辛伐他汀和罗格列酮对内皮祖细胞的影响

辛伐他汀和罗格列酮对内皮祖细胞的影响 刘蓉,等.辛伐他汀和罗格列酮对内皮祖细胞的影响.20l1年第32卷第6期研究 辛伐他汀和罗格列酮对内皮祖细胞的影响 刘蓉,刘铭雅,魏盟,马士新 (上海交通大学附属第六人民医院心内科,上海200233) ? 论文? 摘要:目的探讨辛伐他汀和罗格列酮对内皮祖细胞(EPC)增殖,分化,迁移和集落形成能力的影响.方法以密度梯度 离心法获取人外周血单核细胞,将其接种于人纤连蛋白包被的培养板上,以EBM一2培养基培养.分别采用MTT比色法, 改良Boyden小室法,甲基纤维素培养基培养法观察辛伐他汀和罗格列酮对EPC增殖,迁移和集落形成能力的影响.培养 7天后采用免疫荧光法和流式细胞仪比较两种药物对EPC分化的影响.结果两组EPC的增殖和集落形成能力均提高.辛 伐他汀组EPC迁移能力提高,但罗格列酮组未见此作用.两药均能促进EPC的分化,罗格列酮组促进EPC向内皮细胞分 化的作用更强,而辛伐他汀组促进EPC向平滑肌细胞分化的作用更强.结论辛伐他汀和罗格列酮均能促进EPC的增殖和 分化. 关键词:内皮祖细胞;辛伐他汀;罗格列酮 中图分类号:R972+.6:R977.15文献标志码:A文章编号:1672—9188(2011)06—0345.07 Effectsofsimvastatinandrosiglitazoneonendothelialprogenitorcells LIURong,LIUMing—ya,WEIMeng,MAShi—xin fDepartmentofCardiology,ShanghaiNo6PeopleHospital,ShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai200233,China) Abstract:ObjectiveToinvestigatetheeffectsofsimvastatinandrosiglitazoneontheproliferation,differentiation, migrationandcolonyformationofendothelialprogenitorcells(EPCs).MethodsHumanperipheralbloodmononuclear cellswereisolatedbydensitygradientcentrifugation,andwereplantedonfibronectin— coatedplatesandculturedinEBM-2 medium(supplementedwithEGM-2singleQuots).Theproliferation,migrationandcolonyformationofEPCswereassayed withMTTassay,modifiedBoydenchamberassay,andmethylcellu1Osemediumculturedrespectively.After7daysof culture,theeffectsofsimvastatinandrosiglitazoneonthedifferentiationofEPCswereidentifedbyimmunofluorescence andflowcytometry.ResultsTheproliferationandcolonyformationofEPCswereelevatedinbothgroups.Themigration ofEPCswaselevatedonlyinsimvastatingroup.BothgroupscouldpromotethedifferentiationofEPCs.Howeve~EPCs inrosiglitazonegroupshowedmoredifferentiationtoendotheliocytes,whileEPCsinsimvastatingroupshowedmore differentiationtosmoothmusclecells.ConclusionBothsimvastatinandrosiglitazonecanenhancetheproliferationand di仃erentiationofEPCS. Keywords:endothelialprogenitorcell;simvastatin;rosiglitazone 收稿日期:2011-01—12;修回日期:2011-05—20 作者简介:刘蓉,医学硕士,从事心血管疾病的l临床诊治工作. 