中华蟾蜍卵巢性类固醇激素受体的免疫细胞化学研究

中华蟾蜍卵巢性类固醇激素受体的免疫细胞化学研究 中华蟾蜍卵巢性类固醇激素受体的免疫细胞化学研究汪安云吴孝兵安徽师范大学生命科学学院安徽芜湖241000摘要为探讨两栖动物卵巢内不同性类固醇激素受体在卵子发育中的调控作用.采用免疫细胞化学方法对中华蟾蜍不同发育时期卵泡中的雌激素受体、孕激素受体和雄激素受体进行了定位.结果发现三种受体在不同发育时期的卵泡中均有阳性反应雌激素受体在卵黄合成期和卵黄合成后期的滤泡细胞表达为强阳性在卵母细胞胞质和核膜中呈弱阳性反应孕激素受体在卵黄合成早期的滤泡细胞和卵母细胞质、核膜中表达均较弱在卵黄合成后期表达均增强雄激素受体在卵黄合成早期的滤泡细胞和卵母细胞胞质、核膜中表达也均较弱在卵黄合成后期卵母细胞胞质和核膜中表达略有增强.关键词中华蟾蜍性类固醇激素受体免疫细胞化学中图分类号Q492.5文献标识码A文章编号1001-2443200603-0262-04在脊椎动物的生殖发育过程中雌激素受体、孕激素受体和雄激素受体发挥着重要的生理作用.随着蛋白质化学的发展与放射免疫测定和免疫组织细胞化学技术的广泛应用两栖类动物卵巢类固醇激素受体的研究进展迅速且在两栖动物已有报道1-8但仍存在分歧.中华蟾蜍Bufogargarizans属两栖纲蟾蜍科其卵巢中雌激素受体、孕激素受体和雄激素受体的分布尚未见报道.本文采用免疫细胞化学方法对性类固醇激素受体在中华蟾蜍卵泡发育中的分布进行研究旨在进一步探讨类固醇激素受体在卵子发育中的调节机制以及中华蟾蜍生殖活动的特点和规律并为两栖动物生殖生理学研究积累相关资料.1材料与方法1.1材料雌性成体中华蟾蜍共32例体重33-98g.于2004-03-10购自芜湖市吉和农贸市场每月4例.解剖取其性腺切成数小块浸入新配制的Bouin氏液固定24h梯度酒精脱水石蜡包埋切片厚6??m.1.2方法切片脱蜡入水后放入新鲜配制的3H2O2溶液中10min抗原热修复15min然后采用SABCstreptavidin-biotincomplex法进行免疫细胞化学反应.第一抗体分别为兔抗人雌激素受体estrogenreceptorER、兔抗人孕激素受体progesteronerceptorPR、兔抗人雄激素受体androgenreceptorAR.4?孵育18h.第二抗体为即用型羊抗兔IgG室温下孵育20min再加SABC复合物室温下孵育20min最后用二氨基联苯胺显色5-10min.阴性对照片用PBS代替第一抗体进行孵育为阴性反应.抗体及药品均为武汉博士德公司产品.本实验统计了免疫染色反应的3种受体各10张切片各50个不同发育时期的卵母细胞.按阳性部位免疫反应着色强弱分为四级为强阳性反应显深棕色为中等阳性反应显棕色为弱阳性反应显浅棕色-为阴性反应显浅黄色或无色.2结果与分析2.1雌激素受体在卵巢中的分布表1收稿日期2006-01-18基金项目国家自然科学基金30470244安徽省高校青年教师科研资助项目No.2004jq123安徽省优秀青年基金No.04043049作者简介汪安云1980-女安徽枞阳人硕士研究生Emailway1222sohu.com通讯作者吴孝兵1965-男安徽全椒人教授博士博士生导师.Emailwuxbmail.ahnu.edu.cn第29卷3期2006年6月安徽师范大学学报自然科学版JournalofAnhuiNormalUniversityNaturalScienceVol.29No.3Jun.2006在卵巢?-?期卵泡中受体阳性反应广泛分布于滤泡细胞、卵母细胞胞质和核膜等部位.其中滤泡细胞为中等阳性反应卵母细胞胞质和核膜为弱阳性反应.?-?期随着卵泡体积增大滤泡细胞阳性反应增强呈强阳性反应图版11-3.2.2孕激素受体在卵巢中的分布表1卵巢?-?期卵泡中孕激素受体阳性反应定位于滤泡细胞、卵母细胞胞质和核膜.滤泡细胞呈弱阳性反应卵母细胞胞质和核膜呈中等阳性反应.?-?期卵泡中滤泡细胞阳性反应有所增强图版14-6.2.3雄激素受体在卵巢中的分布表1在卵巢?-?期卵泡中滤泡细胞、卵母细胞胞质和核膜均呈免疫阳性反应?-?期雄激素受体阳性反应定位 于滤泡细胞、卵母细胞胞质和核膜且阳性反应均有所增强图版17-9.表1中华蟾蜍不同发育时期卵泡中类固醇激素受体的分布 Table1DistributionofsteroidhormonereceptorsatdifferentstagesoffollicledevelopmentofBu fogargarizans发育时期 DevelopmentalstagesERPRARFcCpNmNpFcCpNmNpFcCpNmNp对照Control?-?----?-?