过继传输T淋巴细胞来源exosomes诱导妊娠丢失孕鼠母胎免疫耐受的研究（可编辑）

过继传输T淋巴细胞来源exosomes诱导妊娠丢失孕鼠母胎免疫耐受的研究（可编辑） 过继传输T淋巴细胞来源exosomes诱导妊娠丢失孕鼠 母胎免疫耐受的研究 河北医科大学 学位论文使用授权及知识产权归属承诺 本学位论文在导师或指导小组的指导下,由本人独立完成‖’ 本学位论文研究所获得的研究成果,其知识产权归河北医科大学所 有。河北医科大学有权对本学位论文进行交流、公开和使用。凡发? 与学位论文主要内容相关的论文,第一署名为单位河北医科大学,试 验材料、原始数据、申报的专利等知识产权均归河北医科大学所有。 否则,承担相应法律责任。 ./ 口;号\, “: ,? ’、 .。 ”?’ 。,’?: 二级学院领导盖章:, ’‘ 一。 .?.一~, 研究生繇嘲导师磅争汐 咖/移;::月匆卧: 。。: 气、 。.‘ 。。%??一: 河北医科大学研究生学位论文独创性声明 本论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果,除了 文中特别加以标注和致谢等内容外,文中不包含其他人已经发表或撰 写的研究成果,指导教师对此进行了审定。本论文由本人独立撰写, 文责自负。 亨 导师签章: 磊“乙 研究生签名:绻剪网 ?年;月绣日目 录 中文摘要英文摘要研究论文 过继转输淋巴细胞来源诱导妊娠丢失孕鼠母胎 免 疫耐受的研究 前言?刖蔷””””一””“””一”“””“一””””””””””“”“””“““”””” 材料与? 结果附蛩 附表 讨论结论? 参考文献 综述淋巴细胞介导的母胎免疫耐受与反复妊娠丢失免疫学发病机制 之间关系的研究进展 致谢 个人简历??中文摘要 过继转输淋巴细胞来源诱导妊娠丢失孕鼠母胎免疫 耐受的研究 摘 要 目的:反复妊娠丢失是指连续三次或以上发生在孕周前的妊娠丢 失,是一种严重危害孕妇身心健康的产科疾病。正常妊娠相当于半同种异 体移植过程,孕妇对半同种异体胚胎抗原不产生排斥反而产生保护性免疫 耐受。因此,控制母体对胚胎抗原的免疫反应是介导母胎免疫耐受的重要 手段。 目前临床常采用免疫细胞过继疗法治疗不明原因反复妊娠丢失 ,诱导受孕母体对半同种异体胚胎抗原的有效免疫耐受。但此种 方法尚存在制备不、疗效不稳定等缺陷,限制了临床推广使用。本研 究采用实验动物模型,比较研究细胞来源的非细胞成分与细 胞成分过继转输对妊娠丢失孕鼠胚胎发育、外周及胎盘局部免疫微环境的 影响,旨在探讨细胞来源作为非细胞成分取代传统细胞疗法 的可行性,为机体免疫耐受的诱导及反复妊娠丢失的免疫治疗研究开辟新 思路。 方法: 雄性无关个体脾细胞及其的制备和初步鉴定:处死/ 雄鼠,无菌解剖取脾,获得单个细胞悬液后与刀豆蛋白共同孵育 ,光镜下观察并计算淋巴细胞转化率,噻唑蓝染色法检测彳彳蛇 值。采用蔗糖密度梯度离心联合超滤技术获得;扫描、透射电 镜观察的形态及结构,紫外分光光度法测定蛋白含量。 建立妊娠丢失动物模型及实验分组:独立饲养未合笼的雌鼠为 未孕对照组?组。将雌雄小鼠随机分组后按:合笼交配; 旱×/杏为正常妊娠对照动物模型仃组,早 ×刖杏为实验动物模型。再将孕鼠随机分为妊娠丢失 组组,孕第天着床期尾静脉注射生理盐水、细胞治疗组 组,孕第天尾静脉注射无关个体/雄鼠脾细胞、非细胞 治疗组. 印组,孕第天尾静脉注射无关个体/中文摘要 雄鼠脾淋巴细胞来源的。 观察胚胎发育情况:将各组孕鼠于妊娠第天分别处死,无菌 条件下解剖胎盘组织,测量后计算胎盘组织体积,将各组吸收胚胎、存活 胚胎分别计数,计算胚胎吸收率及妊娠丢失率。 检测孕鼠外周淋巴细胞免疫功能:将各组孕鼠于妊娠第天 分别处死,无菌条件下解剖取脾,制备脾单个细胞悬液。染色法检 测诱导细胞转化的彳值;细胞破膜处理,直接荧光标记流式细 胞计数分别检测型细胞因子?、.以及?型细胞因子 .、.的表达。 分析孕鼠母胎界面免疫抑制状况:各组孕鼠于妊娠第天分别 处死,无菌条件下解剖胎盘组织,制备石蜡包埋切片。