二硫苏糖醇对刺参卵母细胞体外成熟的影响

二硫苏糖醇对刺参卵母细胞体外成熟的影响 二硫苏糖醇对刺参卵母细胞体外成熟的影 响 第31卷第6期 20l0年12月 渔业科学进展 PR()GRESSlNFISHERYSCIENCES Vo1.3l,NO.6 Dec..2010 硫苏糖醇对刺参卵母细胞体外成熟的影响 庞振国孙慧玲.常亚青?于佳平 (中同科学院海洋研究所,青岛26607】) (中国科学院研究生院,北京100049) (.中国水产科学研究院黄海水产研究所,青岛266071) (大连海洋大学农业部海洋水产增养殖学重点开放实验室,1】6023) 摘要用海星鞘神经提取液和二硫苏糖醇对刺参卵母细胞进行了体外人_7-促熟研究.结果显 示,二硫苏糖醇对刺参卵母细胞具有明显的促熟作用.刺参卵母细胞包被在滤泡中发育,卵母细胞通 过动物极的卵突起连接到单层细胞构成滤泡膜上,充分发育的卵母细胞处于生发泡期,染色质凝集在 核仁周围,处于生发泡期的卵母细胞在海水中不会自发成熟.用二硫苏糖醇处理充分发育的卵母细 胞20min,卵母细胞的生发泡开始移动,并锚定在卵母细胞的动物极,继而出现生发泡破裂.此后, 减数分裂重新启动,第一,二极体分别排出.但海星鞘神经提取液对刺参卵母细胞没有促熟作用.实 验明,二硫苏糖醇浓度在10,10mol/I范围内,均可促使刺参卵母细胞发生生发 泡破裂,10 mol/I时诱导卵母细胞成熟率可达9O以上. 关键词刺参卵母细胞体外促熟 中图分类号$968.9文献识别码A 二硫苏糖醇 文章编号10007075(2010)06—0082—08 DTTinductionofoocytematurationforsea cucumberApDcDpjaponicus(Slenka) (.GraduateSchool,ChineseAcademyofSciences,Beijing100049) (YellowSeaFisheriesResearchInsitituIe,ChineseAcademyofFisherySciences,Qingdao266071) (KeyLaboratoryofMariculture,DalianOceanUniversitY,116023) ABSTRACTWater—extractsofradialnervesfromstarfishanddithiothreitol(DTT)were usedtoinducetheoocytematurationforseacucumberApostichopusjaponicus(Slenka).Al— thoughradiaInerveextractsfailedtoinduceoocytematurationforseacucumber,breakdownof germinalvesiclesandsubsequentmeioticbehaviorofchromosomeswereinducedbythetreat— mentwithDTT.OocytesoftheseacucumberA.japonicuswerearrestedatthegerminalvesi— cle(GV)stageanddidnotstartmaturationspontane0usly.AfterbeingtreatedwithDTTfor 困家863课项目(2006AA10A411)和国家自然科学基金项日(31072230)共同资 助 *通讯作者.Email:yqchang@dlou.edu.CFI 收稿日期:2009—0l07;接受日期:2O1O0621 作者简介:庞振困(1981),男,博士研究生,丰要从事海洋生物技术研究.E, mail:panishvan@yahoo.c()m.cn 二 第6期庞振国等:二硫苏糖醇对刺参卵母细胞体外成熟的影响 20min,theGVbegantomigratetotheanimalpoleoftheoocyte,thentheGVbrokedown, whichiscalledgerminalvesiclebreakdown(GVBD).Meiosisoftheoocytereinitiatedandtw o