通信作者:魏盟,医学博士,主任医师,教授,博士研究生导师.主 要从事冠心病及介入心脏病等的研究和临床工作,开展的多项介入心脏 病学技术为国内率先开展并报道,如经桡动脉路径冠状动脉手术,冠状 动脉内多普勒描记及经胸超声指导房间隔封堵术等.现任中华医学会心 血管病学分会委员,中国医师协会心血管内科医师分会委员,中华医学 会心脏介入中心学术委员,上海医学会心血管病专业委员会副主任 委员.发表论文6O余篇,主持多项国家及上海市科研课,其中经桡动 脉路径冠状动脉手术和冠状动脉内多普勒描记技术分别于2002年及2005 年获上海市医疗成果三等奖和教育部科技进步二等奖.2004年起享受国 务院政府特殊津贴. 基金项目:上海市卫生局青年基金(编号:034Y10) 治疗性的血管新生是近年来冠心病治疗研究的 新领域,为临床治疗冠心病等缺血性疾病提供了新 的方向,并成为挽救缺血组织完整性及功能的重要 策略之一.内皮祖细胞(EPC)可以特异性地分化为 血管内皮细胞,参与血管新生,尤其是缺血组织的 血管新生,从而改善缺血组织的血液供应. 他汀类药物和噻唑烷二酮类药物已经证实具 有改善内皮细胞功能的作用u..本研究以辛伐他 囡 0,.,0一_30. 圈 汀和罗格列酮为研究药物,旨在探讨这两类药物对 EPC增殖,分化和迁移能力的影响,为临床药物干 预治疗提供进一步的依据. 1与方法 1.1材料和仪器 人纤连蛋白,异硫氰酸荧光素(FITC)标记的 荆豆凝集素(FITC—UEA一1),Ficoll淋巴细胞分离 液(Histopaque一1077),Cy3标记的鼠抗人0【一平滑 肌肌动蛋白(.SMA)单克隆抗体及四甲基异硫氰 酸罗丹明(TRITC)标记的羊抗兔IgG购自Sigma 公司;兔抗人血管性血友病因子(vwF)抗体购自 DAKO公司;EBM一2培养基及EBMsingleQuots 购自Cambrex公司;Dil标记的乙酰化低密度脂蛋 白(Dil—acLDL)购白BTI公司;四甲基偶氮唑盐 (MTT)购白华美公司,进口分装. 辛伐他汀,片剂,生产批号:06097,规格: 每片20mg,杭州默沙东制药有限公司生产;罗 格列酮,片剂,生产批号:0606808,规格:每片 4mg,葛兰素.史克(中国)有限公司生产. 改良的Boyden小室购自江苏海门麒麟医用仪 器倒置光学显微镜(DMI3000)购自Leica公司, 荧光显微镜(E200)购自Nikon公司. 1.2方法 1.2.1外周血EPC分离,培养及试验分组 根据文献u,无菌条件下,采集健康成年志 愿者外周血20mL,肝素抗凝,4h内按Ficoll密 度梯度离心法分离获得单核细胞.将所获单核细 胞以5×10/mL接种于纤连蛋白包被的24孔培养 板或以l×106/mL接种于纤连蛋白包被的60mm培 养皿,并随机分为辛伐他汀组(辛伐他汀的终浓度 为1gmol/L),罗格列酮组(罗格列酮的终浓度为 lgmol/L)和对照组(不加药物).采用含补充物的 EBM一2培养基[EBMsingleQuots:包括20%胎牛血 清,人表皮生长因子(hEGF),血管内皮生长因子 (VEGF),人成纤维细胞生长因子一B(hFGF.B),R3 胰岛素样生长因子.1(R3一IGF.1),氢化可的松,维 生素C及庆大霉素/两性霉素B]培养4d,以磷酸 盐缓冲液(PBS)漂洗,除去未贴壁的细胞,更换培 养基后,贴壁细胞进一步培养至第7天. 1.2.2细胞染色 培养第4天,以PBS洗去未贴壁的细胞,加入 Dil—acLDL(浓度达2.4gg/mL),37?共同孵育4h. 