髓染色,光镜下 分别以矩形走形计数个免疫细胞,计算大颗粒淋巴细胞、小淋 巴细胞、巨噬细胞等各类免疫细胞的百分率。免疫组化染色、图像 分析,免疫抑制分子..、.、.等表达强度以灰度值表 示,值大小与阳性表达强度反相关;以矩形走形计数个细胞,分 别计算各组阳性细胞表达百分率。 统计学处理:各组数据均通过.版本软件检验正态性、方差齐, 采用卡方检验比较各组孕鼠胚胎发育情况、母胎界面免疫细胞表达情况; 采用检验对孕鼠细胞免疫功能、胎盘免疫抑制分子的表达进行单因 素方差分析,..法进一步对多个样本均数间进行两两比较。 显著性检验水准萨.。 结果: 雄性无关个体脾脏淋巴细胞来源的初步鉴定 .雄性无关个体脾脏淋巴细胞转化情况 光镜下观察雄性无关个体脾脏淋巴细胞转化率为。%士.% ;法检测无对照组、转化实验组彳值分别为 .士.、.士..,.。 .形态及超微结构观察 扫描及透射电镜下观察可见,细胞来源为脂质双层膜包 围的球体,呈圆形或椭圆形杯口状,有完整胞膜,直径约衄~眦, 内为低电子密度物质。中文摘要 .蛋白定量 紫外分光光度法蛋白定量显示的彳刎值为.士.。 不同过继转输治疗对妊娠丢失孕鼠胚胎发育的影响 正常妊娠对照动物模型组孕鼠的胚胎吸收率为.%,妊娠 丢失组组为.%,过继转输无关雄鼠细胞治疗组、细胞来源 的非细胞治疗组分别为.%、.%。与未经治疗的组 相比,细胞及非细胞治疗组胚胎吸收率均显著下降均尸.,且均下降 至组水平均胗.;非细胞治疗组胚胎吸收率显著低于细胞治 疗组僻.。 组孕鼠的妊娠丢失率为%,组为%,细胞治疗组、 非细胞治疗组分别为%、%。与未经治疗的组相比,细胞及非 细胞治疗组妊娠丢失率均显著下降均氏.,且均下降至组水 平均尸.;两治疗组组间比较无明显差异.。 不同过继转输治疗对妊娠丢失孕鼠外周细胞免疫功能的影响 .检测诱导淋巴细胞转化功能 未经诱导转化时,与未孕雌鼠脾细胞培养后彳值 .士.相比较,组、组及细胞治疗组、非细胞治 疗组孕鼠脾细胞的彳值均显著升高分别为.士.、.士., .士.、.士.,均.。其中,仃组与组之 间无明显差异胗.;细胞治疗组、非细胞治疗组较之显著下调均 氏.,且非细胞治疗组显著低于细胞治疗组.。 经诱导转化后,与未孕雌鼠脾细胞转化彳铆值 .士.相比较,组、组及细胞治疗组、非细胞治 疗组孕鼠脾细胞转化均显著下降分别为.士.、.士.、 .士.、.士.,均氏.。仃组与组之间无明 显差异胗.;细胞治疗组、非细胞治疗组较之显著下调均尸., 且非细胞治疗组显著低于细胞治疗组尸.。 .检测外周/细胞功能 .. 型细胞因子的表达 与灯组脾细胞吖表达百分率.%士.%相比,组 表达百分率显著升高.%士.%,氏.;经细胞治疗、非细胞治疗中文摘要 后显著降低分别为.%士.%、.%士.%,均氏.至 组水平均尸.;两治疗组组间比较无明显统计学意义胗.。 与组脾细胞.表达百分率.%士.%相比,切强组 表达百分率显著升高.址.%,氏.;经细胞治疗、非细胞治疗 后显著降低分别为.%士.%、.土.%,均尸.至彻组 水平均.;两治疗组组间比较无明显统计学意义?.。 .. 型细胞因子的表达 与组脾细胞.表达百分率.%士。%相比,切玛组 表达百分率显著降低.%士.%,.;经细胞治疗、非细胞治疗 后显著升高分别为.%士.%、.%士.%,均氏.至仃 组水平均.;非细胞治疗组显著高于细胞治疗组尸.。 与组脾细胞.表达百分率.%士.%相比,组 表达百分率显著降低.%士.%,氏.;经细胞治疗、非细胞治疗 后显著升高分别为.士.%、.土.%,均.至.组水 平均胗..;非细胞治疗组显著高于细胞治疗组尸.。 不同过继转输治疗对妊娠丢失孕鼠胎盘局部免疫抑制状态的影响 .分析胎盘组织中免疫细胞的种类及数量 各组孕鼠胎盘绒毛中均散在可见大颗粒淋巴细胞、小淋巴细 胞、巨噬细胞等免疫细胞。组各类细胞百分率分别为 .%圪.%、.%埒.%、.%士.%,组分别为 .%圭.%、.%士.%、.%士.%,细胞治疗组分别为 .%士.%、.%士.%、.%士.%,非细胞治疗组分别为 .%圪.%、.