polarbodiesprotrudedoutsuccessively.DTTwiththeconcentrationof10,,10mol/Isue— cessfullyinducedGVBD.Maturationpercentagereached90Whentheconcentrationofthe DTTsolutionwas10mol/L.Oocytesinducedtomaturationcouldbefertilized,whilethey couldnotdevelopnormally. KEYWORDSA0s如f0psjaponicus(Slenka)OocyteGerminalvesicle MeiosisD;thiothreito1 刺参Apostichopusjaponicus(Slenka)自2O世纪8O年代人工繁殖技术取得成功以来,已经成为我国重要 一,的海水养殖对象之但其基础繁殖生物学尤其是排卵前后卵母细胞成熟的研究却非常缺乏.由于刺参卵母 细胞成熟在排卵前很短的时间内发生,而且整个过程在体内进行,因此给相关方面的研究造成极大的网难.就 目前来说,在自然状态下研究卵母细胞在刺参体内的成熟过程尚不够现实,比较科学可靠的方法是通过体外诱 导启动其减数分裂来再现体内卵母细胞的成熟过程. 卵母细胞的成熟作用最明显的标志是生发泡的破裂和减数分裂的重启动(Miyazakieta1.2000).诱导 动物卵母细胞减数分裂启动的激素具有种的特异性.对海参而言,卵母细胞在生殖管中处于生发泡阶段,直至 排放之前生发泡破裂.正常排放卵子被抑制在第1次减数分裂中期,待受精作用完成后继续完成减数分裂 (Miyazakieta1.2005).虽然可以通过多种方法诱导海参排卵,但是诱导海参卵母细胞成熟的内源性物质目 前尚不清楚.Smiley(1988)从美国刺参Stichopuscalifornicus的卵巢中提取出卵母细胞促减数分裂重启动 因子,并确定其化学结构类似于2一甲基8一氨基腺嘌呤,Smiley因此推测这种化 合物即为海参纲动物的促成熟 因子,然而到目前为止,并没有实验证据支持此结论. 目前,卵母细胞促成熟因子研究较为成功的棘皮动物是海星纲 Asteroidea(Shirai1973;Nemotoeta1. 1980;Hirai1988;Kishimoto1999;Nusco2002;Mitaeta1.2007).海星鞘神经提取液能诱导海星及 海胆卵子的成熟和排放(Shirai1973;Haruo1974).海星鞘神经肽作用于海星生殖腺中的滤泡细胞,诱使 滤泡细胞生成第2种诱导因子,这种直接诱导凶子被证明是1甲基腺嘌呤(1-MeAde).但有报道证明, 1-MeAde对海参卵母细胞并没有促熟作用(Maruyamal980). Maruyama(1980)报道二硫苏糖醇(Dithiothreitol,DTT)和二巯基丙醇(2,3-Dimercapto—l—propanol, BAL)能够促进两种黑海参(Holothurialeucospilota和H.pardalis)卵母细胞的成熟,并用海星鞘神经提取 物对包括刺参在内的多种海参进行了促熟实验,证明海星鞘神经提取物在滤泡存在的情况下能够诱导H. 1eucospilota,H.pervicax,H.moebi和H.pardalis等几种黑海参卵母细胞的成熟,但并未对刺参的实验结 果进行描述(Maruyama1985).本实验用二硫苏糖醇和海星鞘神经提取液对刺参卵母细胞进行了体外促熟 研究,以确定这两种物质对刺参卵母细胞体外成熟的影响,并观察了卵母细胞在体外的成熟过程. l材料和方法 1.1刺参卵母细胞和精子的获得 刺参于2007年8月取自辽宁省獐子岛附近海域,在大连水产学院海水养殖实验室暂养.解剖取得成熟性 腺,并在海水中漂洗3次,用解剖剪将性腺剪成2cm左右小段,并用尖头镊子将生殖管沿纵轴撕开,200目筛 绢收集获得的卵母细胞,海水中冲洗3次,每次10min.部分卵母细胞通过无Ca海水处理去除滤泡.刺参 精子通过解剖取得,剪取少量精巢小管,用滤纸吸干水分,置于培养皿中,4.C冰箱保存备用,使用时加海水稀 释. 84渔业科学进展第31卷 1.2处理药物配制及电镜样品制备 DTT购自上海生物工程技术服务有限公司,过滤海水配制成0.1mol/L母液,4.C冰箱保存.