养心通脉有效部位方促血管生成作用实验探究

养心通脉有效部位方促血管生成作用实验探究 养心通脉有效部位方促血管生成作用实验 探究 摘 要:目的;探讨养心通脉有效成分部位方(YT?)促进血管新生,治疗心肌缺血的机理。方法:运用血清药理学的方法制备含药血清,鸡胚随机分为养心通脉方(YT?)组、养心通脉有效部位方(YT?)组、bFGF组和空白血清(KX)组;72h后观察比较YT?及各含药血清对各组CAM模型鸡胚存活情况、CAM标本形态、CAM血管数量的影响。结果:加药72h后,各药物组与空白血清组比较皆有统计学意义(均PYT?组>YT?组>KX组趋势。结论:YT?与YT?、bFGF一样有促血管新生作用,且YT?作用与bFGF作用相当,明显优于YT?。 关键词:养心通脉有效部位方(YT?);血管生成 ; 鸡胚绒毛尿囊膜 中图分类号:R285.5 文献标识码:A 文章编号:1673-7717(2010)01-0054-03 Positive Research on the Effective Components Recipe of YangXinTongMai Formula(YT II) on the Angiogenesis MO Li,YUAN Zhao,kai , HUANG Xian,ping , CHEN 1 Qing,hua , JIAN Wei,xiong,HU Zhi,xi,SUN Gui,xiang (Hunan University of TCM, Changsha 410007,Hunan, China) Abstract:Objective: To investigate the mechanism of the effective components recipe of YangXinTongMai Formula on the angiogenesis and improving myocardial ischemia. Methods:The chorioallantoic membrane(CAM) model was cultured and devided into YangXinTongMai Formula(YT I )group and controlled group including the effective components recipe of YangXinTongMai Formula(YT II) group, bFGF group and KX group.the survival rate,growth shape and vessel counts of CAM model in every group was observed after 72 hours. Results:The vessel counts in bFGF group,YT-II group and YT-I group is more than KX group (PYT-II group>YT-I group>KXgroup. Conclusion: Our study indicated that YT-II can improving angiogenesis as well as YT-I and bFGF,and more better than YT-I to some extent. Key words:the effective components recipe of YangXinTongMai Formula(YT II) ; angiogenesis; chorioallantoic membrane 冠心病是冠状动脉狭窄或闭塞导致心肌缺血,从而影响心 2 功能的临床常见心血管疾病。近年来冠状动脉旁路移植术、经皮冠脉内血管成形术等新技术的开展取得了一定疗效,但仍有相当部分病人药物治疗效果不佳且并不适宜血管重建术,因此通过治疗性血管增生以减轻心肌缺血逐渐成为目前研究的热点。养心通脉方(YT?)是根据秦伯未先生“扶养心气,和通血脉”之法制定的治疗胸痹心痛的有效名方,由人参、丹参、枳实、泽泻、桂枝等按一定比例组成,对缺血性心脏病、高脂血症、动脉粥样硬化等均具有显著的临床疗效[1-2]。养心通脉有效部位方(YT?)是笔者从YT?原方综合提取出的人参皂苷等10个成分部位中,通过前期系列实验所确定的“最佳有效成分部位方”。