%士.%、.%士.%,各组间均无明显差异均 尸.。各组总淋巴细胞百分率分别为.%士.%、.%士.%、 .%士.%、.%士.%,相互之间均无明显统计学意义均 胗.。 .分析母胎界面免疫抑制分子的表达 .、.、.均可呈散在或片状形式阳性表达于各组胎盘 滋养细胞、血管内皮细胞及免疫细胞胞浆中口 .. .表达分析 与组孕鼠胎盘组织中.阳性细胞表达率.%士中文摘要 .%相比,组阳性细胞表达率显著降低.%士.%, 氏.;经细胞治疗、非细胞治疗后显著回升分别为.%士.%, .%士.%,均.至组水平均尸.;两治疗组组间 比较无明显统计学意义渺.。 相比, 与仃组孕鼠胎盘组织中.表达强度.士. 组表达强度显著降低.士.,尸.;经细胞治疗、非细胞治 疗后显著回升分别为.士.、.士.,均.至劬的组水 平均胗.;两治疗组组间比较无明显统计学意义尸.。 .. .表达分析 与组孕鼠胎盘组织中.阳性细胞表达率.%士.% 相比,组阳性细胞表达率显著降低.%士.%,氏.;经细 胞治疗、非细胞治疗后显著回升分别为.%士.%、.%士., 均氏.至组水平均胗.;两治疗组组间比较无明显统计学 意义.。 与组孕鼠胎盘组织中.表达强度.士.相比, 组表达强度显著降低.士.,尸.;经细胞治疗、非细胞治疗后 显著回升分别为.士.、.士.,均尸.至.组水平均 胗.;两治疗组组间比较无明显统计学意义?.。 .. .表达分析 与呐组孕鼠胎盘组织中.阳性细胞表达率.%士.% 相比,组、非细胞治疗组阳性细胞表达率显著降低分别为 .%士.%、.钍.%,均.,两组组间比较无明显统计学 意义.;经细胞治疗后表达百分率较组显著回升 .%士.%,.,可回升至仃组水平均户.。 与仃组孕鼠胎盘组织中.表达强度.士.%相比, 组表达强度显著降低.士.,氏.;经细胞治疗、非细胞治 疗后显著回升分别为.士.、.士.,均.至曲?组水 平均尸.;两治疗组组间比较无明显统计学意义?.。 结论: 过继转输雄性个体外周淋巴细胞或其非细胞成分均可有效诱 导母胎免疫耐受,有利于妊娠的正常进行。中文摘要 过继转输雄性个体淋巴细胞分泌的非细胞成分可发挥较过继 转输淋巴细胞更强的母胎免疫耐受诱导效应。 雄性个体外周淋巴细胞及其分泌的非细胞成分均可通过共同 或相似的作用途径引发母体偏移、胎盘适度的局部免疫抑制,有效 诱导母胎免疫耐受。 雄性个体细胞来源的非细胞成分可作为有效诱导母胎免疫 耐受的生物学制剂,有望取代传统淋巴细胞过继免疫治疗。 关键词:妊娠丢失;过继转输;淋巴细胞; ;免疫耐受; 小鼠英文摘要 ?. . ?廿 : 蝴 .砒 . 廿.铋廿.觚 觚删. ?. 幽 ., , 硒 觚.. . 曲 , , 证 ? 、 , ., 础 , ,:鼬时 . .越 , , . ?巧 ,耐 毋仔 洫萨 . 行 时? 砒芏 印 , . : 仔 :/ ,英文摘要 . 以 , 彳 曲 . . 舰伍 . 舰, .曲 、? 托彳. 仃臼 讪 洲:早 ? . “池 :,/早 嘶 彻 /早 ×/ . / . ×/硒 ?峪 删 、?姗 讹 ,埘 灯 , 恤 ,、? 巧 印 / 仔 , 蝴 ?曲 ,丘 . / :, 铲 , ? ,. ” 印: / , 百 印.彳仰; 、? 曲不.螂抛吖,一 帅皿一,? 啪町 . ?. .: / 嘶 黟 , 英文摘要 .腼 胁协,池切, , 玛伊孤. 们钟 ,掣’ 四’?’一 ,一.廿,协. 切 僦.. 妙:,? 巧 叩,彻 .? 丑 /叫【玉沛 , . : : 的 科 .】 ”仃 .士.% 咖 .彳识 .士. .士. 曲 ,. . 仃 . 阳盯 印 舶 啪曲 , . ? ~ . 啦 . . .士.. 】拶彳英文摘要 . 也 拶 协吼 锄【, 叩、? .% .%, 印鲫【.% .%. 玎娼舭 叫 , 西 ? 慨 印锄劬尸. 也.. 】 :? 巧 铲,也 驴..% 锄 仃鲈 ? %, 戗印 讹 %%. , 协觚 上.弱 撕铆。 锄尸., 铲 :..仃 吼劬 ” . ~ 血彳铆 疔 士. 胁 】珞, . ,铲 ,船?.土.,.士., .