:虎纹蛙病毒,内吞,胞膜窖,网格蛋白,胆固醇,内体 中山大学硕士学位论文: :. : . , ,,.,, . , . ?,. ,. , , :? . , ,, ,?., 。’,, , 虎纹蛙病毒感染细胞的方式研究 , . , . , .,, 一. ?.? 一 .?? ? . .. :,,,,, 虎纹蛙病毒感染细胞的方式研究 缩略词氨基酸 衔接蛋白 碱基对 互卒 绞手架区 致细胞病变效应 氯丙嗪窖蛋白脚手架区肽段 循环 细胞松弛素 脱氧核糖核酸 三磷酸脱氧核苷 双链 ,二硫苏糖醇 . 大肠杆菌 溴化乙锭 胺四乙酸 表皮生长因子受体表皮生长因子受体途径下游克隆蛙病毒型白 细胞介素 传染性脾肾坏死病毒 千碱基对 中山大学硕十学位论文千道尔顿 毫升 核苷开放读码框 磷酸盐缓冲液 允 嗜菌斑形成单位数 ? 磷脂酰肌醇激酶 蛋白激酶? 逆转录聚合酶链式反应核糖核酸每转速 秒 同源区 ,组织细胞半数感染量虎纹蛙病毒咒义灶衲母微升 微克论文原创性声明 本人郑重声明:所呈交的学位论文,是本人在导师的指导下,独 立进行研究工作所取得的成果.除文中已经注明引用的内容外,本论 文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果.对本文 的研究作出重要贡献的个人和集体,均已在文中以明确方式标明.本 人完全意识到本声明的法律结果由本人承担. 学位论文作者签名:享东 日 日期:?年?月 学位论文使用授权声明 本人完全了解中山大学有关保留、使用学位论文的规定,即:学 校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电 子版和纸质版,有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论 文进入学校图书馆、院系资料室被查阅,有权将学位论文的内容编入 有关数据库进行检索,可以采用复印、缩印或其他方法保存学位论文。 学位论文作者签名:刘东 日期:砷年,胡 锄签名一 日期:碲曲阳中山大学硕.:学位论文 第一章前言及文献综述 本章概述虹彩病毒和虎纹蛙病毒的研究现状,阐述病毒感染细胞的多种方 式,以及详细介绍了巨胞饮、网格蛋白介导和胞 介导的内吞过程,目的在于阐明本论文研究 膜窖/脂筏 的背景及意义。 .虹彩病毒 虹彩病毒是一类典型的下二十面体结构的胞浆型脱氧核糖核 酸,直径在 间,基因组为线状双股,长度在 之间 .,。年最早在英国剑桥大学分离于沼泽大纹体 内,后来陆续在其他昆虫、两栖类、鱼类、软体动物甚至植物中分离得到该病毒 ,。由于病毒粒子呈周期性间隔的异常整齐排列,形成晶格平面 并互相重叠,经斜射光线照射呈现蓝色或紫色虹彩,故得名虹彩病毒。无脊椎动 物虹彩病毒没有囊膜,对乙醚有抗性;脊椎动物虹彩病毒有囊膜,对乙醚及非离 子去污剂敏感 ..。核酸占整个病毒粒子总重量的一%, 含量为%,但蛙病毒属高达% .,。虹彩病毒的基因组高度甲基化 .,; .,,并且具有 独特的末端冗余 及环状变换 现象 ,; .,。 虹彩病毒种类繁多,全球共发现多种。年出版的国际病毒分类委员会 ,第八次报告将虹彩 病毒科 分为五个病毒属:虹彩病毒属 、绿虹彩病毒属 、蛙病毒属 、淋巴囊肿病毒属 和细胞肿大虹彩病毒属 .,。其中虹彩病毒属和绿虹彩病毒属的病毒只感染无脊椎动物;其他三个属 病毒感染鱼类、两栖类和爬行类 等低等脊椎动物。寄生于无脊椎动物和植物中的虹彩病毒通常不含囊膜结构, 一 般是非致病性的,但大多数的脊椎动物虹彩病毒含囊膜结构并对宿主有较强 的致 病性。虎纹蛙病毒感染细胞的方式研究 ,. .虎纹蛙病毒 最初分离自广东省南海市患病虎纹蛙蝌蚪 .,。等 .,测定了的全基因组序列,是第一 个完成基因组全序列测定的蛙病毒属的病毒。为双链病毒,基因组全长为 , , ,含量为.%,划分为个开放读码框 ,这些的蛋白产物从至个氨基酸。通过生物信息学分析,预测并 .,、 发现的基因产物包括囊膜蛋白, 复制相关蛋白、转录翻译相关蛋白、致病相关蛋白、与宿主相互作用蛋白 .,。等 .,对核糖核酸酶的序列和基因结构进 行分析,发现与酵母、线虫等物种的相应基因的同源性较低,与同是虹彩病 毒科的 淋巴囊肿病病毒型和二化螟虹彩病毒的核糖核酸酶 基因的氨基酸序列同源性较高。等 .,建立了感染 斑马鱼细胞的模型并通过蛋白质组学的方法来研究与感染相关的宿主蛋白 表达 变化,鉴定了个与感染相关的蛋白,并发现的感染能导致细胞微管蛋白的 重排。 .蛙病毒的感染机制 以为代表的蛙病毒能感染的细胞范围比较广,在合适的温度下能够感 染哺乳类,鱼类和两栖类细胞,: ,:,: ,,推测它能与一种比较普遍而保守的 受体结合 .,。而且有没有囊膜都可以感染细胞,目前的研究 认为有两种方式感染细胞。第一种是具有囊膜的病毒粒子以细胞表面受体的 介导,通过网格蛋白形成包被小窝 的胞饮作用进入 细胞,然后在内体一溶酶体系统? 