解剖获得 的卵母细胞及滤泡透射,扫描电镜样品制备参照庞振国等(2006)的方法. 1.3海星鞘神经提取液的制备 实验用海星Asterinapectini,盯n采自青岛市栈桥附近海域,将海星腕足沿纵轴剪开,用尖头镊子撕取鞘 神经,滤纸吸取多余水分后称重,加入蒸馏水后置于玻璃匀浆器中匀浆,然后离心(10o00g,10min,4?),取上 整个过程在冰上进行,提取的神经液稀释成2mg/ml的母液于一20.C冰箱中清液, 保存备用. 1.4滤泡悬液的制备 从刚刚解剖获得的新鲜生殖管中获取大约10.个卵母细胞置于40ml的无ca海水中,并且用吸管反复 吹打20rain以提高卵母细胞脱滤泡率,待卵母细胞沉降后取上清液,1500g,15min离心收集滤泡,加入20 ml过滤海水后制成滤泡悬浮液母液. 1.5卵母细胞的药物处理 实验在24孑L细胞培养板中进行,脱去滤泡的卵母细胞加人过滤海水保持卵母细胞浓度200,40O个/ml, 药物处理后,每隔10min取样于显微镜下观察生发泡破裂情况,并取样用甲醛固定液固定,固定后的样片经 0.01mol/L的DAPI染液染色,轻轻压片后在Olympus荧光显微镜下观察并拍照, 所有实验在23.C水温下 进行. 1.5.1海星鞘神经提取液单独处理 设置4组海星鞘神经提取液的浓度梯度,分别为2,2×10,2×10一,2×10mg/ml和1个过滤海水对 照组,每组浓度设4个平行. 1.5.2海星鞘神经提取液加滤泡悬浮液处理 在海星鞘神经提取液的每个浓度梯度中分别加5ml的滤泡悬浮液. 1.5.3二硫苏糖醇处理 DTT浓度梯度设置为10,10,10_.,10啊.,10mol/L5个浓度梯度和1个海水对照组,每组浓度设4 个平行. 1.6不同时期卵母细胞的受精能力检测 通过镜检观察取不同发育及成熟阶段的卵母细胞,用稀释的精子对促熟的卵母细胞进行受精实验,通过受 精膜的举起现象观察是否能够成功受精及受精后的发育情况. 2结果 2.1未成熟的卵母细胞 刺参的卵母细胞包被在滤泡膜中发育,而滤泡膜是由单层滤泡细胞连接构成的,卵母细胞和滤泡之间充满 卵胶层.卵母细胞表面大量微绒毛伸向卵胶层并且通过一个明显的突起连接到滤泡上.而滤泡膜又通过一层 上皮细胞构成的索状连接组织固定在生殖管壁上,细胞突起和索状连接组织处的细胞基部构成了卵母细胞的 顶部——基部轴(图1).充分发育后的刺参卵母细胞处于减数分裂前期I,此时的卵母细胞最明显的特征是具 有一个特化的巨大细胞核,直径约50ffm,具有储存减数分裂必需物质的作用,细胞核通常有1,3个核仁,这 时的细胞核被称作生发泡.此时,DAPI染色显示,聚缩的染色质分布在核仁周围.处 于这一时期的卵母细胞到 排放之前一直被抑制在减数分裂前期I,直至排卵临近时发生生发泡破裂,减数分 裂重新启动(图2,图3,图4). 第6期庞振国等:二硫苏糖醇对刺参卵母细胞体外成熟的影响85 A.发育中的卵母细胞.卵母细胞体积尚小,表面突起较细.生发泡位于卵母细胞中 央,卵母细胞通过表面突起连接于滤泡膜上,滤泡膜和卵母 细胞间有一层卵胶层,箭头示断裂的索状连接组织 B.充分发育的卵母细胞.箭头处示完整的连接组织,滤泡膜通过索状连接组织连接 在生殖管壁上 C.卵母细胞与滤泡细胞超微结构,卵母细胞表面有大量微绒毛,滤泡细胞为单层上 皮细胞 D.卵母细胞表面突起,顶部凹陷为卵母细胞与滤泡膜连接处 Pr:卵母细胞突起;GV:生发泡;Js:卵胶层;Fc:滤泡;Mv:微绒毛 A.Developingoocytelocatedinafollicle,theoocyteisrelativelysmallandtheprotuberanceisthin.Theoocyteconnectstothefollicleviaaprotu— berance,thereisajellyspacebetweenthefollicleandtheoocyte,arrowshowsbrokencanalshapedconnectstructure B.Fullygrownoocyte.Arrowshowsintactconnectstructure,thefollicleconnectstogonadwallviathestructure