----强免疫阳性反应Strongimmunopositivereaction中等阳性反应Mediumpositivereaction弱阳性反应Weakpositivereaction-阴性反应NegativereactionER 雌激素受体EstrogenreceptorPR孕激素受体ProgesteronereceptorAR雄激素受体AndrogenreceptorFc滤泡细胞FolliclecellCp胞质CytoplasmNm核膜 NuclearmembraneNp核质Nucleoplasm3讨论3.1中华蟾蜍滤泡细胞、膜细胞性类固醇激素受体的分布与变化Duda等9用免疫组化方法对猪卵巢的雄激素受体进行了检测结果发现雄激素受体在滤泡细胞核、膜细胞核、黄体细胞核等中均有表达.雷忻等8用免疫细胞化学方法对隆肛蛙卵巢进行了检测发现雌激素受体、孕激素受体和雄激素受体在不同发育时期的滤泡细胞和卵母细胞胞质、核膜中均有表达.方永强等10用免疫细胞化学方法对文昌鱼卵巢中雌激素受体、孕激素受体和雄激素受体进行定位研究结果发现在小生长期三种受体通常定位在卵原细胞和早期初级卵母细胞的胞质或核膜在大生长期和成熟期则定位在胞质和核质.我们的研究发现三种受体免疫反应广泛分布于中华蟾蜍不同发育时期滤泡细胞和卵母细胞的胞质、核膜等部位同Duda和方永强的研究结果相似与雷忻研究隆肛蛙卵巢类固醇激素受体分布特征一致.但是与隆肛蛙相比较在中华蟾蜍卵巢不同发育时期的滤泡细胞、卵母细胞中雌激素受体、孕激素受体和雄激素受体免疫反应的表达强弱程度不尽一致.中华蟾蜍和隆肛蛙都属两栖类无尾目动物前者主要生活于水田旱地及水沟池塘小河静水水域附近的农作物或杂草中芜湖地区2月份产卵.后者栖居于山区的溪流里5-8月间产卵.它们的卵巢类固醇激素受体的分布特点存在一定共同点体现了二者生殖生理的共性但又有一些不同点这可能与它们的生活环境和繁殖习性不同有关类固醇激素受体在卵巢中的表达不同也显示了较大的种间差异.3.2三种性类固醇激素受体与发育的关系传统观点认为类固醇激素受体主要存在于卵母细胞核.性类固醇激素受体与相应激素结合作为转录活性因子改变基因转录活动从而调节卵母细胞的发育和成熟过程较慢可能涉及一种基因组作用机制11-12.本实验在中华蟾蜍卵母细胞核膜中观察到三种类固醇激素受体均有表达暗示在中华蟾蜍卵母细胞发育和成熟过程中雌二醇、孕酮和睾酮也可能通过与核内受体结合作为核内转录活性因子作用于DNA的特定部位改变基因的转录活动从而调控卵母细胞的发育和成熟.近年来人们又发现另外一种调控方式类固醇激素受体可存在于卵母细胞的胞质中作为信号转导因子通过快速的非基因组机制来调节类固醇激素在卵母细胞发育和成熟中的作用可能是一种非基因组作用机制2.Migliaceio等1在爪蟾中发现雌激素受体也可存在于卵母细胞胞质中并发挥其信号转导作用Bayaa等3对爪蟾孕酮受体转导卵母细胞成熟的研究发现卵母细胞胞质中有孕酮受体且在去核卵母细胞中仍能激活分裂原活化蛋白激酶MAPK提出孕酮受体在胞质中有转导卵母细胞成熟的非基因调控作用Lutz36229卷第3期汪安云吴孝兵中华蟾蜍卵巢性固醇激素受体的免疫细胞化学研究图1中华蟾蜍卵巢类固醇激素受体的免疫细胞化学研究 Figure1ImmunocytochemistryofSexSteroidReceptorsintheOvaryoftheBufogargarizans1E R免疫阳性物定位在?期早期卵母细胞胞膜、胞质×402ER免疫阳性物定位在?期卵 泡的滤泡细胞、卵母细胞胞质、核膜×2003ER免疫阳性物定位在?期滤泡细胞 ×10004PR免疫阳性物定位在?期早期卵母细胞胞膜、胞质×1005PR免疫阳性物定位 在?-?期卵泡的滤泡细胞、卵母细胞胞质、核膜×1006PR免疫阳性物定位在?期卵 泡的滤泡细胞×2007AR免疫阳性物定位在?期卵泡的滤泡细胞、卵母细胞胞质、核 膜×1008AR免疫阳性物定位在?期卵泡的滤泡细胞、卵母细胞胞质、核膜×1009AR 免疫阳性物定位在?-?期卵泡×401ERlocatedinthecytoplasmmembraneof? earlystageoocyte.×402ERlocatedinthefolliclecellcytoplasmandnuclearmembraneof? stageoocyte.×2003ERlocatedinthefolliclecellof? stageoocyte.×10004PRlocatedinthecytoplasmmembraneof? earlystageoocyte.×1005PRlocatedinthefolliclecellcytoplasmandnuclearmembraneof? stageoocyte.×1006PRlocatedinthefolliclecellof? stageoocyte.×2007ARlocatedinthefolliclecellcytoplasmandnuclearmembraneof? stageoocyte.×1008ARlocatedinthefolliclecellcytoplasmandnuclearmembraneof? stageoocyte.