的酸性环境下脱 衣壳,将核心释放到细胞质中 .,。第二种是不具有囊 膜包被的裸露病毒粒子通过自身衣壳内的内层脂膜与宿主细胞质膜的膜融 合作用,直接将病毒核心释放到入细胞质中 .,: .,。随后,进入胞质内的病毒核心利用宿主细胞的核转运系统到达细 胞核内 .,。 巾山大学碘?学位论文 凹卜 的感染和增殖方式. 卜 .动物病毒通过内吞感染细胞的一般步骤 大多数病毒感染宿主细胞最基本的方式是内吞,而且内吞也是病毒感染细胞 最有效的方式。病毒进入细胞和脱壳经过的是一些被严格控制的连续步骤。图卜 简单的介绍了病毒通过内吞作用到达细胞核的过程如腺病毒等,起始于病毒 在细胞表面聚集,并以基因组注入宿主细胞核内开始复制为终点。这中间经历了 一系列的过程,首先病毒接近细胞并于细胞表面发生相互作用,通过病毒在细胞 表面的横向调动,该病毒韵受体复合物诱导信号传导:然后病毒通过内化进入到 膜穿透 细胞中;包裹着的病毒粒子在细胞内运输到内体,胞膜窖或者内质网: 作用使病毒粒子释放到细胞质:进入细胞质的病毒通过微管的运输到达细胞核表 面,然后脱壳使基因组注入到细胞核内开始病毒基因组的复制 ,。这当中经历的过程由一系列因素的触发,如配体 与受体的结合,暴露在酸性细胞器中,酶诱导的共价键修饰和一些其他的细胞因子等 , ,:,:,: 。病毒利用这些信号来完成它在细胞内的移动。确保脱壳程序能在正确 虎纹蛀捕毒感絷细胞的方式研究 的时间与正确的地点完成。具体的细节可能每个病毒都不一样,但这代表了大部 分动物病毒感染细胞的一般过程。 图卜典型的动物病毒通过内吞形式进入细胞的过程 卜.病毒受体 无论有囊膜还是没有囊膜,许多病毒都依赖于宿主细胞的内吞途径感染细 胞。为了感染细胞,它们首先会靠近细胞表面并和细胞表面的分子结合,一般有 两种结合方式。一种是依靠附着因子,帮助病毒聚集到细胞表面,它们通常是与 细胞表面的硫酸己酰肝素或者其他的碳水化合物结构相作用。硫酸肝素广泛分布 , 于细胞表面和细胞间质,是一种高度硫酸化的多糖.带负电荷 。许多病毒,如疱疹病毒、乳头瘤病毒、副粘病毒和登革病毒,利用硫酸 肝素结合许多靶细胞,但这种结合是不牢固的、可逆的、没有特异性的中山大学硕士学位论文 .,; .,;,。然而,对型单纯疱疹病毒?来 说,其靶细胞表面硫酸肝素除可与.糖蛋静电结合外,还可作为 .,。 特异性受体与糖蛋白相互作用发生特异结合 和附着因子不同,受体与配体的结合可以通过使病毒颗粒的构象发生变化, 激活信号通路和促进病毒内化来促进病毒感染细胞。在内吞过程中,受体通常会 伴随病毒进入细胞,随后在病毒穿透释放过程中起作用 , 。受体与配体的结合通常具有较高的特异性,受体的有无在很大程度上决 定了哪种类型或者哪种物种能被感染.对这种参与相互作用的分子的研究,不仅 对病毒感染的机制,而且对感染和病原学研究有重要的作用。 病毒与受体的相互作用是一个非常复杂的过程, .,。首 先,一种病毒可以利用多种不同类型的分子作为受体,可能是同时也可能是有顺 序的。人类免疫缺陷病毒能同时利用和一种趋化因子受体去诱导病毒 膜蛋白的构象变化来启动膜融合 .,;也能够与葡糖苷脂 酰鞘氨醇和硫酸肝素结合来启动病毒进入到易感细胞 .,;.,。另外,一些特别是突变很快的病毒能够改变受体 ; .,或者当原始受体消失后利用其他的受体 ., 。其次,一种分子可能是多种病毒的受体,如整合素可作为人 疱疹病毒、腺病毒、轮状病毒、小核糖核酸病毒、汉坦病毒等的受体 .,; .,; ,。 .病毒的内吞途径 随着精密的细胞成像技术,高分辨率的电子显微镜技术和系统生物学的高速 发展 .,,越来越多样化的内吞途径被发现图.。病毒粒 子依赖细胞的理化性质,利用细胞的内吞途径感染细胞表.,这对病毒感染 细胞有很大的帮助,病毒能够利用细胞骨架和细胞质在细胞内轻松移动。病毒需 要低的值来从内体中逃离以避免被溶酶体降解。除此之外,由于没有病毒的 成分留着细胞膜表面,所以不会被细胞的免疫系统检测到 , 。 病毒能够选择多种内吞途径,这些途径之间有一些复杂的联系 ..; 。本文中,内吞途径被分为网格蛋白介导的内 虎纹蛙病毒盛染细胞的方式研究 吞,胞膜窖,脂筏介导的内吞和巨胞饮。随着越来越多的途径被发现,这种分 类 还会被不断补充。比如脂筏介导的途径是类不能被经典的内吞标志物分类的 途 径,它们之间内部以及与其他已知途径之间的区别很小 .,;; , .,; .。; 。其中还有些复杂变化的途径,比如先利用网格蛋白介导的途径进 入细胞,再利用胞膜窖途径来进行转运 。。 洲憎” 圈卜被病毒所利用的内吞途径 ” ; , ,. ..巨胞饮 肌动蛋白介导的细胞膜的褶皱经常会形成巨大的.多种多样的动态囊泡结构 .,。 称为巨胞饮体 ?啪;。; 巨胞饮是流体内吞的主要形式,巨胞饮体被作为流体内吞的标记物.一些细胞如 表皮细胞,成纤维细胞,中性粒细胞和巨噬细胞等用来进行高效率而无特异性的 细胞外可溶大分子的吸收 ,;中山大学硕学位论文 ,;,。