C.Ultrastructureoftheoocyteandthefollicle,manymicrovilliprotrudefromthesurfaceoftheoocyteintothejellyspace D.Oocyteprotuberancebyscanningelectronmicroscope,theconcavedtopistheconnectionplace Pr:Protruberence;GV:Genfinalvesicle;Js:Jellyspace;Fc:Follicle;Mv:Microvilli 图1卵母细胞,表面突起,滤泡膜及索状连接组织 Fig.1Oocyte,oocyteprotuberance,follicleandcanal-shapedconnectstructure A.从刺参卵巢tkNd,管中解剖出的卵母细胞处于生发泡期,卵母细胞表面包被有一 层滤泡(F.),生发泡位于卵母细胞中央或靠近一侧的位置. Bar--l50" B.未成熟的卵母细胞在10mol/L的DTT溶液中处理20min,生发泡大部分已经开 始破裂.Bar—l50m C.成熟过程中个别卵母细胞有受精膜举起的现象 Ft:成熟生殖小管;Fo:滤泡 A.0ocytesexcisedfromtheovaryarearrestedintheGVstage.Thereisasmalltipononesideoftheoocytewhichconnectstheoocyteandthe folliclefoldingit.Someoocytescompletetheovulation,germinalvesicleslocateinthecenteroreccentricpositionoftheoocyte.Bar--150m B.AfterbeingtreatedinDTTsolutionwiththeconcentrationof10mol/Lfor2Omin,mostofimmaturedoocyteshavestartedtheGVBD,the membraneoftheGVbreaksdownandthechromatinlocatesintheanimalpoleoftheoocyte.Bar一5O"m C."Fertilizationmembrane''wouldbeoccasionallyraisedupduringtheoocytematuration Ft:Femaleprocreationtubule;Fo:Follicle 图2刺参生殖小管中解剖出的卵母细胞和DTT对卵母细胞的促熟作用 Fig.2MaturationinductionofoocytesexcisedfromovarytubulesbyDTTsolution 第6期庞振国等:二硫苏糖醇对刺参卵母细胞体外成熟的影响87 2.2促熟结果 生发泡未破裂时,卵母细胞不具有受精能力,未成熟卵母细胞最明显标志是完整的 生发泡,而刺参的卵母细 胞在天然海水中并不会发生自发成熟.用吸管吹打虽然能使生发泡的形状变得不 规则,但也不能使生发泡发生 破裂.本次实验中,所有3种处理的海水对照组都未观测到生发泡破裂现象,而经海 星鞘神经提取液和鞘神经提 取液加滤泡悬浮液处理的卵母细胞在所有梯度浓度下处理2h后,也未发现生发泡 破裂情况,说明海星鞘神经提 取液无论滤泡存在与否都未对卯母细胞的成熟产生作用,与之相对应的是二硫苏 糖醇的处理的确可以诱导卵母 细胞的减数分裂.t当DTT溶液的浓度处于10,10mol/I之间时,对刺参卵母细胞的促熟作用较为明显;当 DTT浓度在10一mol/L左右时,卵母细胞的成熟率可以达到90以上;但当DTT浓度低于10mol/L或者接 近10mol/I时,卵母细胞成熟率显着降低.DTT浓度和卵母细胞成熟诱导率的关系如图5所示.一个值得注 意的现象是个别刺参卵母细胞在DTT诱导的成熟过程中有类似于"受精膜"举起的现象(图2),其他种的海参也 有类似的报道(Maruyama1981).这种"受精膜"是否与卵子受精后形成的受精膜相同尚待确定. 