随后以2%多聚甲醛固定20rain,经PBS漂洗后加 入FITC—UEA-1(10pg/mL),37?孵育1h,漂洗后 封片剂封片.Dil—acLDL和FITC.UEA一1双染色阳 性的细胞鉴定为EPC,荧光显微镜下观察其形态并 计数. 培养7d后,三组细胞均以PBS漂洗,2%多 聚甲醛固定20min,漂洗后加入封闭液[1%牛血清 蛋白(BSA)+0_3%Triton.100]封闭30min,再次漂 洗后分别加入Cy3标记的鼠抗人O【.平滑肌肌动蛋 白单克隆抗体(稀释浓度为1:200)和兔抗人vWF 抗体(浓度为1:200),37?孵育lh后再以PBS漂 洗两次.前者直接封片,后者再加入TRITC标记的 羊抗兔IgG,37?孵育45rain后漂洗封片.荧光显 微镜下观察. 1.2.3细胞增殖能力测定 采用MTT法测定细胞增殖能力.培养第7天时, 以0.25%的胰酶和乙二胺四乙酸(EDTA)消化EPC 后加入无血清培养基,在96孔培养板上按每孔l× l0接种,分别加入不同浓度的辛伐他汀及罗格列 酮(终浓度分别为0.1,1和10pmol/L),每种浓度 设六孔.同时设对照组,每组也为六孔.培养12 或24h后,每TLDn入l0pLMTT溶液(5mg/mL), 继续培养4h后终止培养.吸去上清液后每-~LDI:I入 二甲基亚砜(DMSO)15O,震荡15min后,以酶 标仪测定其光密度(OD)值(波长为570nm),依 据OD值评价细胞的增殖能力. 1.2.4细胞迁移能力测定 改良的Boyden小室于紫外线下照射2h.下 室中加入100pL不同终浓度(0.1,1和10pmol/L) 的罗格列酮或辛伐他汀溶液,同时设置对照组,以 刘蓉,等.辛伐他汀和罗格列酮对内皮租细胞的影响.2011年第32卷第6期研究论 文 聚碳酸滤膜(8pm)置于上,下小室之问,培养 7d的EPC以0.25%的胰酶和EDTA消化,离心 后重新悬浮于培养基中,计数,取1×10加入上室 (200pL).37.C孵育24h,擦去滤膜上层未移 动细胞,PBS漂沈后以2%多聚甲醛固定20min, Giemsa染色.显微镜下随机选择3个视野(x400) 计数迁移至下层的细胞. 1.2.5细胞集落形成能力测定 培养第4天时,采用0.25%的胰酶和EDTA消 化细胞后各取5×l0接种于0.8%的甲基纤维素培 养基中,加入罗格列酮和辛伐他汀溶液,使其终浓 度分别达到0.1,1和10pmol/L,同时设置对照组. 置于37?,5%CO,培养箱中再培养9d后,计数 形成的集落数,每个集落至少包含50个细胞. 1.2.6细胞分化方向鉴定 采用流式细胞仪鉴定细胞分化方向:培养7d 后,三组均采用0.25%的胰酶和EDTA消化细胞, 细胞悬液(每组细胞数>2×10.)经2%多聚甲醛 固定后,均与Cy3标记的鼠抗人c【.SMA单克隆抗 体(稀释浓度为1:50)及兔抗人vWF抗体(稀释 浓度为1:50)37?孵育1h,以冰PBS漂洗后,加 入TRITC标记的羊抗兔IgG(稀释浓度为1:40), 37~C孵育45min,然后采用流式细胞仪计数. 1.2.7统计分析 采用SPSS10.0统计软件进行数据处理,各组 试验均重复3次,计量资料结果以均数?差 ?S)表示,组间比较采用方差分析和f检验,以 尸<0.05为差异有统计学意义. 2结果 2.1培养的EPC特征 倒置显微镜下观察新鲜的单核细胞为圆形,培 养第3,4天EPC体积开始增大,形态变为不规则, 第5天开始逐渐出现多形性,椭圆形或梭形外观, 到第7天后细胞大部分均成梭形. 2.2染色鉴定 培养第4天,染色后荧光显微镜下观察,绿 色代表与FITC标记的UEA.I结合(激发波长为 488nm),红色代表与Dil标记的acLDL结合(激 发波长为514nm).随机计数10个视野,FITC. UEA—I和DiL.acLDL双染色阳性的细胞占(87_3? 2.6)%. 2.3增殖能力测定 加入不同药物培养12及24h,根据MTT法测 定每孔OD值,结果见表1.提示,罗格列酮和辛 伐他汀各浓度组均能促进EPC增殖,且前者作用 更强.