士. .士., .昀 .. 觚 尸., ,? 唧 , 吐 嘶枷 ., 铲,. 鲥 圭铲 尸.. 舭, 班 舶 ~ .士. , , 英文摘要? , 孤 .士., .士..士.,.士. ,枷 印尸.. 铆 .觚 ,伊 尸., ?, 尸.., 印 , 印笋 .. . 姗 门眦舶 舐 啪 .. 一 砒 丘 吖 骶弘.%士.%, .%士. %,尸.. ; 印.%土.% .%士.%“, 印 枷氏.似 鲫尸., 伊 尸..一 丘.%士.%, .%士.%,. ; 印 ? .%士.% 印 .士.%, 鲥尸..铆觚 弘 胗., 仃 .. ..,一 仔.%士.%, .%士.%,尸.. ;铲 ? .%士.% 印 .%士.%, .胗., , ? 印 .. 一自 切%士.%, . ;印炒.%士.%,. .士.% . .士.%, 印 吼 础.尸., 鲈,? .. 印伊 ?缸.;配自 . 撇铲 ,:吮姗 巧 仃伊、? 铲. .%士. %,.%圭.%锄 .%士.%, .%士. . %士.%,.%士.% %, 黟 .%士.% .%士.%, 鲈 .%士.%, 掣 .%士.%,? .%士.% .%士.%.蚴 巧伊 .. 铲 .%士.%. .%土.%,.%士.%,.%士.%咖 咖,铲尸.. .? 『?,一,一 ” , ,觚. .. ? 行 眦 .%士.%,铲 %士.%,. . ; ?.%士.% 印 英文摘要.%士.%,也 盟 . 【胗.,甜 虢 帆帆 讹她.. 印肌 舶 也, 土..士.,. ;.士..士. , . ., 训行 、僦恤俨.. .. 一 矗 仃 .%士.%, 鲥删.址.%,.; .%士. ? .%土.% 印 印锄氏. ,也 尸.,觚觚? .. 吼 池? 舶 .士. , 印 .士.,.; 印 .士. .士. , . 肌胗., 饥. ?粥 、,咖 .. ..吣 洫 舶 嘶 .%士.%, 印 .%士.%, . 铆 .士.%, 觚 ; 廿, 尸..英文摘要印.址.%,氏. 恤 尸.. 舶 仃切强. 士.%, 伊 印.士.,. ;恤印 ? .士. .士. 印 ,. 觚 胗.,刮旧 、?铆。朗呻 讹 .. : ? 仃佗 耐巧 . , . . 如 ? 王 .. 行 证 伍 . . , ?埘【 丘 . 酉眦眦, 四印 . : 印 ; 锄; ”; ;; 研究论文 过继转输淋巴细胞来源诱导妊娠丢失孕鼠母胎免疫 耐受的研究 屿刍 翮 看 正常妊娠相当于半同种异体移植过程,孕妇对半同种异体胚胎抗原不 产生排斥反而产生保护性免疫耐受。若胚胎所携带的父系抗原刺激母体产 生的免疫应答对胎儿产生免疫排斥,则导致妊娠失败。因此,控制母体对 胚胎抗原的免疫反应是介导母胎免疫耐受的重要手段【。 临床病因不明的反复妊娠丢失又称不明原因反复自然流产 ,,与母体免疫因素所 『 伽 致母胎免疫耐受缺失直接相关【】,已成为目前人们关注的热点。目前常采 用父方免疫细胞过继转输进行治疗,但此方法尚存在制备不规范、疗效不 稳定等缺陷,限制了临床推广使用【】。因此,治疗方案仍需改进,以进一 步提高疗效,规范制备并方便临床应用。现有资料表明,采用丈夫或无关 男性个体淋巴细胞过继治疗的疗效无统计学差异,且发挥免疫耐受诱导功 能的主要是淋巴细胞【】,说明父方、非父方等不同父系来源的淋巴细胞 均可发挥相似的诱导效应【】。这提示我们,存在于不同男性个体或不同 雄鼠细胞上的某些共同抗原成分或表位发挥了诱导免疫耐受的作用, 找到携带这些共同抗原成分的载体是有效诱导母胎免疫耐受的关键。最近 研究发现,细胞在生长增殖过程中可分泌释放一种称为的膜 性微囊结构睁】。与细胞相比,细胞分泌的作为一种非细胞 成分可克服细胞成分治疗的诸多缺点。据此我们推测,父系或无关男性个 体细胞来源的可稳定、高效地诱导母胎免疫耐受。 因此,本实验通过提取无关雄性个体外周淋巴细胞分泌的 ,采用动物实验模型比较研究过继转输对妊娠丢失孕 鼠胚胎发育及母胎免疫耐受状况的影响,探讨其作为治疗的非细 胞成分生物学制剂取代传统细胞疗法的可行性及免疫学作用机制。