2.3卵母细胞的成熟过程 刚刚解剖出的卵母细胞,生发泡位于中心或稍 微靠近细胞一端的位置,加入DTT溶液后,卵母细 胞成熟开始,其明显的标志是生发泡开始移向卵母 细胞的一侧的细胞膜,从DTT开始处理到生发泡 移动到卵突一端细胞膜下,整个过程大约需要1O, 15min,生发泡移动过程中,其形状发生改变,从规 则的球形变为椭球形,最后固定细胞膜下,近细胞膜 的核膜变平,整个生发泡成为半球形.在此过程中, 核发生裂解,生发泡移动完成后,核仁已经完全消 失(图3). DTT诱导的减数分裂启动后,染色质聚集在卵 母细胞的一端,之后进人减数分裂中期I,染色体重 新排列于赤道板上,然后同源染色体发生分离,第一 极体从卵母细胞突起处排出,从生发泡破裂到第一极 体排出需要2Omin左右,而后随着第2次减数分裂 的完成,第二极体从第一极体下方排出,从第一极体 排出到第二极体排出的过程大约需要20min(图4). DTT浓度ConcentrationofDTT(mol/L) 注:DTT浓度在1O,10mol/l之间对卵母细胞具有促 熟作用,在10mol/I时,诱导率在9O以上.图中各点表示每 组DTT浓度4个平行卵母细胞成熟率的平均值?误差 Note!DTTsolutionwiththeconcentrati0nbetween105, 1Omol/Linducedtheoocytematuration:thematurationper centagereached90whentheconcentrationis10mol/L.Plot showsthematurationpercentage(1nean?STD) 图5不同浓度DTT溶液对卯母细胞的促熟率 Fig.5OocytematurationpercentageinducedbyDTTat differentconcentrations(numberofsamples一7) 2.4不同成熟阶段的卵母细胞受精及正常卵裂的能力 收集处于不同成熟阶段的人工促熟卵母细胞,过滤海水冲洗后加入刺参精子进行人工授精.结果表明,卵 母细胞只有在生发泡破裂之后才有受精能力,从生发泡破裂到第二极体排出前的整个减数分裂过程中,卵母细 胞在人工受精后都具有受精膜举起的现象,其受精率没有明显差别,均可达90以上,但只有在第一极体排m 前受精的卵母细胞才能发生卵裂.遗憾的是,人工促熟的卵母细胞受精后形成的胚胎似乎并不能正常发育,作 者通过多次实验,最多只得到了8细胞期的胚胎,之后便出现畸形并停止细胞分裂. 3讨论 正常卵母细胞的发育与成熟过程伴有几次发育停滞状态,第1次停滞状态是第1次减数分裂前期,称作前 期停滞的卵母细胞,刺参卵巢小管中解剖出的卵母细胞就处在这个时期,此时期卵母细胞的重要标志是具有特 化的细胞核,也就是生发泡(Germinalvesicle,GV),所以此时期又叫做生发泡期.第2个停滞是卵母细胞成 一一?'u...暑n1日窆褂簇 88渔业科学进展第3l卷 熟至第2次减数分裂中期,在该期维持较长时间,直到精子人卵或受其他的人lT刺激.自然界中,有一部分动 物如一些软体动物,棘皮动物,海鞘类,它们的卵母细胞只成熟到第1次减数分裂期就接受精子受精,受精后排 出第一极体,继而完成第2次减数分裂(楼允东1979).促成熟因子(Maturationpromotingfactor,MPF)是 调节卵母细胞成熟的核心环节(陈大元2000),有关MPF在细胞周期中的调节机制,在无脊椎动物海星中报 道较多.海星鞘神经肽作为性腺刺激物质(Gonad—stimulatingsubstance,GSS),作用于海星生殖腺中的滤泡, 诱使滤泡细胞生成促成熟因子(MPF),这种促成熟因子被证明是1_MeAde,将MPF(1-MeAde)注射人生发泡 时期的海星卵母细胞后,不需要蛋白质的合成过程,由活性的MPF直接激活大量卵母细胞中储存的前体MPF (陈大元2000),因此可以在短时间内启动减数分裂.已有的研究证明,海星鞘神经提取液可以诱导30多种 海星的卵母细胞(Kanatani1973),不同种的海星鞘神经提取液对各种海星卵母细胞的促熟作用并没有特异 性,因而1,MeAde被认为是海星纲动物卵母细胞的通用促熟因子.