细胞生长曲线的测定

细胞生长曲线的测定 (一)细胞生长曲线的测定(细胞计数法) 1(取生长良好接近汇合的细胞，用胰酶消化，用新培养基制成细胞悬液后计数(见四、细胞传代培养的实验步骤)。如是非粘壁细胞，则离心弃旧培养基后，换上一定量的新鲜培养基然后制成细胞悬液计数。 42(根据细胞计数结果按每个小方瓶5×10,mL作传代培养接种细胞，共接种21瓶细胞。 3(24 h后开始计数细胞，以后每隔24 h计数一次，每次取3瓶细胞，分别进行计数。计算平均值。连续计数7 d。 4(根据细胞计数结果，以单位细胞数(细胞数,mL)为纵坐标，以时间为横坐标绘制生长曲线。(细胞计数方法请参照实验三) (二)细胞生长曲线测定(MTT法) 1(制备1 mL细胞悬液。空白对照以1 mL培养基代替细胞悬液。加入0(1 mL MTT于37?孵育4 h。使MTT还原为蓝紫色甲月赞结晶。 2(加1 mL DTW脱色液，37?至少静置30 min(甚至过液)，使甲质颗粒充分溶解。 3(吸取200 μL该溶解液至96孔板孔中，在酶标仪上读取OD值，检测波长570 nm，参考波长630 nm。 4(每隔24 h测量一个点，每个点为3个平行样品的平均值。 (二)细胞蛋白电泳 一.细胞总蛋白抽提细胞裂解液 三去污裂解液:50 mmol/L Tris-cl (pH 8.0)，150 mmol/L NaCl，0.2 g/L叠氮钠，1 g/LSDS，100 mg/L Aprotin，10 g/L NP-40，5 g/L去氧胆酸钠，100 mg/L 苯甲基磺酰氟(PMSF) 总蛋白抽提程序: 1.PBS洗细胞3 次 2.加入裂解缓冲液(1.5x10 6 个细胞大约加入100µL 裂解液，或100ml细胞瓶中加入100µL 裂解液)，冰上放置20min 3.收集裂解液 4.离心，12000转，2~10min 5.吸取上清，蛋白定量，分装，保存在-78度备用。 试剂: 1. 30% 聚丙烯酰胺:29g 丙烯酰胺，1g N,N'-亚甲双丙烯酰胺，100ml 水，0.45um 滤膜过滤，棕色瓶，室温保存 2. 10% 过硫酸铵:1g 过硫酸铵，10ml 水，4?保存 3. 10% SDS:100g SDS，1000ml 水，68?助溶，pH 7.2 4. TEMED:lml TEMED，99ml 水，棕色瓶，4?保存 5. 5X Tirs-甘氨酸电泳缓冲液:15.1g Tirs碱，94g 甘氨酸，50ml 10%SDS，1000ml 水，使用时配制成1X 【操作步骤】 l.将电泳槽玻璃板洗净，吹干，安装好; 2.用1,的琼脂糖电泳缓冲液(1g琼脂糖溶于100ml电泳缓冲液)封严玻璃板的边和底(保证不漏胶); 3.配分离胶，将配好的分离胶立即倒入凝胶槽内，至凝胶槽高三分之二处，加入蒸馏水密封。待胶凝固后，约需 30min，倒掉水，用吸水纸吸干; 4.配浓缩胶，将配好的浓缩胶立即倒入凝胶槽内(以插入梳子不溢出为宜)，插入梳子; 5.待胶凝固后，拔出梳子，加入电泳缓冲液(淹没胶，但不高于电泳槽): 6.样品处理:取蛋白或样品20μl，加入20μl样品缓冲液，混匀，100?水浴加热3~5min，然后加入10μl溴酚兰溶液(0.05,)，混匀; 7.加样:将处理好的样品10μl加入到凝胶孔中，连接电泳仪; 8.电泳:打开电源，调整电压至100V，开始电泳，待样品全部进入凝胶后，将 剂(溴酚兰)到达凝胶的底部距离下缘1cm时停止电泳，电压调至120V，待指示 取下玻璃板，小心地把其中一块玻璃板从凝胶上取下来，测量分离胶的长度及分离胶上沿至溴酚蓝带中心的距离，取出分离胶(注意保持胶的完整性)