周质空间褶皱内部弯曲,细胞膜上环形褶皱的形 成,被认为是形成巨胞饮体的前兆。 和噬菌作用不同,巨胞饮过程中的细胞褶皱的形成不需要任何外界物质的诱 导 ..。巨胞饮体的形成高度依赖于酶和介导的皮层下肌动蛋白的重建 .,; .,。肌动蛋白的重建和被 激活的的正确膜定位需要胆固醇和激活 .,。其他巨 胞饮的调节因子包括:激活激酶调节下游和的吸收过程.,; .,;调节巨胞饮体的关闭.,;阿米洛禾敏感的钠离子/氢离子交换系统 ., 。未脱壳的巨胞饮体不需要受体辅佐就能够相互融合 .,。这些巨大的内吞囊泡在不同细胞中的命运不同,取决于参与内吞粒子的受体类型 .,。囊泡可能被回收至质膜或 .,; 者形体减小、酸化甚至与溶酶体融合,。巨胞饮体的成熟发生在后 期内吞体和溶酶体标志物女和溶酶体糖蛋白的补充至囊泡 ,。 在巨噬细胞和树突状细胞中,巨胞饮是 和 抗原递呈的主要方式.。: ,。在 大多数细胞中,巨胞饮 等激活 , 作用也能够被生长因子、佛波脂 。有些细菌,牛痘和腺病毒被发现是依赖巨胞饮进入细胞 的 .,: .,: .,: ,:,。腺病毒经过网格蛋白介导的内吞作用感染细胞 时会刺激其周边细胞膜形成巨胞饮作用 .,。有研究表明在病 .,, 毒和进入细胞的过程中有巨胞饮体的存在 ?.。 ..网格蛋白介导的病毒内吞 网格蛋白介导的内吞途径主要负责营养物质的吸收,比如用来转运受体绑定 的如低密度脂蛋白? 和转铁蛋刍, 。同时也在维持细胞的动态平衡,组织与器官发生过程细胞间的信号交流 中起重要的作用 ,。细胞膜表面受体递呈的内化 虎纹蛙病毒感染细胞的方式研究 信号使网格蛋白聚集到细胞膜的内侧从而形成小窝。小窝与细 胞膜分离就形成网格蛋白包被的囊泡.,?,主要由包含条 重链与条轻链的网格蛋白组成,; .,。肌动蛋白 ., 的聚合以及动力蛋白促进了小窝的脱落和囊泡的形成 ..。网格蛋白的聚集也需要,网格蛋白招募的 ;.,。 和接头蛋白 ,; 表.病毒利用内吞途径感染细胞的例子 一. ??????????????????????????????‘?? ??????????? ??????????????????????? ? 病毒 出处 内吞途径., 巨胞饮 ., ., .. 网格蛋白介导.. .. ., . 、.,..., ., .. ., 胞膜窖/胆固醇介导 ..., ., ., ., .,., . .. :,; ;, ; ; ; ;,; , ; ,:, ;二, .;; ; ;? ..;, ; 中山人学硕学位论文 网格蛋白包被的囊泡在细胞质中被脱壳酶迅速地去除掉网格蛋白外壳 ..,然后与早期内体融合,早期内体的标志性蛋白是早期 内体抗原和、酶和,。在低值环境下配体与 受体解离,有些受体如转铁蛋白和的受体被回收至细胞膜,有些在下游起调 节的受体继续被转运与晚期内体融合。随后晚期内体与溶酶 . 体融合,被转运的分子被低的环境和溶酶体酶降解 。 ;, 网格蛋白介导的内吞途径是病毒进入细胞最常用的途径。腺病毒 ,下粘病毒如流感病毒,甲病毒如塞姆利基森林病毒,弹 状病毒如水泡性口炎病毒和一些小核糖核酸病毒等都利用此途径来感染细 胞, , .,。网格蛋白介 导的内吞途径高效而迅速地将病毒和受体蛋白运输到早期和晚期内体。内体 的酸 性环境通过诱导病毒粒子的构象改变来促进病毒透出来,这步酸诱导穿透取决于 ,。一些病毒,比如伊波拉病毒 病毒的值阈值 和冠状病毒,需要酸性条件依赖的内体蛋白酶来水解病毒蛋白以方便病毒的穿透 .,。 .,; 塞姆利基森林病毒 是第一个被报道利用网格蛋白介导 的内吞途径来感染细胞的 .,,到目前通过这种方式感染细胞的 步骤己经被研究的很清楚。病毒首先绑定到受体,形成病毒.受体复合物;该复 合物在细胞膜中横向移动,逐渐向膜表面的衣被凹陷处集中,衣被凹陷是细胞膜 上的一个特殊区域.其胞浆侧富含网格蛋白;衣被凹陷进一步向胞浆侧凹入,并 最终与细胞膜脱离,在胞浆内形成一个囊泡,称衣被囊泡; 衣被囊泡能形成早期 内体,内体可以发出和接受囊泡,与细胞膜、高尔基体和溶酶体有着广泛的交通 往来。低值诱导病毒糖蛋白介导的膜穿透使病毒释放到细胞质中。进入细胞 质的病毒通过微管的运输到达细胞核表面,然后脱壳使基因组注入到细胞核 内开始病毒基因组的复制 ,: , 。没有来得及穿透的病毒在内体与溶酶体融合,然后被降解,膜受体被转 运回到细胞膜 ..。 ..胞膜窖/脂筏介导的内吞 虎纹蛙病毒感染细胞的方式研究 ...胞膜窖介导的内吞 胞膜窖介导的内吞途径与网格蛋白介导的内吞途径一样,是目前为止阐明得 最清楚的动力蛋白依赖的内吞途径。它与很多细胞的功能如信号传导 .,和钙离子的吸收 .,,胞吞转运 ,等有密切的联系。形态上,胞膜窖 ,; 是一种平滑的烧瓶状结构,内陷部分约.,由富含胆固醇和鞘磷脂的细胞 膜组成.。它的主要组成蛋白窖蛋白.肌肉细胞中是窖蛋白., ,是一种胆固醇结合蛋白,在胞膜窖的形成过程中是必须的 .,; .,。