此外,1-MeAde还可以诱导其他的棘皮动 物如海胆卵母细胞的生发泡破裂(Haruo1974).Maruyama(1985)报道了海星鞘神经提取液在滤泡细胞存 在的情况下可以诱导H.1eucospilota,H.pervicacr,H.moebi,H.pardalis等黑海参卵母细胞的成熟,但对 脱去滤泡的卵母细胞无效,因此推测滤泡细胞能产生某种诱导卵母细胞成熟的诱导因子. 实验证明,无论滤泡存在与否,海星鞘神经提取液对刺参卵母细胞都不具有促熟作用,说明刺参卵母细胞成 熟的内源性诱导物质与这4种黑海参并不相同.另一方面,DTT对刺参卵母细胞具 有明显地促熟作用.已经有 报道证明DTT对海星卵母细胞也具有促熟作用(Vacquiereta1.1972).虽然目前对DTT诱导海参的卵母细胞 成熟的机制尚不清楚,但在海星卵母细胞的研究中发现,1-MeAde对海星卵母细胞的促熟作用能够被一些可与巯 基基团反应的双硫键化合物抑制,而DTT等巯基化合物能够解除这些成熟诱导抑制剂的影响,说明巯基基团对 海星卵母细胞的成熟启动具有重要的作用(Kishimotoeta1.1973);另外,卜MeAde能够明显提高海星卵母细胞 皮层中巯基蛋白的含量(Kishimotoeta1.1976),虽然1-MeAde并不能诱导刺参卵母细胞的成熟,但DTT可以 使刺参卵母细胞出现生发泡破裂并重新启动其减数分裂.依据本实验结果,作者推测,刺参的体内成熟诱导因子 也可以提高卵母细胞皮层巯基蛋白的浓度,而这一过程可能是棘皮类动物卵母细胞成熟的必要步骤. 但卵母细胞的减数分裂并没有持续进行,而正常排放的刺参卵子生发泡已经破裂, 是被抑制在减数分裂中期 I.未受精的卯子在海水中浸泡5h后逐渐发生畸形和裂解,期间观察不到极体放出的现象,直到受精之后,减数 分裂才又被启动,这样正常卵母细胞的发育过程就存在两个停滞阶段.第1阶段是卵母细胞充分发育后到自然 排卵或者人工刺激排卵之前,此阶段的卵母细胞一直处于生发泡时期,虽然此时染色质已经发生聚缩,但荧光显 微镜观察染色质被固定在生发泡内核仁的周围,因核膜未破裂,中心体无法通过微丝与染色质结合,故而减数分 裂无法进行.排卵前期生发泡发生破裂,内容物释放到卵母细胞质中,染色质凝集排列在卵母细胞的一侧.如果 卵子排放后没有成功受精,则减数分裂不会继续自发启动,这个抑制阶段可以称作成熟过程的第2次停滞.因此 作者认为,刺参卵母细胞内的促成熟因子的浓度或者活性从排卵前到受精前的阶段经历了短期提升后又迅速被 抑制的过程,受精作用发生后促成熟因子的浓度或者活性又迅速被提升,引起减数分裂的继续进行.本次实验发 现,经过DTT处理的卵母细胞在生发泡发生裂解后,并不会停滞在减数分裂中期,而是继续进行减数分裂,这在 另一方面说明外源性的DTT对卵母细胞的促熟作用因不受自身的调控作用而持续进行,直至第二极体排出. 刺参卵母细胞一个非常重要的特征是表面具有一个细胞质突起,这个细胞质突起具有几个特点:(1)刺参 卵母细胞通过这个突起连接到滤泡膜上并且在滤泡中发育;(2)在卵母细胞成熟过程中,生发泡向这个突起的 方向移动并最终固定在突起处的细胞膜下发生生发泡破裂;(3)表面突起处是第一,二极体的排出位置.这些 特征显示这个细胞质突起标定了刺参卵母细胞的动物极.其他海参种类也有类似的细胞结构,Smiley等 (1985)报道经过体外诱导处理的美国刺参卵母细胞,其脱滤泡过程起始于表面突起刺穿滤泡膜.Miyazaki等 (2005)在研究中将黑海参H.moebi卵母细胞的表面突起称作动物极突起.可以推测表面突起是海参纲动物 卵母细胞的共有特征.应当注意的是刺参卵母细胞表面突起与贝类动物卵母细胞的卯柄是不同的,贝类动物 卵柄的形成开始于卵黄发生期,卵母细胞基部突起伸长形成卵柄附着于生殖腺壁上(Eckelbargereta1. 1999).而刺参卵母细胞表面突起位于细胞顶部,卵母细胞通过这个突起连接在单层滤泡细胞形成的球状滤泡 膜上.滤泡膜与连接卵母细胞表面突起的相反位置有一层上皮细胞形成的索状连接组织将滤泡膜连同卵母细 第6期庞振国等:二硫苏糖醇对刺参卵母细胞体外成熟的影响89 胞一起固定在生殖管壁上.因而刺参卵母细胞表面突起和索状连接结构处相对应 的位置就标定了卵母细胞的 顶部一基部轴.