其中,1pmol/L罗格列酮组的增殖作用最显 着,且以24h时的增殖作用最强(尸<0.01).辛 伐他汀也以浓度1pmol/L,24h时的增殖作用最强 <0.05). 2.4迁移能力测定 各组按改良的Boyden小室法计数的迁移至 下层的细胞数见表2.结果显示,与对照组相比, 辛伐他汀组迁移至下层的细胞数明显增加,且 以浓度为lgmol/L时迁移至下层的细胞数最多 (尸<0.05);罗格列酮组迁移至下层的细胞数未见 显着增加. 2.5集落形成能力测定 培养9d后,倒置显微镜(x400)下计数的 各组细胞集落形成数见表2,结果显示,与对照 组相比,辛伐他汀和罗格列酮组EPC集落形成 表1不同培养时间辛伐他5-r~n多格列酮培养的各组OD值?S) 与对照组相比,P<005;P<0.O1 墨? _ 表2不同浓度辛伐他汀和多格列酮培养下的迁移细胞数和EPC集落形成数(x400 视野,单位:个,?S) 与对照组相比,尸<0.05 数均显着增加,且均以1lamol/L时增加最为显着 (P<0.05),两药物组间相比差异无统计学意义 >0.05). 2.6分化方向鉴定 2.6.1免疫荧光鉴定 免疫荧光显微镜下观察三组细胞均可向内皮细 胞(vWF阳性,红色,激发波长为514nm)和平滑 肌细胞(0c—SMA阳性,绿色,激发波长480nm)两 个方向分化,见图1. 2.6.2流式细胞仪鉴定 流式细胞仪鉴定亦显示三组细胞均可以表达 vWF和0【一SMA,各组细胞计数见图2,三组细胞分 A C B D E—F?A,B为对照组,C,D为辛伐他汀组,E,F为罗格列酮组. 其中A,C,E为显示?一SMA阳性,B,D,F为显示vWF阳性 图1各组向平滑肌细胞和内皮细胞分化的 荧光显微镜观察结果 化百分率比较见图3.罗格列酮组和辛伐他汀组表 达vWF和0【.SMA的细胞百分率均明显高于对照组 <0.05).罗格列酮组表达vVv'F的细胞百分率高 于表达a—SMA的细胞<0.01),而辛伐他汀组 表达c【一SMA的细胞百分率高于表达vWF的细胞 <0.05).辛伐他汀组和罗格列酮组同时表达vWF 和.SMA两种细胞的比例无差异. 3讨论 EPC具有特异性地分化为成熟的血管腔内皮细 胞的能力,正是由于其存在,才保证了血管内皮细 胞损伤后的再修复以及新生血管的形成.EPC介导 的血管再生即是基于骨髓源性EPC的内源性动员的 潜在能力,通过动员增加局部EPC的数量,从而为 老年,糖尿病及高胆固醇血症患者的内皮功能紊乱 及缺血性疾病提供一种新的治疗手段. 生理状态下,EPC主要存在于骨髓中,外周血 EPC仅占血液循环中单核细胞的0.01%,因此,若 要增加外周血EPC的数量,必须将骨髓中的EPC 动员N~'t-周.已证实多个因素可以促进EPC的动员, 包括:?内源性组织缺血,如心肌缺血,肢体缺血 及血管创伤等;?细胞因子,如VEGF,成纤维细 胞生长因子(FGF)及表皮生长因子(EGF)等; ?药物,如他汀类药物等];?运动]. 他汀类药物即HMG—CoA还原酶抑制剂,临床 主要用于调脂治疗,大量循证医学证据已经表明其 可降低冠心病患者的发病率和死亡率.他汀类药物 除调脂作用外还有抑制血管炎性反应,降低血小板 聚集,减轻血栓形成,增强内皮源性的一氧化氮的 产生及改善内皮细胞功能等作用.临床研究显示, 病情稳定的冠心病患者接受阿托伐他汀治疗,可以 刘蓉,等.辛伐他汀和罗格列酮对内皮祖细胞的影响.2011年第32卷第6期研究论 文 A对照组 一1024 ?256 ?64 衄16 4 口1 0 1 . I_ 2 } :l_l 0_i . l1,?, . ,j墨.,:4 '' 101O01000 【I—SMA IDCountMnXMnYPkP0sXPkPOSYPkCntFPCVXFPCVY D1】】55720.】26232O.】02】】85l5586l0Ol3 D21437125438l96.6537399l09.O915372 D34l32O6l0l2002280l0201O274548.668610 D433O1650lI.J0lI432.4O10267107.964209 B辛伐他汀组曝24? 