人类疮疹病毒6,7型体外感染淋巴细胞对四种细胞因

人类疮疹病毒6,7型体外感染淋巴细胞对四种细胞因 人类疮疹病毒6,7型体外感染淋巴细胞对四 种细胞因 576 对四 彭光勇 疱疹病毒6,7型体外感染淋巴细胞 种胞因子分泌的影响. 姚壁任强季晓辉R;7l’ 【摘要】目的研究人类疱疹病毒6,7型(hL口alllaerpesvin~6and7,IthW-6,ItttV-7)体外感染 对免疫功能的影响.方法采用生物活性法或ELISA法分别检测丁HltV-7qas聊,YY52株病毒及 ttttV~GS株感染脐血单个核细胞(CB.~ICs),培养上清中细胞因子T PT0水平 口,IFN-~’,IL-10,IL-12 的动态变化结果3株病毒感染CBMes后前2天均轻度抑制IFN-~’产生,然后此抑制作用逐渐消 失;3株病毒均能平稳诱导IL-12P70产生,但Gs组诱生水平低于a嘲及YY5组;3株病毒在接种 后早期都能诱生IL-10,GS诱生IL-10水平高于aas舯v,YY5株;3株病毒均能较强地诱导CBMG~产生 ~lrFo~1,但到达峰值时间Gla.,YY5迟于Gs株.结论m?_6,ItHV-7感染早期都可以通过影响细胞 因子的分泌影响免疫功能,但ItI-IV-6影响程度强于ItltV-7. 【主题词】.人类疱疹病毒6型;人类疱疹病毒7型;细胞因子;淋巴细胞 ——7一—— Ef硼0dI碰?0f,IFI~~,lOand?,I2iDnpbbyhH衄herp酐.吣6 taxi7-曲口PENGgyg.YAO噩m,础Q,o1.Hr研?埘呦andl皿m.一 , 埘却Me~.olUmto~酊,7撕210029,P.月.C m嘶:黜岛,,~-ra.41:q@r蛳.池m 【Ab吕哪】d吣ecTosnl由tIleeffectsOnlynlpIl0cy馏i~rmatmefi~tiena 日knfeet~byhuman pe~,irus6a7(ttI-IV-6,I-1t~’-7).Med町ds~tienof肝d,丫.?,10a?,12PT0in dueedbyHltV-6GSstrainandHHv一7Glasgow.丫Y5啮ind1e8帅咀I1日ta|船ofc0工dbIo0dm0n叫1I|clearcelg (CB31cs)we圯evaltmtedbybiaetMtyassaya|ldEu弧ReR(1)1secretions ?一丫慌 slightlyinhihi~edinCBMG~supemabtswith哪v一7Glas目_州,丫Y5andHttV-6GSg呻i瑚d~ring2嘶sa雠rin— feetion,thent11einhihitedeffec~di吕a&red.(2)aasgow,YY5a|ldGS 啦rnscouIdsmindueeIL-10se— creti~incdt~l札llE曲atearlyphaseofirl’eefi~,d1eIl1I】tofIL-10i玎dI.oedbyGSw舶hil盯d】aIlthat ofGlas目_州andYY5g呻i哪.(3)aas日.YY5andGSg呻i啮c0LddallinduceIL-12PT0,hu上t11epn)dI1cd蚰.f 12PT0~,dueedbyGSw岫lowerll】anthatbyGLasgowandYY5s”ns(4)Glas 目_州.YY5andGS岫 0砌dallryinduceTF_a?cboIl,but哪v一7infeet~culhlr鹄I髓cl?edt11emanallevdatday3andd 4ofirl’eetic~,laterthan岫.fItI-IV-6GS(砒2ofMeeti~n)阻抵t6驿deII.orI. stla【ethatttttV_6andItI-W-7couldallpemub_m哪IlI1efl山?ti0nbyinducingthecokir?静sea?onmyp}’ase ofinfeetien,blnt11eeffee~ofHHV一6w雠muchr0『l帮rd】aIlthatoft-1I~’-7. 【hjectwor出】?姗herpes’elfin6;tfum~I.e1p蝌iIus7;C.~oldnes;Iy妇 人类疱疹病毒6型(humanhe胂virus6,UhrV_ 6)是1986年由Sal~udd等首次从淋巴细胞增生及 AIDS病人的外周血单个核细胞(PBMCs)中分离, I~nrV-7是1990年由F~enkel等首次从健康人PBMCs 中分离,两者同属于人类口.