此方面 的研究国内外尚无相关报道,我们已申请了一项国家发明专利【】,旨在为 免疫耐受的诱导及的免疫治疗研究开辟新思路。研究论文 材料与方法 材料 .实验动物 实验动物为清洁级周龄~雌性早、北雄性、/ 雄性近交系小鼠。/杏购于河北医科大学实验动物中心,动 物许可证号冀.。;刖杏、旱均购自中国医 学科学院动物实验研究所,许可证号?京一。早 只,/杏只,/只;饲养环境恒温、恒湿哆扣%, 定期消毒饲养空间,无菌处理饮水、饲料、所用垫料及其与动物密切接触 的物品。 .主要仪器 黑龙江省鸡西市医疗器械厂 立式高压蒸汽消毒器 江苏太仓医用仪器厂 .型恒温水浴箱 .型超净工作台 苏州净化设备厂 美国公司 型培养箱 日本肿公司 ..型倒置显微镜 型电子天平 美国姒公司 日本砧吖公司 型干燥箱 .型快速离心机 日本??公司 日本姐公司 型超高速低温离心机 型酶联免疫检测仪 芬兰 公司 .跹型流式细胞检测仪 美国 日本岛津公司 讥型紫外分光光度仪 日本公司 型扫描电镜 .型透射电镜 日本?公司 德国公司 蝴组织切片机 型医用微波炉 浙江临安爱迪仪器厂 研究型光学显微镜图像分析系统 美国公司 .主要试剂 常规?.完全培养液为美国们公司产品每升完全培养研究论文 液含%胎牛血清、/,青霉素、 咖链霉素;胎牛血清为天 津市灏洋生物制品科技责任有限公司产品,青霉素及链霉素为华北制药集 团产品。伽、’用. .的配制成/、蔗糖/密度 垫、二甲基亚砜均为美国公司产品。标记的抗小鼠单 克隆抗体.、.、.、也.为美国公司产品;臼试 破膜剂为法国 公司产品含破膜试剂、破膜试剂。 显色试剂盒.、多聚赖氨酸、第一抗体抗小鼠.、.、 .单克隆抗体、第二抗体山羊抗小鼠、辣根过氧化物酶标记链 霉卵白素工作液.脓均为河北博海生物工程开发有限公司分装美国 釉公司产品。 方法 .建立实验动物模型 按:合笼交配雌雄小鼠,~旱×/杏为正常妊娠对照 动物模型,仃旱×舭为妊娠丢失动物模型。自合笼之日起, 分别于每天:和:观察各组雌鼠阴栓一次,检出阴栓计为妊娠第 天。 .过继转输细胞及非细胞成分的制备 ..雄性无关个体脾细胞的制备 断颈处死/雄鼠,无菌条件下解剖取脾,目铜网过滤获得 脾单个细胞悬液;清洗,印离心,弃上清;双蒸水低渗 破裂红细胞后,迅速加入等量.%恢复等渗环境;清洗次, 台盼蓝排除法测细胞活力%后,调整细胞浓度备用。 .. 诱导淋巴细胞转化 取分离所得的雄性无关个体脾脏单个细胞悬液并加入认,调整细 胞终浓度为.×/札,终浓度为舢;%、?培养箱 中共同孵育后,取沉淀细胞涂片,自然干燥后以%酒精固定, 经苏木精?伊红染色,光镜下观察淋巴细胞转化情况,计算淋巴细胞转换 率转化的淋巴细胞数/计数的淋巴细胞×%。同时,采用法 检测孵育后彳彳值。 ..雄性无关个体脾脏淋巴细胞来源的制备及初步鉴定 ... 的提取研究论文 采用蔗糖密度梯度离心联合超滤技术【。 】,具体操作步骤如下。取一 定数量的雄性无关个体脾细胞经诱导转化后的细胞培养上清,以 离心去除细胞及细胞碎片,分子量超滤管过滤浓缩; 以‖“蔗糖/为密度垫,超速低温离心,收集缓冲 垫;稀释后再次超高速低温离心,获得的响无菌过滤分装后 .?保存备用。 ...电镜观察 取皿悬液滴于载样铜网上,室温静置;用滤纸从 侧面吸干液体,滴加/磷钨酸.约皿于铜网上,室温负染 ;滤纸吸干负染液后,白炽灯下烤 ,扫描电镜 ,下观察。 后,弃去上清, 将获得的诱导转化淋巴细胞悬液印离心 经%戊二醛一锇酸双重固定、脱水、浸透、包埋、聚合、切片、染色等 一系列步骤后,制成透射电镜标本,透射电镜 ,下观察。 ...蛋白定量测定 将提取的原液按照:稀释;调零后,使用紫外分光 光度仪检测衄波长的么值彳。 .实验分组及免疫过继转输 独立饲养未合笼的雌鼠为未孕对照组?印觚,与 /杏合笼的旱为正常妊娠对照动物模型们组,与 ~合笼的~早为峪实验动物模型。再将孕鼠随 机分为妊娠丢失组?组,孕第天着床期尾静脉注射生理盐水、细 胞治疗组 印组,孕第天尾静脉注射无关个体/雄 鼠脾细胞、非细胞治疗组妯. 