口1 l上 0 1 :- b ' ?} l毪 囊 1O1O0l000 . SMA IDCountMnXMnYPkPOSXPkPOSYPkCntFPCVXFPCW D120.O1000O.155325O.102l373874889920 D224.412l9546741665373981148615O.64 D327.6138O0208024701020102123821585.54 D428,0l4013,790l464640.10237951271.22 c罗格列酮组:j88?,.羔0 ., ? ??, ?. ' } 101001000 n.SMA IDCountMnXMnYPkPosXPkP0sYPkCntFPCVXFPCVY D110.6530O.15O398010211024706814365 D224.512237.6312.96653739221201818644 D3l4974402050.229Ol0201O212O83258698 D45O12503568O1257.68O1O2l1280.395470 图2流式细胞仪鉴定各组细胞0c.SMA和vWF表达的比率 0000【l— 0一一,0】-3?Z0. 000_【00000—00_【 圈 \ 褂 52.4 44.4鞠ll.37.725-8?...._一vWa—SMAvW}&a—SMA 分化方向 口一对照组;圆一辛伐他汀组;m--罗格列酮组 图3流式细胞仪测定对照组,辛伐他汀组和 罗格列酮组向内皮细胞(表达vWF),平滑肌细胞 (表达旺一SMA)分化的比率 提高EPC的数量,改善EPC的迁移功能.另有一 些研究也显示,他汀类药物可以改善EPC的 功能.本研究结果表明,辛伐他汀可以提高EPC的 增殖能力,迁移能力和分化能力.研究显示,他 汀类药物可能通过PI3K/Akt信号途径发挥对EPC 的调节作用,进一步通过作用于VEGF,促血管生 成素等促血管生长因子对EPC产生影响. 罗格列酮属于噻唑烷二酮类药物,是人工合成 的过氧化物酶体增生物激活受体丫(PPAR一1,)激动剂, 临床主要用于治疗糖尿病.PPAR.丫对多种细胞的生 长,分化甚至凋亡均有重要影响.脉管系统几乎所 有的细胞,包括内皮细胞,平滑肌细胞以及单核/ 巨噬细胞表面均有PPAR一1,受体表达.2型糖尿病患 者接受罗格列酮单药治疗即可改善血管活性和内皮 功能,同时还有提高胰岛素敏感性,限制血管炎 症反应等作用. 本研究发现,罗格列酮能提高EPC的增殖能 力和分化能力,且促进EPC向内皮方向分化的作用 强于他汀类药物.其机制可能也是由于EPC表面有 PPAR-Y受体的表达,罗格列酮可与其结合而发挥 作用.此外,还可能与PPAR.丫配体促进血管平滑 肌细胞,动脉和微血管内皮细胞VEGF的合成, 进一步促进内皮细胞的生成有关. 目前的研究显示,糖尿病合并冠状动脉病变的 患者,侧枝循环建立不足,且接受介入治疗后再狭 窄的发生率较非糖尿病患者高.Choi等?的研究 显示,在接受冠状动脉支架植入术的95例2型糖 尿病患者中,接受罗格列酮治疗的患者与接受其他 降糖药物治疗的患者相比,支架植入后6个月支架 内再狭窄的发生率显着降低.这一结果是否与罗格 列酮可促进EPC向内皮方向分化有关尚待进一步 探讨. 本研究结果显示,辛伐他汀和罗格列酮对EPC 的迁移,增殖和分化均有促进作用,可成为药物治 疗冠心病等缺血性疾病的又一研究方向. 4结论 辛伐他汀和罗格列酮均能改善EPC的功能,辛 伐他汀能促进EPC的增殖,迁移和向平滑肌细胞方 向分化,而罗格列酮则能促进EPC的增殖及向内皮 方向分化. 参考文献: [1]AsaharaLMuroharaLSullivanA,eta1.Isolationofputative progenitorendothelialcellsforangiogenesis[J].Science, 1997,275(5302):964—967. 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