因为刺参卵母细胞表面突起又是极体排放的位置,因而这个顶部一 基部轴在减数分裂过程中 便转化成卵子的动物极,植物极轴,从而在受精卵发育过程中又转化为胚胎的前 后轴(Smileyeta1.1985). 刺参卵母细胞在发生过程中的极性起源机制,尚待进一步深入研究. 到目前为止,已经见于报道的DTT促熟的卵母细胞受精后可以正常发育的海参种 类有H.1eucospilota, H.pardalis,H.pervica,H.moebi,Actinopygaechinite(Maruyama1980;Cheneta1.1991), 都属于椐 手目Aspidochirotida,海参科Holothuriidae,而刺参属于楣手目,刺参科 Stichopodidae,DTT诱导后的卵母细 胞受精后不能正常发育是否与物种对DTT毒性的耐受性不同有关,尚有待探讨. 参考文献 北京:科学出版社 陈大元.2000.受精生物学一受精机制与生殖工程. 楼允东.1979.组织胚胎学(第二版).北京.中国农业出版社 庞振国,孙慧玲,燕敬平,于东祥,方建光,姜明.2006.刺参精子发生的超微结构研究. 海洋水产研究,27(3):26,31 Chen,C.P.,Hsu,H.W.,andDeng,D.C.1991.Comparisonoflarvaldevelopmentandgrowtho ftheseacucumberActinopygaechinites:Ova, ryinducedovaandDTTinducedova.Mar.Bio1.109:453,457 Eekelbarger,K.J.,andYoung,C.M.1999.Ultrastructureofgametogenesisinachemosynthet icmytilidbivalve(Bathymodioluschildressi) fromabathyal,methaneseepenvironment(northernGulfofMexico).Mar.Bio1.135:635, 646 Haruo,K.1974.Presenceof1-methyladenineinseaurchingonadanditsrelationtooocytemat uration.Dev.GrowthDiffer.16:159,170 Hirai,S.,Kishimoto,T.,Kadam,A.L.,Kanatani,H.,andKoide,S.S.1988.Inductionofspawn ingandoocytematurationby5, hydroxytryptamineinthesurfclam.J.Exp.Zoo1.245:318,321 Kanatani,H.H.1973.Maturationinducingsubstanceinstarfishes.Int.Rev.Cyto1.35:253, 298 Kishimoto,T.1999.ActivationofMPFatmeiosisreinitiationinstarfishoocytes.Dev.Bio1.214:1,8 Kishimoto,T.T.,andKanatani,H.H.1973.Inductionofstarfishoocyteruaturationbydisulfide—reducingagents.Exp.CellRes.82:296,302 Kishimoto,T.T.,Cayer,M.M.L.,andKanatani,H.H.1976.Starfishoocytematurationandreductionofdisulfidebondonoocytesurface. Exp.CellRes.101:1O4,110 Maruyama,Y.K.1980.ArtificialinductionofoocytematurationanddevelopmentintheseacucumbersHolothurialeucospilotaandHolothuria pardalis.Bio1Bul1.158:339,348 Maruyama,Y.K.1981.Precociousbreakdownofthegerminalvesicleinducesparthenogeneticdevelopmentinseacucumbers.Bio1.Bul1.161: 