组,孕第天尾静脉注射 无关个体/雄鼠脾淋巴细胞来源的。每组均。 .观察胚胎发育状况 各组孕鼠于妊娠第天分别处死,无菌条件下解剖胎盘组织。 清洗两次除去血凝块,观察胚胎发育情况,计算胚胎吸收率及妊娠丢 失率。胚胎吸收的判断【】:胎盘体积明显缩小?/;小于 同孕龄正常孕鼠胎盘单位平均体积减去个标准差者;孕鼠胎盘单位研究论文 有明显出血或坏死。胚胎吸收率【丢失胚胎数/丢失胚胎数存活胚胎数】 ×%,即【/沁】×%,为丢失胚胎数,为存活胚胎数。 妊娠丢失率丢失胚胎的个体数/总例数×%。 .分析孕鼠外周淋巴细胞免疫功能 ..制备孕鼠脾细胞 各组孕鼠于妊娠第天分别断颈处死,无菌条件下解剖取脾, 目铜网过滤,获得脾单个细胞悬液;清洗,印离心, 弃上清,加入双蒸水低渗破裂红细胞后,迅速以等量.%恢复等渗 环境;清洗次,台盼蓝排除法测细胞活力%后,调整细胞浓度 备用。 ..检测淋巴细胞转化功能 各组孕鼠脾细胞浓度调整为׉,在孔培养板中,各实验 孔每孔加入脾细胞、舭各皿;并设立单纯脾细胞对照孔、 培养液对照孔;均设三复孔。%、?培养箱中孵育,加入 ,震荡后继续孵育;培养结束后 /此于培养结束前 离心吸弃孔内上清液,每孔分别加入 此,震荡,酶联免 疫检测仪检测波长的彳值彳。 ..检测外周厂细胞功能 各组孕鼠脾细胞浓度调整为×/,个管中分别置细胞悬 液止,每管中分别加入破膜试剂此,常温孵育; 含.%胎牛血清清洗次,印离心,弃上清后加入 仃扭破膜试剂止,常温孵育;叩离心后弃上 清,再分别加入标记的单克隆抗体工作液?、儿.、.、. 此,?避光孵育。清洗两次,目滤网过滤后,即刻上 流式细胞仪检测阳性细胞表达率。每次均设淋巴细胞门,阴性对照设为相 同荧光素标记的小鼠 ,应用心?.软件分析所有数据。 .分析孕鼠胎盘组织免疫抑制状况 ..制备胎盘组织石蜡包埋切片 取材:各组孕鼠于妊娠第天分别处死,无菌条件下解剖 胎盘组织。清洗除去血凝块,无菌刀片切割组织至大小约 .×.×.:研究论文 、%乙 固定和包埋:%多聚甲醛进行固定,经%乙醇 两次、%乙醇 醇 、%乙醇 两次、%乙醇 两次后,用铜制模具包 两次、?石蜡 两次、二甲苯透明 埋组织块; 、切片:用组织切片机切片,每片厚度约岬;组织切片附于经多聚 赖氨酸附膜的载玻片上,?过夜。 ..分析胎盘组织中免疫细胞 ...常规陋染色 两次、%乙醇 两次、无水乙醇 将切片浸于二甲苯中 两次, 两次、%乙醇 两次、%乙醇 两次、%乙醇 ,清水冲洗; 自来水冲洗、清洗两次;浸入苏木精染液中染色 .%盐酸酒精中分色数秒,清水冲洗;浸入氨水中数秒返蓝,使细胞核变 成蓝色,清水冲洗;再浸入伊红染液数秒,清水冲洗;最后分别置于% 脱水;?温箱内干燥 酒精数秒,%酒精数秒,%酒精 后,滴加中性树胶,加盖玻片晾干封固。 ...分析免疫细胞种类及数量 油镜下观察总淋巴细胞包括样大颗粒淋巴细胞、小淋巴 细胞、巨噬细胞等免疫细胞。每一张髓染色片随机选取个视 野,以矩形走形计数个免疫细胞,分别计数不同细胞所占的百分率。 细胞百分率各类免疫细胞数/×%。 ..分析母胎界面免疫抑制分子的表达 ...免疫组化染色步骤 两次、无水乙醇 常规脱蜡至水:将切片浸于二甲苯中 两次、 两次、%乙醇 两次、%乙醇 两次、%乙醇 %乙醇 两次,清水冲洗、清洗两次; 内源性过氧化物酶的灭活:将切片浸入%甲醇过氧化氢液中,常 温 ; ,蒸馏水冲洗次,每次,清洗次,每次 、抗原热修复:将切片浸入柠檬酸缓冲溶液中,水溶加热至?时计 时 ,取出冷却至常温,清洗次,每次 ; ;甩去 封闭:滴加正常山羊血清封闭液于切片上,常温孵育 多余液体,不清洗;研究论文 滴加第一抗体::分别稀释抗小鼠单克隆抗体.、、 .,阴性对照设为代替第一抗体的;分别滴加稀释的第一抗体, ?湿盒中过夜,清洗次,每次; 滴加第二抗体:分别滴加相应的山羊抗小鼠,湿盒中?孵育 ; ,清洗次,每次 生物素化:将辣根过氧化物酶标记链霉卵白素工作液?/脓滴 ; ,清洗次,每次 加于切片上,湿盒中?