×1009ARlocatedin?-?stagesfollicle.×40注?示免疫阳性物定位在滤泡 细胞??示免疫阳性物定位在卵母细胞的胞质、核膜示免疫阳性物定位在卵原细胞的 胞膜、胞质.等6用免疫组化方法对爪蟾雄激素受体的表达进行研究后发现雄激素受 体广泛分布在卵母细胞中包括质膜和胞质因而认为其在卵母细胞发育成熟中介导睾 酮的活动.这些研究都证明了两栖类卵母细胞可能存在这种非基因调控机制.本实验 观察发现中华蟾蜍各期卵母细胞胞质中也均有雌激素受体、孕激素受体和雄激素受 体的表达.因而推测在中华蟾蜍卵母细胞胞质中3种激素受体也可能作为核外胞质信 号转导因子对卵母细胞的生长、发育和成熟进行非基因调控.结合上述分析推测这两 种调控方式在中华蟾蜍卵母细胞中可能同时存在相互协作共同调控其发育和成熟但 具体如何调控还有待进一步研究.实验还发现三种类固醇激素受体在中华蟾蜍的各 期滤泡细胞中都有表达尤其是雌激素受体表达较为强烈.Madhabananda等13用免疫 组化方法对大鼠卵巢雌激素受体的表达研究发现雌激素受体β可在滤泡细胞中表 达.Isola等14对鸡卵巢的孕激素受体进行定位研究发现孕激素受体在滤泡细胞中显 阳性.Duda等9用免疫组化方法对猪卵巢的雄激素受体进行了检测结果发现雄激素受 体在滤泡细胞核有表达.在两栖类对黑斑蛙Rananigromaculata和其他四种蛙卵巢的 放射免疫测定法检测中发现滤泡细胞能产生孕酮和雌二醇睾酮是孕酮和雌二醇转化 的中间产物15-17.故而推测在中华蟾蜍卵巢滤泡细胞中雌激素受体和孕激素受体可 能对雌二醇和孕酮的合成与分泌有重要作用雄激素受体在三种激素的转化和分泌中 也可能有一定的调节作用.参考文献 1MIGLIACCIOAPICCOLODCASTORIAG.ActivationoftheSrc/p21ras/Erkpathwaybypr ogesteronereceptorviacross-talkwithestrogenreceptorJ.EMBO1998172008-2018.2CAST ORIAGBARONEMVDIDOMENICOMetal.Non-transcriptionalactionofoestradiolandpro gestintriggersDNAsythesisJ.EMBO1999182500-2510.3BAYAAMBOOTHRASHENGY. TheclassicalprogesteronereceptormediatesXenopusoocytematurationthroughanongenomic mechanismJ.Pnas2000972607-2612.4JINGDONGTSAMMYKELIANBETHHetal.Identi ficationofXPR-1aprogesteronereceptorrequiredforXenopusoocyteactivationJ.Pnas462安 徽师范大学学报自然科学版2006年 2000972614358-14363.5LUTZLBCOLELMGUPTAMKetal.Evidencethatandrogensareth eprimarysteroidsproducedbyXenopuslaevisovariesandmaysignalthroughtheclassicalandrogenreceptortopromoteoocytematurationJ.Pnas2001982413724-13733.6LUTZLBJAMNONGJITMYANGWHetal.SelectivemodulationofgenomicandnongenomicandrogenresponsesbyandrogenreceptorligandsJ.MolecularEndocrinology20031761106-1116.7SKOBLINAMN.EffectsoftheantagonistoftheclassicalprogesteronereceptoronovulationandmaturationofcommonfrogRanatemporariaLoocytesinvitroJ.Ontogenez2002336465-470.8雷忻张育 辉.隆肛蛙卵巢类固醇激素受体的免疫细胞化学研究J.西北农林科技大学学报自然科 学版 2004432733-36.9DUDAMBUREKMGALASJetal.ImmunohistochemicallocalizationofandrogenreceptorandaromataseintheovaryofthepregnantpigJ.RepordBiol20041143289-298.10方永强翁幼竹胡晓霞.性类固醇激素及其受体在文昌鱼性腺和神经系统中的分布J. 