与网格 蛋白介导的内吞不一样,胞膜窖 介导的内吞途径是由一系列磷酸化途径激活所引起的 . 。动力蛋白在胞膜窖从膜上脱落进入细胞起了重要的作用,进入细胞内之.,; 后融合为胞膜窖体或者直接与内体融合 .,。胞膜窖体中的货物也能够继续传递到内质网、高 .,; 尔基体或内体中 ,。 第一个被报道利用胞膜窖介导的内吞途径感染细胞 ., 。但不包括它的受体,通过缓慢而高效的胞膜窖途径进行内化,且依 赖于肌动蛋白、动力蛋白和一些细胞信号,然后在细胞内由胞膜窖转移至胞膜窖..。也能通过非窖蛋白介导的途径进入细胞 体 .,。后来陆续报道也有一些其他病毒如冠状病毒 .,,,线,,流感病毒? .,和多瘤 状病毒 病毒 .,也利用此途径感染细胞。 ...脂筏介导的内吞 脂筏是结构和功能区别于细胞膜的微结构域,富含胆固醇,鞘磷脂和某些蛋.,; 白质 ,。后来的研究表明由胆固醇富 集区与某些蛋白质的相互作用,在激活的条件下才能形成脂筏 ; .,。尽管对脂筏的研究已经很深入,脂筏的大 ,;,。 小、组成和具体功能仍有争议,; 取决于具体的货物不同,脂筏介导的内吞途径可以是动力蛋白依赖或非动力蛋白 依赖的 .。 中山人学硕.学位论文 脂筏介导的内吞包含一系列多样的网格蛋白不依赖的,胆固醇敏感的内吞途 径。尽管这些途径有一些共同的机制,它们在比如对窖蛋白动力蛋白的依赖 上有不同 ; ,。比如蓖麻毒素 和就能通过网格蛋白、窖蛋白和肌动蛋白都不依赖的脂筏介导的途 径来感染细胞 ..,这个只是它们进入细胞的一条旁路途径,前 面讲过它们也能通过动力蛋白、窖蛋白依赖脂筏介导的途径感染细胞 .,; .,。脂筏介导的内吞途径也被一些小核糖核酸病毒, 乳头状瘤病毒,线状病毒和反转录病毒所利用 .。 禽肉瘤和禽白血病病毒属于逆转录病毒,被证实和糖基化磷脂酰肌醇耦 合的受体绑定来利用这条途径内化,最终被转运到内体 ..。人 肠道孤病毒受体,也是耦合糖基化磷脂酰肌醇并介导病毒利用 这条内吞途径的 ..。柯萨奇病毒也可利用脂筏来 感染细胞,病毒感染时,包括整合素在内的病毒受体被发现聚集在脂筏。同 时,该病毒感染能被扰乱脂筏的药物所抑制 ,。 脂筏介导的内吞是一个很复杂的过程,类似的货物可能利用不同的途径,它 们的命运也各不相同。这些途径也经常被称作网格蛋白不依赖的途径, ,。 .本论文研究的目的,意义 随着水产养殖品种的增多和养殖规模的增大,养殖环境的恶化,各种传染性 疾病的流行和爆发已经严重威胁了水产养殖的健康持续发展。特别是一些病 毒 害,对水产养殖的损害特别大,造成的经济损失也是空前的。虹彩病毒种类 多, 感染宿主范围广,对很多名贵的鱼类的感染都是致命的,但是其感染机制还不是 十分明确,对虹彩病毒感染的防治还处于比较初级的阶段。 本文以虹彩病毒蛙病毒属成员作为研究对象,旨在阐明病毒感染细 胞初期的机制。研究病毒感染细胞的早期机制,对了解病毒整个侵染机制、病毒 受体研究等有很大的帮助,有助于找到和开发一些能抑制病毒感染细胞的药物及 基因工程疫苗。希望本研究能为虹彩病毒研制有效的抗病毒药物提供理论依据。虎纹蛙病毒感染细胞的方式研究 第章囊膜蛋白 多克隆抗体的制备 为了研究病毒的浸染过程,我们需要抗体对病毒进行跟踪。由于前 面的研究表明 是一个重要的囊膜蛋白,于是我们选取已经构建 好表达载体的 基因,表达纯化融合蛋白作为我们用来制备抗体的抗原, 以此制备鼠源的多克隆抗体,并通过.来检测抗体的纯度。 .材料和方法 .. ?病毒悬液 本实验所用的病毒储备液是由中山大学寄生虫室分离保存,保存于?。 ..细胞株 人肝癌细胞系,来源于 美国生物品收藏中心, 为本实验室保存。 大头鱼肌肉细胞,购自深圳动物检疫局细胞 培养室,本实验室传代培养保存。细胞培养于?。 ..培养基 .公司,配制方法同说明书。蠕动泵过滤灭菌。 胎牛血清:购自公司,.?保存。 胰酶含和不含:购自公司,?保存。 液体培养基:胰蛋白胨 双蒸 ,酵母提取物 , , 水完全溶解后,用 /的和 /的调至...,再定容至 ,?高压灭菌 备用。 液体培养基:在己灭菌的液体培养基中加入氨苄储藏浓度为 / 至终浓度为 /且可。 ..质粒及菌株 中山大学硕上学位论文 公司,克隆位点见图. :购 克隆菌大肠杆菌基因型为: ,,, ,., 。 ,,? , 菌液。 .刍罗永文师兄构建并惠赠含质粒的 表达菌.,基因型为:..,为本实验室 保存。 ..主要试剂 丙烯酰胺,,.亚甲双丙烯酰胺,?,甘氨酸电泳级,二硫苏糖醇, 过硫酸胺,单株抗体:购自公司; 考马斯兰...购自广州粤申公司; 镍柱:购自德国公司。 .和山羊血清封闭液:购自广州威佳科技有限公司; ,羊抗小鼠鼠免疫球蛋白抗体,碱性磷酸酶偶联抗体. 和显色底物购于美国公司。 ..蛋白相关缓冲液 .聚丙烯酰胺凝胶电泳 %丙烯酰胺贮存液:将 丙烯酰胺和 ,一亚甲双丙烯酰胺溶于 ,滤纸过滤,避光 双蒸水中,涡旋搅拌仪上旋转至溶解,定容到 保存备用; . 分离胶缓冲液 .. 