流式荧光检测仪

流式荧光检测仪 ——Luminex 100? 流式荧光技术，是基于美国Luminex公司研制的多功能流式点阵仪（Luminex 100?）开发的高速度、高通量、并行检测的生物技术平台。它有机地整和了编码微球（color-coded beads）、激光技术、应用流体学、最新的高速 数字信号处理器和计算机运算法则，造就了其无与伦比的检测特异性和灵敏度，可广泛应用于免疫分析、核酸研 究、酶学分析、受体和配体识别分析等研究，得到各权威机构和医学界高度认可，是临床诊断领域以及生命科学 研究中的一大热点。 流式荧光技术是基于激光激发荧光的发光类技术之一，又称悬浮阵列、液态芯片。具有三大无与伦比的核心优势： Ø 微量标本，1检测，100个指标 Ø 既能检测蛋白，又能检测核酸 Ø 既能用于临床，又能用于科研 该技术的核心是把微小的聚苯乙烯小球（5.6 μm）用荧光染色的方法进行编码（微球的颜色是通过两种荧光染料 染色得到的，调节两种荧光染料的比例可以获得100种不同颜色的微球），然后将每种颜色的微球（或称为荧光 编码微球）共价交联上针对特定检测物的探针、抗原或抗体。应用时，先把针对不同检测物的编码微球混合，再 加入微量待检样本，在悬液中靶分子与微球面交联的分子进行特异性地结合，在一个反应孔内可以同时完成多 达100种不同的生物学反应。最后用Luminex?100进行分析，仪器通过两束激光分别识别编码微球和检测微球 上分子的荧光强度。因为分子杂交或免疫反应是在悬浮溶液中进行，检测速度极快，而且可以在一个微量液 态反应体系中同时检测多达100个指标。 1、 高通量：仅需微量样本（10μl），1次检测，最多100个指标； 2、 高速度：最快可达10000测试/小时； 3、 低成本：流式荧光联检的试剂用量少，能有效降低临床应用的试剂成本； 4、 灵敏度高：检测低限可达10pg/ml； 5、 重复性好：每个指标有5000个反应单元，分析100次取平均值； 6、 线性范围广：检测范围达6个数量级； 7、 无需洗涤：减少误差来源，且操作简便、省时省力。 1997年，Clinical Chemistry杂志刊登专文介绍多功能流式点阵仪及其技术，并将其誉为“真正的临床应用型生物芯片”。随后，运用多功能流式点阵仪及其技术进行临床诊断和基础研究成为生命科学研究领域的一大热点，相 关的研究论文频频刊登在Nature、Clinical Chemistry、Clin Biochem、Clin Chem Lab Med、Clin Diagn Lab Immunol、Lancet Oncol、Journal of Molecular Diagnostics、Genome Res、J Proteome Res、Cytometry、Journal of Clinical Microbiology、Clin Dev Immunol、Cancer、Cancer Research等国际权威学术杂志上。2001年7月27日，INOVA公司的ENA系列流式点阵试剂率先通过美国FDA的严格认证，标志着多功能流式点阵仪及其技术得到了美国官 方的高度认可，并由此成为首个，也是目前唯一得到美国FDA许可用于临床诊断的多指标并行检测技术。2005年6月9日，基于xMAP技术的学术论文刊登在当日出版的《自然》杂志上，这是学术界认可一项技术所能给予 的最高荣誉。2005年11月，为了表彰其对临床诊断技术进步做出的革命性贡献，全球科技产业和行业研究的权 威机构――Frost & Sullivan――授予xMAP技术“2005年度国际临床诊断技术革新大奖”，标志着xMAP技术在国际临床诊断技术领域的领军地位得到了最具权威的认可。 PCR 与许多一次做数百块Southern blots的研究人员一样，我第一次用PCR做基因分型（genotyping）时觉得见效很快，不再需要等几天才能看到结果，不再需要DNA显微图像或者操作紫外线了。随着技术的不断进步，RCR使基因组学和转录组学发生了翻天覆地的变化，甚至随着免疫PCR的普及开始进军蛋白组学。 目前有许多以RNA为基础的基因分型技术，有些只是名称不同，简单到只是跑块胶，有些很复杂，需要检 测单核苷酸多态性的累积。选择哪种方法当然依据需要而定，但这里对某些以PCR为基础的基因分型分析的优点和缺点做了一个简要。下标列出了一些常见的系统和平台及其详细特征。 The Simple Acronyms 最基本的设计是序列特异引物（sequence-specific primers ，SSP ）或称等位基因特异性引物延伸（allele specific primer extension ，ASPE）、序列特异性寡核苷酸探针（sequence-specific oligonucleotide probes，SSOP）或等位基因特异性寡核苷酸（allele-specific oligonucleotides ，ASO）、限制性片段长度多态性分析（restriction fragment length polymorphism，RFLP）。