动物学报 2001474398-403.11BAGCHIMKTSAIMJOMALLEYBWetal.Analysisofthemechanismofsteroidhormonereceptor-dependentgeneactivationincell-freesystemsJ.EndocrRev199213525-535.12TRUSMBEATOM.SteroidhormonereceptorsinteractionwithdeoxyribonucleicacidandtranscriptionactorsJ.EndocrRev199314459-479.13MADHABANANDASFRANKW.Differentialexpressionofestrogenreceptor-aandestrogen-βintheratovaryJy.Endocrinolog y19991402963-971.14ISOLAJKORTEJMTUOHIMAAP.ImmunocytochemicallocalizationofprogesteronereceptorinthechickovaryJ.Endocrinology198712131034-1040.15AHNRSYOOMSKWONHB.EvidencefortwocellmodelofsteoidogenesisinfourspeciesofamphibianJ.ExpZool199928491-99.16KWONHBAHNRS.Relativerolesofthecaandgranulosacellsinovarianfollicularsteroidogenesisontheamphibian.RananigromaculataJ.GenCompEndocrinol199494207-214.17KWONHBCHOIHHAHNRS.SteroidproductionbyamphibianRananigromaculataOvarianfolliclesatdifferentdevelopmentalstagesJ.ExpZool1991260662-673.ImmunocytochemicalLocalizationofSexSteroidReceptorsintheOvaryofBufogargarizansWANGAnyunWUXiaobingCollegeofLifeSciencesAnhuiNormalUniversityWuhu241000ChinaAbstractItisresearchedthatsexsteroidreceptorsregulatetheoocyedevelopmentofamphibian.ImmunocytochemicallocalizationisinvestigatedatdifferentstagesofthefolliclesofBufogargarizansusingestrogenprogesteroneandandrogenreceptors.TheresultsindicatethatthereceptorsofestrogenandrogenandprogesteroneexistinoogoniaandoocytesofdifferentdevelopmentalstagesEstrogenreceptorisexpressedstronglyinfolliclecellsandweaklyinthecytoplasmandnuclearmembraneofoocytesatvitellogenicandpostvitellogenicstagesProgestogenreceptorisexpressedweaklyinfolliclecellsandcytoplasmnuclearmembraneofoocytesatvitellogenicstagebutatpostvitellogenicstagetheimmunopositivereactioninthesecellsisstrengthenedshowingmediumpositivereactionAndrogenreceptorshowsweaklypositivereactioninfolliclecellsandcytoplasmnuclearmembraneofoocytesatvitellogenicstagetheimmunopositivereactionisstrengthenedalittleincytoplasmnuclearmembranceofoocyteatpostvitellogenic.KeywordsBufogargarizansSexsteroidreceptorImmunocytochemistry56229卷第3期汪安云吴孝兵中华蟾蜍 卵巢性固醇激素受体的免疫细胞化学研究