双蒸水中,用浓 碱溶解于 .,加. ,定容至 ; 盐酸调节至 . 碱溶解于 双蒸水中,用浓 .:. 浓缩胶缓冲液 .,加. ,定容至 ; 盐酸调节至 /. .缓冲液:称. 甘氨酸电泳级和. 碱,. 双蒸水溶解。 虎纹蛙病毒感染细胞的方式研究 榔 矗矗矗磊垂:::五矗;是鑫 :嚣品矗再: 盘:盘矗’盘矗 。鼻鼻点舞 坚:翌丝 丝::塑 矗矗矗 矗 磊:矗 矗’ ”盎盘’ 矗。盎毒: 矗;磊矗盎矗 ‘嚣 :::盘’ : 叶静。 。 真口最再口 。?抖螽?品々尊磊‘矗々矗’., 。 锄憎???枷啪跏错 ,? 洲 鼯 耐 捌例 惭 黼;. 鑫:品;;矗’是:矗: 矗;::矗:’: 矗矗: ::矗: 矗:矗:矗:矗:矗矗矗盎鑫矗 矗 矗一?螽口 量’矗’曩?【;了矗孽’瓤’矗靠董 譬量 ’口 ::盆盎矗 毽鑫‘再矗:窟矗;: :::盎 鑫矗【矗。蟊再 。矗 唾.蜒 缸‰磊搴嚣。?蟊矗 ?矗。?硅??;科己’ :矗嚣鑫庙矗盆’鑫品 盆彝矗 :客;:鑫矗:。:矗“:未 矗矗:函;召女矗鑫【【再磊占口肆量: 品,?矗点? 毒 矗,叠口,摹量?’“’一,叫一’’。謦盎壁量。。一 :丝:丝: 蠡筐丝 矗矗矗矗矗矗鑫矗盘::盎鼻:点矗蠡点::”嚣嚣 ’毳真矗‘盘矗盘鬈:盆 “鼻; 盏。’;昔 .量口. ?焉?鬲磊西丽弄磊孺窖? ?》/ 图 .的多克隆位点和内切酶劐谱 . / / .,%/甘油, ×上样缓冲液: 二硫苏糖醇,.%溴酚蓝,%电泳级; 去离子水,于? %过硫酸胺:称取. 过硫酸胺,溶于 中山人学硕上学位论文 避光保存; 冰醋酸和 染色液:. 甲醇、 考马斯兰.溶解于 去离子水中配成 ,混匀,滤纸过滤后使用; 脱色液: 甲醇、 冰醋酸和 水配成 ; .聚丙烯酰胺凝胶的制备: 蛋白印迹分析.所用试剂和溶液 、 .转移缓冲液:称取. 甘氨酸、. 确碱、. ; 并加入 甲醇,加水至总量为 ,. ,. ,加,. ,高压灭菌,保存于室温; 双蒸水溶解,调节至.,定容至 : .%.,混匀。 封闭液:%脱脂奶粉~,慢慢搅拌混匀,使脱脂奶粉完全溶解。 ..重组质粒的提取及转入表达宿主菌. ...重组质粒的提取 液体培养基的摇菌管中, 取含.的菌液于含有 ? ? 摇菌 。参照公司的 说明书的操作步骤提取质粒。 ...大肠杆菌高效感受态细胞的制备: 虎纹蛙病毒感染细胞的方式研究 挑取在固体培养基上生长的受体菌单菌落,接种于 的 培养基中,?, 振摇. .按:体积比将菌液接种到 液体培养基中,?, ,直到达到 继续振摇培养~ 约.~.时,停止培养。将培养瓶置于冰上,放置~ ,冷却培养基。 在无菌条件下,将菌体转移至 离心管中, 回收菌体细胞。 , 冰冷的. 。 弃上清培养基,加入 充分重悬菌体,冰上放置 ? , 收集细胞,除尽培养基。用 冰冷的. 离心 /管。冰上放置 后,加%甘油至终 充分重悬菌体,分装 浓度为%,混匀后于.?保存,备用。 ...转化: 取出.?保存的感受态细胞,冰上解冻后轻轻将细胞均匀悬浮,加 入. 质粒,混匀后冰浴 ,?水浴热激 ,立即置于冰上 。 再加入培养基, 振摇,复苏细胞。室温下, , 收菌,弃去 培养基,用剩余 培养基重悬菌体, .将细胞均匀涂布于预先用 和 /.涂布的 直径为 的平板上。平板在?正向放置 后倒置培养过夜。 ..重组蛋白的诱导表达 挑取含重组质粒的单菌落接种于 液体培养基中?摇床活化过 夜,次日按照%的比例转接于新鲜的液体培养基中,培养至约为... 左右时,加入 至终浓度为 ,继续培养. 。取培养后的菌液收集菌体,尽可能 地弃掉上清液,于沉淀中加适量的 离心 ×.上样缓冲液,充分打散后煮沸. ,取此用于.。 .按常规方法在小型蛋白电泳仪上进行恒压电泳。所用的分离胶浓度 为%,浓缩胶为%,电泳完成后,用染色液染色以上,再用脱色液脱 色至背景干净,拍胶观察蛋白带型,干胶保存。 ..重组蛋白的纯化及.聚丙烯酰胺凝胶电泳. 纯化方法参照公司的说明书的操作步骤。 中山大学硕士学位论文 在.小型蛋白电泳装置上进行恒压电泳,所用的分离胶浓度为 %,浓缩胶为%。以 电压跑浓缩胶, 跑分离胶。至溴酚蓝跑至胶底 时关闭电源,小心取下胶,用染色液染色 以上,脱色液脱色至背景干净。 观察蛋白带型,干胶保存。 ..重组蛋白多克隆抗体的制备 诱导表达的菌体沉淀进行尿素变性条件下的纯化处理,纯化后的样 品进行.,将.胶上含有目的蛋白的条带割下,经 漂 洗后,加入适量×和等体积的完全福氏佐剂用研钵充分研磨成油状。再用 两个 的一次性注射器,反复推送蛋白胶和佐剂的混合物,推送数十次后,滴 一滴至冰水面,如果液体浑圆,不扩散,说明已形成油包水状态。取昆明鼠只, 采用腹部皮下和腹腔多点注射方式进行免疫,免疫剂量按每只鼠体约 抗 原;以后每隔天免疫一次,使用不完全福氏佐剂,免疫剂量按首次免疫的剂量 。 进行注射。在第三次免疫后的天,以拔眼球法取血。采完血室温下放置 待其凝固后,放置?过夜使血块收缩,血清析出。次日,吸出血清,沉淀转入 离心管中于?