本项研究主要通过观察药物作用72h后,鸡胚绒毛尿囊膜模型(chorioallantoic membrane,CAM)的血管形态学和新生血管计数的变化,以探讨养心通脉有效成分部位方(YT?)促进血管新生,治疗心肌缺血的机理。 1与方法 1.1实验材料 1.1.1 实验动物 清洁级健康雄性SD大鼠,体重(200?20)g,由中南大学实验动物学部提供,合格证号SCXK(湘)2006-0002;实验环境设施合格证号:医动字第20-001号。 1.1.2 实验种蛋 鸡受精3日卵45个,50,65g/蛋,均为白皮种,面清洁,蛋形,气室、气孔均匀,由湖南亚华种业有 3 限公司提供。 1.1.3 实验药品 (1)养心通脉方原方(YT?):由人参、丹参、枳实、泽泻、桂枝等按一定比例组成,药材购自湖南省药材公司,品种均经湖南中医药大学中药制剂专家鉴定认可。由湖南省中医药研究院中药研究所制剂室生产成片剂(批号20051106),每片含生药2g,用时以蒸馏水稀释成所需浓度。 (2)养心通脉有效部位方(YT?):是由养心通脉方原方中综合提取的人参皂苷、丹参酮?A、人参多糖、总生物碱、总挥发油等有效成分部位配伍制成口服液。由中南大学湘雅医学院药化系提取,使用时蒸馏水稀释成所需浓度。 (3)外用重组牛碱性成纤维细胞生长因子(bFGF):由珠海亿胜生物制药有限公司生产(商品名“贝复济”),规格:63000IU/瓶,批号:国药准字S10980077。用时以蒸馏水稀释成所需浓度。 1.1.4 实验试剂 (1)生理盐水,碘酊,1‰新洁尔灭,75%酒精,甲醇,丙酮等分析纯或化学纯试剂均为国产分析纯。?混合纤维素酯微孔滤膜,孔径0.45μm,上海兴亚净化材料厂生产,丽欣生物工程有限公司提供。?ф25mm针式滤器,规格0.22μm/个,法国Millipore公司产品。 1.1.5 实验仪器 AB104-N精密电子天平;GSY型恒温水浴锅;TH2-98A电热恒温培养箱;SW-CJ-IF型超净工作 4 台;MLS-3020高压蒸汽消毒锅;V-CP470/CH彩色闭路监控摄像机;微量可调移液器;S2-93自动双重纯水蒸馏器;MIAS医学图象分析系统;SZX-ILLD200解剖显微镜。 1.2实验方法 1.2.1 含药血清的制备 (1)动物灌药:取20只上述SD健康雄性大鼠,按体重分层,随机分为4组,每组5只。a.养心通脉有效部位方组(YT?组):YT?灌胃(按人参皂苷34.33g、丹参酮?A1.27g、人参多糖4.77g、总生物碱0.67g、总挥发油62.2mL生药/kg体重的剂量配伍);b.养心通脉方原方组(YT?组): YT?灌胃,剂量3.125g/(kg•d);c.无药血清组(KX组):等体积蒸馏水灌胃。各组每只大鼠每次灌胃4mL,每日1次,连续5天。 (2)制备血清[3]:第5天末次灌胃给药1h后于大鼠颈动脉插管无菌取血,置无菌不抗凝管中,室温下静置3,4h,1500r/min离心20min,吸上清液,无菌分离血清,同组血清混合,置于无菌试管中,分别制备成YT?血清、YT?血清和KX血清,分装后置-20?冰箱中冻存,经培养实验证明无微生物污染后使用。临用时将含药血清溶化,56?水浴灭活30 min,0.22μm微孔滤膜过滤除菌。 1.2.2 鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)造模 (1)种蛋孵育:将45个种蛋参考相关文献[4]进行孵育。孵育第3天在照蛋灯下,观察 5 种蛋生长情况,剔除未受精卵、未发育或死胚及卵黄破裂胚。 (2)建立CAM模型:参照贺国安等[5]的“无气室孵育法”加以改进,取6日龄鸡胚在无菌操作且保持一定温度下建立CAM模型;在CAM上方位置开窗,剪除窗口内的卵壳膜及气室膜,暴露鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)。 1.2.3 分组实验操作 将开窗成功的鸡胚40个随机分为KX组、YT?组、bFGF组、YT?组4组,每组10个种蛋。其中, KX组为阴性对照组,bFGF组、YT?组为阳性药物对照组。将直径约为0.4 cm的混合纤维素酯微孔滤膜片(已高压灭菌)作为载体置于各组CAM正对观察窗的表面无血管或血管最少处,然后用移液器分别吸取KX组、YT?组、YT?组血清和bFGF组各10μL,滴加于载体上。各组种蛋均用无菌透明胶封窗,标记后继续孵育72h,孵育时窗口朝上,不再翻蛋,每天开箱透气2次,随时剔去死亡鸡胚。同时,每隔24h各药物组和KX组各滴加1次10μL检测物于载体上,72h后不再滴加;无菌操作,保持鸡胚在一定温度下操作。 