疱疹病毒,都能感染淋巴 细胞,以潜伏状态存在于人体中.近来研究表明,细 胞因子网络的失衡所导致细胞免疫功能障碍,是胞 内病原体长期感染的主要原因….HttV-6,HlaW.7 在体内长期潜伏感染是否与细胞因子网络平衡失调 基金项目:国家自然科学基金资助项目(39);江苏省自然 科学基金资助项目(B?,删1) 作者单位210029,南京医科大学微生物与免疫学教研室 通信作者:彭光勇(Br口且d酬精@曲血m) 有关?我们研究了HttV.6标准株GS,HttV-7标准株 Gla8v及我室最近分离的YY5株体外感染脐血单 个核细胞(CBI~ICs)对’I~IF.Q,IFN.,1L-10,1L-12PT0 诱生的影响,并对其在病毒感染早期的作用作了初 步探讨. 材料与方法 病毒株:HHV-6(IS标准株,HHV-7aa8脚标准 株.前者在HSB2细胞上,后者在sugrl细胞上传代 培养,由香港大学微生物学系惠赠.YY5株为我室 从一肾病患儿唾液中分离的HttV-7中国南京株), 在CBI~ICs中传代培养. 细胞:(1)人脐血单个核细胞(CBMCs),南京妇幼 CbinJcrobiollmmuno1.NovembeT2OOO.V20.No6 保健院提供肝素抗凝脐血,Ficol1分离,在淋巴细胞 生长液中培养.培养条件:20%新生牛血清的RPMI 1640,含PHA40庙,m1,IL-2IOU]m1,谷氨酰胺2mmoY L,青,链霉索各100U/ml.(2)SUPT1,HSB2细胞系, 来自香港大学微生物学系;L929细胞由南京军区军 事医学研究所提供,用含10%新生牛血清的Pfl~l 1640传代培养 试剂:(1)F标准品,为重组人TNFSigTaa公 司产品.F.a单克隆抗体,第四军医大学金伯泉 教授惠赠.放射菌素D,Sigma公司产品.(2)lYN-7 EUSA检测试剂盒,Sigma公司产品;lL-10,IL-12PT0 ELISA检测试剂盒,GeI】zyII】e公司产品. 细胞因子检测标本的处理:用淋巴细胞生长液 调分离的CBMCs为2×1o6细胞/ml,加于24孔培养 板中,每孔lml,分别接种GS,Glasgow,YY5病毒株 100TC?/ml,并以同一批未接种病毒的CBMCs作 为未感染细胞对照,共用3批不同CBMCs,每批4个 平行样本,共l2个样本感染病毒,于5%co2,37? 培养.收集感染后的24,48,72,96,120h培养上清 液,-70%冻存待测. TNF-a的检测 TNF生物活性法检测:参考文献[3],用TNF敏 感细胞株L929微量细胞毒试验进行检测.TNF活 性单位,即50%细胞存活时的最高稀释孔吸光度 (A)值在标准曲线上的对应数值,再乘以稀释倍数. TNF—a中和试验:取感染上清液与肿.n单抗 表1病毒感染后不同时间培养上清中IFN-’f含? 按50:1混合,37?1h,再用上法检测TNF活性 ?,10,?,12PT0,IFN-”/ELISA检测:取上述冻 存上清液按试剂盒说明要求检测.最小检测浓 度,IL-12P70为20os/ml,IL-10为151~ml,IFN一-,/为 5pg/rrd. 统计分析:结果为12个样本平均值,用j?表 示.采用Sigmastat统计软件,用单因素方差分析F 检验,组间差异的显着性用q检验.P<0.05有统 计学意义 结果 1.唧V.6GS,HItV-7aas眢mYY5株体外感 染CliMes产生IFN-~/动力学特征:由表1可见GS, G~gow及YY5株感染CBMCs后24,48h和对照组 相比均轻度抑制IFN-’~产生,72,96h各病毒组的 IFN.7诱生水平接近于正常对照组,到感染第5天各 组产生IFN-7量均显着下降,其中正常对照组的下 降幅度最明显.但除感染24,48,96h上清中,Gs组 与对照组差异有显着性外,其余各组间差异均无统 计学意义 2.丑?v.6GS,I-tHV-7aas眢0w,YY5株体外感 染CBMCs产生12PT0动力学特征:由表2可 见,HHV-6GS,HIW一7Glasgow,YY5感染CBMCs后均 能诱导IL-12P70的产生,且随时间的推移,IL--12 P70量的变化较平缓.感染5d中,3株病毒产生?广 121770量都高于EBMCs对照组;而cS株产生IL-12 Table1.pr0d删加0f?N-.