下 ,取上清液即血清与前面的血清混合。?, 离一 离心全部分离的血清部分。将血清分装,放置.?保存。 .. 细胞的培养和感染 用含%胎牛血清的培养基培养细胞,在?、无 条件的恒温培养箱培养,每隔天传代一次。以.%含的胰酶消化,: 传代培养。 当细胞密度长到%.%时,弃培养基,加入新鲜的%的培养基并加 入大约 /的病毒量。并将培养瓶置于?培养箱培养,感染后每天观察, 至细胞出现大量,呈破鱼网状时,收集细胞及上清,保存在.? 当细胞密度长到%。%时,弃培养基,加入新鲜的%的培养基并加 入大约 后弃上清, /的病毒量。并将培养瓶置于?培养箱培养,约 收集感染的细胞。 ..病毒的纯化 虎纹蛙病毒感染细胞的方式研究 病毒的纯化参考 ,文献中报道的方法。 将保存在.。的感染的细胞混合液取出,反复冻融三次。,, 离,去除细胞碎片。收集上清,在?,, 离。病毒沉淀用 重悬,加到事先配好的%、%、% , 。 和%/的蔗糖梯度上。?,, 离心 离心后,可见%和%蔗糖层之间出现病毒条带。将病毒条带吸出, 重悬。,, 最后收集病毒,重悬,放.? 离心 保存。 .. 使用.公司的蛋白转印装置进行.检测。按常规方法 。 进行蛋白转移。?, 转印约 用干净的平头镊子取出硝酸纤维素膜,浸泡于封闭液中,置于脱色摇床上室 温轻微摇动数或于冰箱放置过夜,然后用清洗三次,每次 。 加入所制备的抗血清,孵育 ,然后用清洗三次,每次 。再用羊抗 ,然后用清洗三次,每次 。加入 鼠.抗体孵育 显色液及显色底物显色至有清晰的目标蛋白带出现,用终止反应,并冲 洗 以终止显色,把膜置于滤纸上,自然干燥。并用过塑膜过塑封口,可 长期保存。 .结果与分析 .. .的表达 重组菌在诱导表达后,收集细胞进行.分析,结果见图 .。 基因克隆时均在引物后面带上了终止密码子,所以理论上应该是 预测蛋白大小 力:上约. 重组蛋白的大小 的融合肽,所以 预测为 。.结果显示,经诱导过的 的重组蛋白有特 异性表达带,而且大小与我们预测的相一致。中山大学颂?学位论文 吲?口的表达? ?: ;,, ,: ..变性条件下融合蛋白的纯化 将诱导表达收集的苗在 强变性剂的条件下,与能特异性结合 标签的镍柱孵育。并通过不同值的洗去非特异性条带,最后用较 低韵将结合蛋白洗脱下来。由下图?可知,通过此方法能较好的得到比 较纯的蛋白。 我们得到纯化的洗脱液之后,再将洗脱液进行 ,并将目的条带切下 来研磨均匀了之后进行免疫小鼠,通过这种纯化方式得到的蛋白进行免疫后 得到 的抗比较纯。虎纹蛀病毒感橐细胞的方式研究 ’”,一”。。’ 图重组蛋白的纯化?,【 : .鼠源多克隆抗体的检测。 由于已经鉴定蛋白为病毒的囊膜蛋白,为了检验抗体的纯度,将纯化的 病毒直接进行,诱导表达后的菌体直接加入 煮沸进 行?,用制备的鼠源多克隆抗体作为一抗进行 检 测。二抗为标记碱性磷酸酶的羊抗鼠多抗。 结果表明,抗体 能很特异的检测出纯化后的病毒中的蛋白,直接原核表达的细菌中也能检测 到重组融合表达的蛋白,但是杂带比较多。可能是它们直接的交叉比较多。 剐开始显色时,原核表达蛋白很快就显出条带来,杂带也不多,但纯化过的病 毒 可能是因为含量比较少,显出的时间需要比较长,等到纯化的病毒显出目的 条带 时.原来比较单一的原核表达条带多了很多杂带。中大学砸:学位论业网 ~ ~, 嘲? 景~‰。 .竺 篡 图病毒和重组蛋白的 检测 .虹 ,:?:,, .讨论 目标蛋白的抗血清的制各,是对目的蛋白进行功能研究的一个重要的过程。 获得目的蛋白的特异性的抗血清之后,可以为基因功能的后续研究提供了一 个有 力的检测手段,如 来检测它的表达量,间接免疫荧光分析蛋 白的定位.如果是病毒的囊膜蛋白还可以用来对病毒感染细胞进行监测,免疫共 沉淀等分子生物学手段来研究蛋白的相互作用。本章通过对重组蛋白的表达 纯化与鼠源多抗制各,经检测该血清对蛋白有很好的结合能力,并且抗血清 能很特异的检测出纯化病毒中的蛋白。 本章主要是为了制各优质的抗血清为后续的研究打基础。所以对目的蛋白的 活性没有太大的要求,故目的蛋白的诱导是按照常规的手段.纯化方式也是在变 性条件下进行,这样不需要目标蛋白是可溶的,包涵体也一样可行,操作起来比 较方便。这样纯化得到的蛋白一般构象发生了改变,基本没有生物活性的,用来 研究它的其他功能可能会行不通,但是用这种方法纯化的蛋白做抗体是可以的, 因为产生抗体的过程是一个序列识别而不是结构与构象识别的过程。 获得好的抗血清对后续的研究工作会有很大的帮助。如何才能获得较好的抗血清虎纹蛙病毒感染细胞的方式研究 昵这可能是一个比较棘手的问题,里面包含了太多的因素。一般来讲,主要包 括以下几个方面:一是免疫动物的选择,抗原来源与动物种属的差异越远,免疫 原性越强。动物个体要适龄、健康、体重符合要求。 二是抗原的质量和剂量, 抗原需要较纯,没有相似杂质的干扰,太小的抗原需要合适的偶联剂和载体进行 偶联:在中间剂量范围内,免疫原剂量增加可获得高效价抗体。