1.3指标检测 1.3.1 CAM标本观察 每组由专人参照高冬等人检测方法[6],用数码相机拍照(×2.3),镜下观察各CAM载体周围血管生长状态。 1.3.2 CAM血管计数 参照有关文献检测“血管指数”[7]。由专人根据数码相机拍摄的照片(均×2.3),均以微孔滤膜载体 6 边缘1mm范围内为血管计数范围,凡以载体为中心发出、与滤膜半径的夹角小于45?的血管均予计数。 1.4统计学处理 所有数据以均数?差(?s)表示,用SPSS 16.0统计软件分析。计量资料采用One-way ANOVA单因素方差分析比较各组新生血管数差异。 2结 果 2.1鸡胚CAM血管形态学观察 加药72h,各药物组与KX组相比血管明显增宽。各药物组粗大血管及细小分支迅速增多,血管网络清晰,呈叶脉样,放射性生长,血管管径显著增粗,且建立侧枝循环。药物组间促血管新生有明显区别,以bFGF组和YT?组血管生长最为旺盛,见图1,4。 2.2鸡胚CAM新生血管计数 由表1可知:72h,各药物组与空白血清组比较皆有统计学意义(均P0.01),各组血管新生数呈bFGF组> YT?组> YT?组>KX组,提示YT?促血管新生作用远高于其原方YT?组。 3讨 论 血管新生即原有的血管又产生新的血管,生理情况下血管生长处于相对平衡状态,当发生缺血缺氧及肿瘤等应激情况时平衡失控, 血管新生的过程被激活, 导致侧枝血管形成。 7 以往对冠心病发展过程中冠状动脉侧枝循环的研究主要集中在压力梯度及血流量等物理因素,而目前研究发现在心肌缺血缺氧时,冠脉侧枝的形成可以减少或抵御心肌缺血或坏死,保证血液的正常供给,而其中成纤维细胞生长因子(bFGF) 、血管内皮细胞生长因子(VEGF) 的信使核糖核酸(mRNA)表达明显增多,说明侧枝循环的建立可能与具有生物活性物质的作用有关。心肌缺血是CHD的重要病理特点,改善冠状微循环的灌流对于有效防治CHD心肌缺血有重要意义[8]。治疗性血管新生通过某些干预,在缺血心肌中上调能促进血管生长的细胞因子或受体,从而促进新的小血管生长,建立能够有效供血的侧支循环,达到恢复缺血心肌血供、改善患者症状和预后的目的。因此,研究促进血管生成对冠心病的预防、治疗均具有重要意义。 鸡胚绒毛尿囊膜技术是国内外研究血管生长常用的实验技术之一[9],CAM上具有丰富的毛细血管网,可直接观察药物对其血管生成的影响情况,是药物对微血管作用理想体内模型。Deofwwt等[10]在研究中发现,受精鸡蛋孵化第6,9天,CAM上毛细血管密度不断增大,说明此阶段是CAM上血管生长旺盛阶段,本实验观察结果与文献报道一致,因此选择鸡胚发育的6,9天为给药期,是CAM血管生长的高峰阶段,可以明确地观察到施加药物的作用;并根据现代中药血清药理学理论,选取重组碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)及养心 8 通脉方原方为阳性对照,利用较客观的血管记数法研究养心通脉有效部位方对CAM血管生成的影响。 著名中医学家秦伯未先生强调,胸痹之病主要由于“心气不足,营行障碍”所致,治宜“扶心气,活心血”。养心通脉片是笔者宗其“扶养心气,和通血脉”之意,调整组方而成。养心通脉有效部位方(YT?)是笔者从YT?原方综合提取出到的人参皂苷、人参多糖、总丹参酮?A、丹参菲醌、复方苷类、复方苷元、复方多糖、复方蛋白、总生物碱、总挥发油10个成分部位中,通过对其中“起主要作用有效成分部位”、“主要与次要有效部位交互作用”及“各有效成分部位的有效剂量配伍”抗心肌缺血的系列研究,已确定的“最佳有效成分部位方”,是由人参皂苷、人参多糖、丹参酮?A、总生物碱和总挥发油所组成。本项实验通过观察加药后72hCAM的变化,YT?组和bFGF组与YT?组比较有统计学差异(均P <0.01)。表明YT?与YT?和bFGF一样有促血管新生作用,且YT?作用与bFGF作用相当,明显优于YT?。本项实验研究表明,养心通脉原方(YT?)和在其基础上提取的由有效成分部位最佳剂量组成的养心通脉有效部位方(YT?)都具有明显的促血管生成作用,提示益气活血法有促血管新生作用,与临床报道一致[11]。因此,血管新生是益气活血法干预冠心病心肌缺血的重要途径。 参考文献 [1] 袁肇凯.养心通脉方治疗冠心病心绞痛的临床研究[J]. 9 中国新药与临床药理,1998,9(1):19-21. 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