岫i?aIlhIre轴pc功矗恤?ba’di~cmtd矗pjnfd(ead2舯=12.? pg,咖) *P(O.06v日groupCBMCs 裹2病毒感染后不同耐问培养上清中IL-12PT0含量 Table2._a0fIL-12PT0i口i?dedaII帆gH瑾岫拓时dlffcrtmd町哼p晒tliffemon(,~粤唧=12 ?.t~d,m) *尸(001,#P<0?v吕groupCBM~;zxp<0.05vgroupGS+CBMCs P70的量始终低于?{v.7Glasgow,YY5组. 3.I-WlV-6G8,I’WlV-7Glasgow,YYs株体外感染 CBMCs产生IL-10动力学特征:由表3可见,HHV一 6,?v.7均诱导CBMCs产生IL-10.病毒接种后24 h,GS株诱导IL-10产生量明显多于YY5及CBMCs 对照组;在接种后3—5d,各病毒组产生IL-10量均 显着高于CBMCs对照组,但各病毒组间十分相近. 4.HHV-6GS株,HHV-7Glasgow,YY$株诱导 CBMCs产生TNF-II动力学特征:由表4可见,在病 毒感染CBMCs24h后,HHV-6GS株即能明显诱导 TNF产生,48h左右达高峰,以后逐渐下降;在接种 后1—4d,F的活性均明显高于正常对照组.而 HHV-7,YY5及Glasgow株产生TNF的峰值间迟于 G5株,Glasgow在第3天出现峰值,w5在第4天才 出现峰值;且接种后1—5d,TNF活性也明显高于正 常对照组.中和试验表明,抗人TNF-a的单抗能显 着中和L929细胞微量细胞毒试验所测的TNF活性. 讨论 HHV-6,7是近年发现的人类口疱疹病毒,我室 已先后在中国南京分离鉴定了HHV45和HHV-7的 地方株CN和YY【.本文结果证实,GS,Glasgow, w5株感染CBMCs早期均轻度抑制IFN-7分泌;3 株病毒都能诱生有生物活性的IL-12P70,都能诱生 IL-10及TNF-a,但各病毒株诱生细胞因子特点各不 相同 在抗病原微生物感染中,IFN一7属于Twl类细胞 因子,主要由活他的CIM(Tw1),CD8T细胞及NK 细胞产生,是单核巨噬细胞激活因子,通过加强单 核细胞各种功能,在病毒感染过程中,介导细胞免 疫,发挥重要抗病毒作用IL-10属于To2类细胞 因子,在小鼠主要由Ta2细胞产生,在人主要由B细 胞和巨噬细胞产生,是重要的负调节因子,能抑制 Tw1类细胞因子的分泌,下调T细胞和单核巨噬细 胞功能,抑制细胞免疫.我们观察GS,Glasgow, 3株病毒感染的CBMCs,发现两类病毒感染早 期都轻度抑制IFN-7分泌,诱生IL-10,从而削弱了 1类反应,优势激活了TH2类反应.这一结果提 示,HHV.6,HHV.7在体内感染是否也有同样的效 应,使病毒难以被清除,而导致长期潜伏感染,细胞 免疫功能降低及其所分泌的细胞因子失调. IL-12是诱导Ta1类细胞分化的重要因子,TNF- a是一个重要的炎症因子,在病毒感染急性期,通过 各种机制发挥重要的抗病毒作用.本实验研究 发现,GS,Glasgow,YY5株感染CBMCs早期都能诱生 有生物活性的IL-12P70及TNF-Q,可能与病毒感染 早期激活单核巨噬系统密切相关.另外,IL-10能明 显地抑制IL-12,IFN.7分泌,IL-12也能刺激IFN-7分 泌,我们研究发现,HHV45GS对IFN.7诱生的抑 制作用较明显,且发生较早,这与GS和HHV-7Glas. gow,YY5诱生ILl0,IL-12的特点不同有关.G5诱 生IL-10的能力在感染后24h显着高于Glasgow和 裹3病毒感染后不同时间培养上清中IL-10含? Table3.The0d0fIL-I@In埘州culture棚pe血咖曲曩diffclxatdaysp孵t_皿妇垴m【鼬grot~=l2l?s redl~ Utml *P<0.01.#P<0.?.呷C/IMCs;?P<0.?vs姐pcS+CBMCa 裹4病毒感染后不同时间培养上清中1T日啦含? Table4.Theerodue~*0fTNl~-Gtinhffo~dtlculture蛐per衄岫豳啦tlR’ermtdarsp孵tlnlll0n(鼬grct~–12,? P<001,P<0?vsgroupCBMCa~?P<0?,?P<0.01哪cS+CBMCa 6期ChinJMicrobiolh玎I?.H叫舢,Vol20,No.6?579 YY5,而诱生IL-12的能力则基本上低于Gl,~gow和 YY5,因而出现cs对IFN一-,/诱生的抑制作用较明 显,尤其是在感染早期同时,cs感染产生炎症因 子TNF.a也显着早于HhrV.7两毒株,显示HhVV-6CS 株感染时造成细胞因子网络失调更为显着提示 HHV-6导致免疫功能紊乱的可能性明显高于?