382,391 Maruyama,Y.K.1985.Holothurianoocytematurationinducedbyradialnerve.Bio1.Bul1.168:249,262 Mita,M.,Yamamoto,K.,Yoshikuni,M.,Ohno,K.,andNagahama,Y.2007.Preliminarystudyonthereceptorofgonad—stimulatingsubstance (GSS)asagonadotropinofstarfish.Gen.Comp.Endocrino1.153:299,301 Miyazaki,A.,Kamitsubo,E.,andNemoto,S.I.2000.Premeioticasterasadevicetoanchorthegerminalvesicletothecellsurfaceofthepre— sumptiveanimalpoleinstarfishoocytes.Dev.Bio1.218:161,171 Miyazaki,A.,Kato,K.H.,andNemoto,S.2005.Roleofrnicrotuhulesandcentrosomesintheeccentricrelocationofthegerminalvesicleupon meiosisreinitiationinseacucumberoocytes.Dev.Bio1.280:237,247 Nemoto,S.,Yoneda,M.,andUemura,I.1980.Markeddecreaseintherigidityofstarfishoocytesinducedby1-methyladenine.Dev.Growth Differ.22:3l5,325 Nusco,G.A.,Lim,D.,Sabala,P.,andSantella,L.2002.CaResponsetocADPrduringmaturationandfertilizationofstarfishoocytes.Bio— chem.Biophys.Res.Comm.290:1015,1O21 Santella,L.,Riso,L.D.,Gragnaniello,G.,andKyozuka,K.1999.Corticalgranuletranslocationduringmaturationofstarfishoocytesrequires cytoskeletalrearrangementtriggeredbyinsP3一 MediatedCarelease.Exp.CellRes.248:567,574 Smiley,S.,andCloney,R.A.1985.OvulationandfinestructureoftheseacucumberStichopuscalifonicus(Echinodemata:holothuriadae)fe— cundovarytubes.Bio1.Bul1.169:342,364 Smiley,S.1988.InvestigationintopurificationanddentificationoftheoocytematurationhormoneofSt(chopuscalifornicus(Holothuroidea:E— chinodermata).InEchinodermBiology(Editor.Burke,R.D.eta1)PP.541, 549,Balkema,Rott Shirai,H.1973.Effectsofmethionineands— adenosylmethionineonproductionof1methy1adenineinstarfishfolliclecells.Dev.GrowthDiffer. 15:307,313 Vacquier,V.n,Tegner,M.J.,andEpel,D.1972.Proteaseactivityestablishestheblockagainstpolyspermyinseaurchineggs.Nature,240:352~353