孵育 显色:使用显色试剂显色剂、、各一滴加入 ,镜下控制反应时间,至明 蒸馏水中,混匀加至标本上,常温显色 显棕黄色颗粒出现于阳性染色部位,而背景无阳性显色,充分清水冲洗, 蒸馏水清洗次,每次 ; 复染及梯度酒精脱色:苏木素复染细胞核,充分清水冲洗、 、 %盐酸酒精分色、%氨水返蓝、充分清水冲洗;再经%乙醇 %乙醇 、%乙醇 两次、%乙醇 两次、无水乙醇 两次、中性树胶封片。 两次脱水;二甲苯透明 ...分析胎盘组织中免疫抑制分子阳性表达范围及强度 判定阳性染色结果:镜下观察,阳性染色为胎盘组织中细胞胞浆内出 现清晰棕黄色颗粒,阴性为细胞未着色或轻微着色。每一指标观察张免 疫组化染色片,高倍镜×下每张染色片以矩形走形观察个以上 视野,计数个细胞,计算阳性细胞百分率。阳性细胞百分率阳性细 胞数/×%。 图像分析:显微镜的光圈和亮度调整至最适观察参数,在整个测定指 标的过程中保持不变。染色区域先在低倍镜×下找到,再转换至 高倍镜×下观察,图像分析随机选取的个视野。视野中阳性染 色强度以灰度值定量表达;取值范围为~,阳性染色越弱 其数值越大,阳性染色越强数值越小。每份标本图像分析的均以个 视野所测的平均值代表该结果。 统计学处理 所有数据通过.版本软件包检验正态性、方差齐,均以;姆 表示,各组孕鼠胚胎吸收率、妊娠丢失率、胎盘组织阳性细胞百分率之间 差异分别以卡方检验进行比较,各组孕鼠脾细胞中细胞转化、佃研究论文 型细胞因子、胎盘组织免疫抑制分子表达之间差异分别以单因素方差分析 进行比较,多个样本均数间采用.法进一步两两比较。显著性检验 水准萨.。 结 果 雄性无关个体脾脏淋巴细胞来源的初步鉴定 .雄性无关个体脾脏淋巴细胞转化情况 光镜下观察雄性无关个体脾脏淋巴细胞转化率为.%圭.% .;法检测无认对照组、转化实验组彳值分别 为.士.、.士.,氏.。 .形态及超微结构观察 扫描及透射电镜下观察可见,细胞来源为脂质双层膜包 围的球体,呈圆形或椭圆形杯口状,有完整胞膜,直径约~, 内为低电子密度物质。. .蛋白定量 紫外分光光度法蛋白定量显示的彳值为.士.。 不同过继转输治疗对妊娠丢失孕鼠胚胎发育的影响 正常妊娠对照动物模型组孕鼠的胚胎吸收率为.%,妊娠 丢失组组为.%,过继转输无关雄鼠细胞治疗组、细胞来源 的非细胞治疗组分别为.%、.%。与未经治疗的切烙组 相比,细胞及非细胞治疗组胚胎吸收率均显著下降均氏.,且均下降 至组水平均尸.;非细胞治疗组胚胎吸收率显著低于细胞治 疗组.。., 咖组孕鼠的妊娠丢失率为%,组为%,细胞治疗组、 非细胞治疗组分别为%、%。与未经治疗的组相比,细胞及非 细胞治疗组妊娠丢失率均显著下降均户.,且均下降至组水 平均尸.;两治疗组组间比较无明显差异?.。., 不同过继转输治疗对妊娠丢失孕鼠外周细胞免疫功能的影响 .检测诱导淋巴细胞转化功能 未经诱导转化时,与未孕雌鼠脾细胞培养后彳值治疗组、非细胞治 疗组孕鼠脾细胞的彳值均显著升高分别为.士.、.士., .士.、.士.,均尸.。其中,们组与组之 间无明显差异胗.;细胞治疗组、非细胞治疗组较之显著下调均 氏.,且非细胞治疗组显著低于细胞治疗组.。., 经认诱导转化后,与未孕雌鼠脾细胞转化彳铆值 .士.相比较,臼.组、组及细胞治疗组、非细胞治 疗组孕鼠脾细胞转化均显著下降分别为.士.、.士.、 .士.、.士.,均氏.。组与组之间无明 显差异胗.;细胞治疗组、非细胞治疗组较之显著下调均., 且非细胞治疗组显著低于细胞治疗组氏.。培, .检测外周厂细胞功能 .. 型细胞因子的表达 与舡组脾细胞吖表达百分率.%士.%相比,组 表达百分率显著升高.%士.%,尸.;经细胞治疗、非细胞治疗 后显著降低分别为.%?.%、.%士.%,均尸.至们 组水平均尸.;两治疗组组间比较无明显统计学意义.。., ., 与组脾细胞.表达百分率.%士.%相比,组 表达百分率显著升高.%士.%,尸.;经细胞治疗、非细胞治疗 后显著降低分别为.%士.%、.士.%,均.至组 水平均.;两治疗组组间比较无明显统计学意义?.。., ., .. 型细胞因子的表达 与组脾细胞.