{v. 7,与临床观察到的HI-IV-6的致病性较强,与某些疾 病的相关性高于HHV-7的现象是一致的 参考文献 -GongJH,凸肌gM.MoilinRL,d.Intedeukin-10-’g】1一日附’_ oo6aaerbamtu~do.sbinduF.xpMed.1991.174:1209-1218. 7Fi0a~alinoDF.Mg”,.~loamnn住.Twot3.pes,ffmouselle1T eeJ1.IV.TH2a口醐secrete?fBb.thainl~itscnal:~ctkmby. lc.JB中Med.1989,170:20~1-2087. 8pexussiaB.ch蚰SH,D’AndreaA.et.Namral枷豇(M()cellstlm— ula~’r’fael~0rIL-12hasddffe1999-07~2) *黑素细胞刺激素对内毒素血症大鼠不同组织表达 巨噬细胞移动抑制因子的影响 吴秀菊田野苹周正芳郑玲莉马施华陈宜张 巨噬细胞移动抑制因子(啪咖pha ?im”0I1inhibitoryfactor,加)是最早被发 现的细胞因子之一,目前已知加F广泛 分布于多种器官和组织参与多种生理 和病理过程.0.黑紊细胞刺激紊(a-n,,d— anoeyte-,ztim~datilagl’anmom.惶H)是一种 内源性神经免疫调节肽.本试验观察了 a-?FISH对内毒素血症大鼠不同组织表达 IVlffmRNA的影响.为探明a-IVISH作为 内源性神经免疫调节肚的抗炎作用及机 理提供新的实验依据. 雌性sD大鼠,体重200,250g.随机 分为3组,分别为正常对照组,a-MSH未 治疗组及a-MSH治疗组.通过腹腔注射 基金项目:国家自然科学基金资助项目 (39670980J;军队神经生理学重点实验室基金 作者单位:第二军医大学免疫学教研室 (吴秀萄.田野革,周正芳.鄂玲藕.马施华); 军趴神经生理学重点实验室(胨宜张) 通信作者:田野苹.200433上海.第二军 医大学免疫学教研室 0.5rrgIPs诱导内毒素血症大鼠模 型.a-IVISH治疗组在注射LPS后按 O.25mg/kg剂量经尾静脉给予o.-MSH; IRISH未治疗组在注射LPS后经尾静脉给 予灭菌生理盐水;正常对照组大鼠腹腔 和尾静脉均注射灭菌生理盐水.给药后 12h断头处死大鼠,立即取出脑组织.分 离出大脑皮层,下丘脑,垂体和海马,同 时取出肾上腺和脾脏.抽提各组织总 RNA.采用半定量tlT-PCR和I’,loahem印 违杂交方法,检测大鼠不嗣组织皿 mRNA的表达. 结果显示,正常对照组大鼠各组织 中IVlffraI:INA的表达水平较低.M明 未治疗组的内毒紊血症大鼠垂体,下丘 齄,海马,大脑皮层厦肾上腺和脾脏砌F mRNA的表达明显增加,证实IVlff是内 毒紊致病过程中重要的炎症反应介质. a-MSH治疗组的内毒紊血症大鼠垂体, 海马,肾上腺和脾脏IVlffral~A的表达 与未治疗组比较明显减少,但是大脑皮 层和下丘脑部位MIFraP,~A的表达无明 显改变,提示a-MSH对内毒素血症大鼠 mF表达的抑制作用可能是其抗内毒紊 血症的作用机制之一. 下丘脑.垂俸.肾上腺(HPA)轴在机 体感染与应澈中具有非常重要的调节作 甩.内毒紊血症是一种严重的全身炎症 反应,HPA轴可能通过分越神经肽和激 素影响免疫细胞和免疫因子的功能进而 调节全身炎症反应.肾上腺是神经内分 泌的主要器官之一,其分泌的糖皮质激 素是炎症反应中的重要调节因子.有报 道证实IVlff能够拈抗糖皮质激素抑制单 棱细胞产生促炎症细胞因子的作用.表 明IVlff可影响珊lA轴的免疫调节功能. 可以下调垂体和肾上腺IVlff mRNA的表达,说明MsH与HPA轴调 节机体免疫应答密切相关.a-IVISH还可 直接抑制免疫器官——睥脏表达炎症反 应介质IVlff,进一步揭示a-IVISH在全身 炎症反应中具有重要调节作用. (收稿日期:2OO0-O3一l6)