三是佐剂,合适 的佐剂,完全的乳化,都对获得较好抗血清有帮助。四是免疫途径和间隔时间, 可以根据具体需要悬着皮内、皮下、肌肉、静脉、腹腔、淋巴结进行免疫,最好 进行多点注射;间隔时间第一次和第二次~天,三次及以后~天 .,。 .小结 .通过原核表达融合蛋白,纯化并免疫小鼠制备了鼠源的 抗血清,为今后深入研究感染细胞的机制提供了有效的检 测工具。 .使用 抗血清对病毒粒子的进行 分析,表明所制备的抗血清能很特异的检测病毒粒子中的蛋白。中山大学硕十学位论文 第章感染细胞 由于鱼类细胞比较难操作,为了更好的研究感染细胞的方式,我们选 取了细胞用来作为病毒感染的细胞来研究。本章通过反转录,间接 免疫荧光和 证明了在?能够感染细胞,并且能够 比较方便的区别感染与否和感染量感染率的差别。 材料和方法 .. ?病毒悬液 本实验所用的病毒储备液是由中山大学寄生虫室分离保存,保存于?。 ..细胞株人肝癌细胞系,来源于 为本实验室保存。 美国标准品收藏中心, ..培养基 :’的缩写,公司,配制方法见说明 书,蠕动泵过滤灭菌。 胎牛血清:购自公司,.?保存。 胰酶含和不含:购自公司,?保存。 ..主要试剂 丙烯酰胺,,.亚甲双丙烯酰胺,.,甘氨酸电泳级,二硫苏糖醇, 过硫酸胺,.,山羊血清封闭液,提取和相关试剂购自广州 威佳科技有限公司; .蛋白定量试剂盒购自.公司。 ,羊抗小鼠免疫球蛋白抗体,碱性磷酸酶偶联抗体? ? 和显色底物购于美国公司。虎纹蛙病毒感染细胞的方式研究 耦连的羊抗小鼠抗体购于公司。 ..蛋白相关缓冲液 .聚丙烯酰胺凝胶电泳 %丙烯酰胺贮存液:将 ,亚烯酰胺溶于 丙烯酰胺和 ,滤纸过滤,。避光 双蒸水中,涡旋搅拌仪上旋转至溶解,定容到 保存备用: . .:. 碱溶解于 双蒸水中,用 分离胶缓冲液 .,加. ,定容至 浓盐酸调节至 双蒸水中,用浓 .:. .浓缩胶缓冲液 碱碱溶解于 .,加. ,定容至 : 盐酸调节至 .缓冲液:称. 碱,. 甘氨酸电泳级和. / 双蒸水溶解。 二硫苏糖醇,.%溴酚蓝,%电泳级; 去离子水,于? %过硫酸胺称取. 过硫酸胺,溶于 避光保存; %.聚丙烯酰胺凝胶的制备: 蛋白印迹分析 所用试剂和溶液 碱、. 、 转移缓冲液:称取. 甘氨酸、.并加入甲醇,加水至总量为 ; : ,. ,. ,. ,加 中山人学硕』:学位论文 ,高压灭菌,保存于室温; 双蒸水溶解,调节至.,定容至 :.%.,混匀。 封闭液:%脱脂奶粉/,慢慢搅拌混匀,使脱脂奶粉完全溶解。 ..总的抽提及第一链的合成 根据试剂使用说明书的标准操作,提取一个孔感染和不感染 病毒细胞的总。 取少量样品,经紫外分光光度法测定总的含量和纯 度,并通过.%琼脂糖凝胶电泳检测完整性。以总为模板,检 测人基因,以确定总无污染后,将总样品储存于. ?备用。 第一链的合成:使用.逆转录酶将总进行反转录以获取 反应的模板。逆转录操作步骤如下: .按下表在一无的. 离心管配制反应体系: 混匀后,简单离心使液体聚于管底。?孵育 使变性,迅速 置于冰上 .简单离心使液体聚于管底。: .加入已准备好的 混匀后,简单离心使液体聚于管底, 按以下条件进行逆转录反应: ?, . ;? ;? .. 扩增和基因虎纹蛙病毒感染细胞的方式研究 根据基因序列设计并合成引物.: 玎’:’‘:’一。. ’’ . . 。’一’ 二?: ’一 一’;二?:’一 一’?:’一.’;:’.’,以反转录得到的为模板,扩增 和基因。 体系按下表配制: 成分 用量 / . 加水至 程序:?/ , ;?/ ,?/ ,/, ;?/ 。扩增完成后,取 扩增产物,加 溴酚兰指示剂,在.%琼脂 糖凝胶中稳压伏电泳 ,电泳缓冲液为 。电泳完毕后,用 凝胶成像分析系统分析。 .. 法测定蛋白浓度 用 溶液制备标准溶液,使得浓度分别为,.,.,., / .,./ 。在孔板或酶标板预先加入 考马斯亮蓝溶液,随后加入一系列标准品 及待测蛋白各 ,稍稍晃动混匀。室温放置 后,在酶标仪上读瞄附近有些酶标仪没有 的波长的数值。 用标准 蛋白质量 为横座标,用吸光度值啪为纵座标,作图,即得到一条标准曲线。 根据目的蛋白的读数,即可对照得出待测蛋白浓度。 .. 中山人学硕卜学位论文 细胞板上,待细胞长至%时进行感染或 将细胞传代至 不感染病毒并转移至?二氧化碳培养箱培养,培养 后,用胰蛋白酶将 细胞消化下来,裂解并用法定量后进行.电泳。再使用 .公司的蛋白转印装置进行.检测。按常规方法进行蛋白 。 转移。?, 转印约 用干净的平头镊子取出硝酸纤维素膜,浸泡于封闭液中,置于脱色摇床上室 。 温轻微摇动数或于?冰箱放置过夜,然后用清洗三次,每次 加入所制备的抗血清,孵育 ,然后用清洗三次,每次 。再用羊抗 ,然后用清洗三次,每次 。加入 鼠.抗体孵育 显色液及显色底物显色至有清晰的目标蛋白带出现,用终止反应,并冲 洗 以终止显色,把膜置于滤纸上,自然干燥。并用过塑膜过塑封口,可 长期保存。 ..间接免疫荧光法 用含%胎牛血清的高糖培养基培养细胞,在?、 %条件下培养,每隔天传代一次。以.%含的胰酶消化,:传代 培养。感染病毒参见..。将细胞传至载有玻片的.孔板上,待细 胞长至%时进行感染并转移至?二氧化碳培养箱培养,培养 后, 进行间接免疫荧光检测: .弃培养基,×清洗次,加入.?预冷的甲醇,固定细胞~ ; 。 每孔中加入 .弃甲醇固定液, 清洗次,每次静置.% .透化细胞膜,静置 ; .弃透化液,×清洗次,每次静置 。每孔中加入 ,或?封闭过夜; 封闭液含%的溶液,?封闭 .弃封闭液,加入一抗溶液:.鼠多克隆抗体分别以:稀释 于上述封闭液,?静置 ,或?过夜; 。加入 荧 .弃一抗溶液,×清洗次,每次静置 ? :稀释于封 光二抗溶液: ~ 闭液,?避光静置 ;虎纹蛙辅毒感染细胞的方式目兜 .弃二抗溶液,×清洗次,每次静置。×清洗 次,每次静置; 加入用:稀释的染料? ,静置。× 清洗次,每次静置: .从孔板中取出玻片,进行激光共聚焦显微镜观察。 .结果与分析 为了证明在?下能够感染细胞,并能够用较直观的方法观察 感染与否的区别。我们采取了种方法:反转录,?和间接 免疫荧光。对感染和不感染的细胞分别采取这种方法,可以很直观的看出它 们 之问的差异。 ..总的提取和反转录 通过紫外分光光度计对所提取的总分析,和电泳结果图可以看 , 到明显的三条带 和 ,都表明所提的样品纯 度较高,而且未见的明显降解和基因的污染,由此判断的纯度 和完整性都达到了鉴定的要求。 幽总的提取; :下酬 对所提的进行反转录后,得到第一链的,费们以此为模巾大学硕』学位论文 板,进行以鉴定感染和不感染细胞中的和基因,并以 作为参照。结果见图,我们可以明显的发现感染后细胞进行检测可以很 明显的扩增出目的条带,而未感染的细胞就不能扩增出病毒的条带。由于我 们提 取的是病毒的,也能够说明病毒确实在细胞内发生了转录。这种方法从 的水平上证明了确实能够感染细胞。 工?? 枷: 圈 水平上对病毒感染的检测..间接免疫荧光 我们将未感染和被感染的细胞分别用来做问接免疫荧光。一 抗为上一章所制备的的抗体,二抗为耦连 的羊抗小鼠 的抗体,该抗体在附近波长激发下发绿光。细胞核用染色, 与细胞核双链结合后在紫外光的激发下发出蓝光。由圈?可知,未被 感染的细胞只能看到细胞核的蓝色而没有绿色,被感染后的细胞何以很清楚 的看到在细胞核的周围有绿色的荧光存在,而且差别非常的明显,同时也说 明上 一章所制各的抗体很特异,效果较好。由于是病毒的囊膜蛋白,所以基本可 以确定有绿色荧光的地方就有病毒的存在,也能直接说明此细胞是被感染 的。此 结果进一步证明病毒能够感染细胞并能在细胞内进行有效的复制。 而且由图可知,感染的细胞与没感染的细胞差别非常的明显,我们可以根据 免疫 荧光来计算感染的细胞数或感染率。虎纹蛀病毒感染细胞的方式研究 ?图免疫荧光检测病毒的搏染 . 蜘 硼? ? ..病毒感染的 分析 前面我们已经在平和用间接免疫荧光在整体结构蛋白水平证实了 对细胞的感染。为了以后能比较精确直观的分析感染量的变化,我们 进一步的在蛋白水平用来检测病毒囊膜蛋白。我们也是先将 未感染的细胞和感染的细胞消化下来后,用裂解液将细胞裂解。再用 给蛋白定量,各取 未感染与感染的细胞裂解产物进行,转移至 膜后进行 分析,结果见下图图?。在的地方都有条 带被检测出来,而未被感染的细胞样品在 分子量大小的地方没有条带 显现出来,而被感染的样品有明显的特异性条带。这样我们用直接又直观的 方法 从蛋白水平进一步证实对细胞的感染,而且利用此方法,我们可以 比较方便的监测病毒感染量的变化,有利于我们后续研究一些化合物对病毒 感染 的影响。中人学砸。学位论文 ?? 上 幽免瘦印迹检刹病毒的搏染 .讨论 本章用种不同的方法分别从水平和蛋白质水平证实了对 细胞的感染。这种方法都可以用来实际检测病毒的感染,但如果单纯只是要看 感染与否的话,从或水平来检测就是最好的方法了,这样既节省时 间,花费也比较少,这也是我们实际生产中用来检测病毒等病原微生物最常用的 方法。但是它不能准确的评估感染量的多少,由于操作等的原因造成的误差也会 比较大,所以只能用在一些定性的研究中,在定量研究中帽对就会应用的比较少。 间接免疫荧光和免疫印迹都能比较直观的看出感染和未感染的区别以及感染量 与感染率的差别,既可以定性,也可以定量的来研究病毒的感染。我们可以根据 感染量或者感染率的变化来观察一些药物或者一些通路的刺激物,抑制物对病毒 感染细胞的影响,这样我们可以评价出病毒感染细胞可能跟什么因素有关, 有利 于我们研究病毒感染细胞的整个过程,这一点这对于我们后续的研究有很大的意 义。 在检测时,我们发现感染病毒之后的蛋白下面地方有 条条带也被显现出来,可能是自身蛋白的降解或者说是病毒表达的一些其他 与类似的蛋白,因为没有被感染的细胞没有这条带。因此这条带并不会影响 我们用此方法来检测病毒的感染。