表达百分率.%士.%相比,组 表达百分率显著降低.%士.%,尸.;经细胞治疗、非细胞治疗 后显著升高分别为.%士.%、.%士.%,均氏.至? 组水平均尸.;非细胞治疗组显著高于细胞治疗组尸.。., ., 与组脾细胞.表达百分率.%士.%相比,组 表达百分率显著降低.%士.%,尸.;经细胞治疗、非细胞治疗研究论文 后显著升高分别为.士.%、.士.%,均.至组水 平均.;非细胞治疗组显著高于细胞治疗组尸.。.,., 不同过继转输治疗对妊娠丢失孕鼠胎盘局部免疫抑制状态的影响 .分析胎盘组织中免疫细胞的种类及数量 各组孕鼠胎盘绒毛中均散在可见大颗粒淋巴细胞、小淋巴细 胞、巨噬细胞【等免疫细胞。组各类细胞百分率分别为 .%士.%、.%士.%、.%士.%,组分别为 .%士.%、.%圭.%、.%士.%,细胞治疗组分别为 .%士.%、.%士.%、.%士.%,非细胞治疗组分别为 .%士.%、.%士.%、.%士.%,各组间均无明显差异均 胗.。各组总淋巴细胞百分率分别为.%士.%、.%士.%、 .%士.%、.%士.%,相互之间均无明显统计学意义均 尸.。.,’ .分析母胎界面免疫抑制分子的表达 .、.、.均可呈散在或片状形式阳性表达于各组胎盘 滋养细胞、血管内皮细胞及免疫细胞胞浆中。 .. .表达分析 与仃组孕鼠胎盘组织中.阳性细胞表达率.%士 .%相比,组阳性细胞表达率显著降低.%士.%, .;经细胞治疗、非细胞治疗后显著回升分别为.%士.%, .%士.%,均尸..至组水平均胗.;两治疗组组问 比较无明显统计学意义.。., 相比, 与组孕鼠胎盘组织中.表达强度.士. 组表达强度显著降低.土.,氏.;经细胞治疗、非细胞治 疗后显著回升分别为.士.、.士.,均.至组水 平均.;两治疗组组间比较无明显统计学意义眵.。妒,., .. .表达分析 与组孕鼠胎盘组织中.阳性细胞表达率.%士.% 相比,组阳性细胞表达率显著降低.%士.%,尸.;经细 研究论文 胞治疗、非细胞治疗后显著回升分别为.%鹋.%、.%士., 均.至仃组水平均胗.;两治疗组组间比较无明显统计学 意义.。., 与们组孕鼠胎盘组织中.表达强度.士.相比, 组表达强度显著降低.士.,尸.;经细胞治疗、非细胞治疗后 显著回升分别为.士.、.士.,均.至.组水平均 尸.;两治疗组组间比较无明显统计学意义渺.。.,., 【 .. .表达分析 与组孕鼠胎盘组织中阳性细胞表达率.%士.% 相比,组、非细胞治疗组阳性细胞表达率显著降低分别为 .%士.%、.士.%,均尸.,两组组间比较无明显统计学 意义.;经细胞治疗后表达百分率较组显著回升 .%士.%,.,可回升至组水平均尸.。., 与缸组孕鼠胎盘组织中表达强度.士.%相比, 组表达强度显著降低.士.,.;经细胞治疗、非细胞治 疗后显著回升分别为.士.、.士.,均.至们组水 平均尸.;两治疗组组间比较无明显统计学意义?.。., 培,??: ????????壅垒查 × × × ×。印。。。 。。 ? 协 ???: : :氏 腩。 . ‰。印。 。‰舶 : 巧 印 : 腩 仃眦 . 印行 : : 认 /也” ”矗的 印 。吲 ‰ 。 印? 。 。 。。 姗 ? : :研究论文 ????????????????????’??????????????????????????????一 ~埔.:诈幢 ~上口: 胴上 伽 . . 控 .% 鼍% .% .孽% 憎 竹 ?釜 ? , ?? 毋 俐 瑟。 弘 羔囊% 雾?弭 孽: 斓 糕 【州嵋.: 目止 ~皤上:序幢 伸 埘 竹 ..警 /.铽:《: ?广不 ’口? 吖 丘. 仃 : :;. : ? : 一舯?.:芹崆口 ’簟叼?.啪:嗣? 棚?上:锄。幢? ~.:叫 ?。 。舶 。印 】 :研 :‰ : : . ~.堑垄垒圭 ‘再~上帕:昕 一州?.:一心 鼍 垤.: 狮 删.:凡解 ”行 ? : : : . : 研究论文阱心口 俨们?嵋.啪: ’硼上:’口一也? 肝垃口 州?.:断 ? ’?.:一 . 肋印 : :研:? : 印