进行低通量研究时，这些分析不需要特异仪器。 一般情况下，SSP中变的异体专一引物所检测的特异突变或者是positive 或者是negative；在SSOP中，将标记过的扩增子（amplicon）绑定在位于杂交斑点上的变异体专一探针，检测突变；RFLP中，用限制性内源性降解PCR产物，通过观察切开或者未切开片段，得到结果。尽管突变的位点对SSP设计引物有限制，但SSOP和RFLP为引物设计带来了很大弹性，引物可以在任何地点，尝到甚至可以跨越突变。 我还发现RFLP（又称扩增片段长度多态性，amplified fragment length polymorphism，AFLP）得到明确结果，鉴别突变有合适和和便宜的核酸内切酶。加入标记过的引物，大多数遗传分析仪可推算片段长度。问题在于它需 要post-PCR操作，意味着污染的风险，而且也不适合高通量研究。 对于大项目，所有三种方法都很昂贵和耗时，但因为大多数自动化方法要求扩增小片段，基本的设计是分析 大片段的唯一选择。而且，有旁向性同源基因（paralogs）的基因需要具有位点特异性的引物。假如目的突变和 位点特异的引物相距较远，基本方法是必需的。 DNA的碱基组成影响变性温度。利用特异荧光染料或者标记探针的高分辨率熔解点分析能够在PCR（标准设备上）进行5～10分钟后鉴别一个PNA片段上的寡核苷酸突变，所需的专用设备包括Idaho Technology公司的LightScanner（或HR-1）和罗氏的LightTyper，但某些实时PCR平台也有这种功能。 该方法还可用于检测新突变和未知突变，专用设备能够在短时间内分析384孔平板，使高通量分析成为可能。 至少可以区分一个片段的4种熔解温度，用六种颜色标记探针。因此，至少一次能够探测24个靶标，因此这种方法很便宜，而且对引物设计没有要求，系统始终处于封闭的管中，降低了污染风险。一些变异在低分辨率平台 中会丢失，但这种方法有望成为最流行的筛选和检测突变的方法。 Pyrosequencing 多种引物延伸和以连接为基础的化学法已经整合入久经考验的“allelic discrimination”的高通量分析法中。焦磷酸测序法（Pyrosequencing）是一种新的实时DNA测序技术，以单碱基延伸反应（single base extension，SBE）为基础，在DNA 聚合酶、三磷酸腺苷硫酸化酶、荧光素酶（luciferase）和三磷酸腺苷双磷酸酶4种酶的协同作用下，使引物延伸聚合脱氧核糖核酸（dNTP）释放焦磷酸盐（PPi）、PPi转换三磷酸腺苷（ATP）、ATP产生荧光信号与dNTP和ATP的降解等化学反应偶联起来。dNTP以预定顺序被依次加入反应混合物中，如果序列上又添 加了一个碱基，会有荧光出现。焦磷酸测序法能够一次检测384个样本，在所有引物延伸反应中，对引物设计有 限制。 焦磷酸测序最适合于空间位置较近的多个突变的基因分型，但不适合检测单个突变，部份原因是实验程序稍 微复杂，而且会增加在酶和试剂上的开销。然而，对拥有自动genotype-calling能力的小或者中等大小的项目来说 是一种恰当的基因分型和微型测序法。 suspension array technology 一项液相基因型分析方法和荧光标记的微珠捕获过程相结合的新技术。在单碱基延伸反应中，5’端有特定标记且3’端有靶特异性的寡核苷酸，与PCR扩增的基因组DNA靶标杂交，然后被DNA聚合酶延伸。核酸探针经过生物素标记，微珠经过抗生素（生物素和抗生素相互作用）标记。然后用血细胞计数工具——Luminex分析仪分析微珠。 每个微珠都是某个单突变的聚集点，如果有突变，便会发射生物素－抗生物素蛋白产生的单色荧光。以珠子 为基础的平台与单碱基延伸、引物延伸、杂交和寡核苷酸连接反应能够达到相同的功效。Luminex发明了悬浮点阵技术，能够进行数百套检测，因此经过PCR扩增后，能够在一个孔中对50个二等位基因（biallelic）突变进行基因分型，使其对大量突变特别是HLA或者MICA中的单基因突变研究效果更佳。多路技术降低了分析成本， 但优化多元反应也很困难。 原则上，添加到引物末端的核苷能够直接依据质量，利用通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱 （matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectroscopy，MALDI-TOFMS）直接检测出来，这是一种不需标记的方法。单碱基延伸产物质谱结果能够显示所添加的核苷。 MALDI-TOFMS需要大型设备，但因为高度多路技术和高通量分析，这种方法的成本只为0.03美元/单突变，只是备的成本限制了其普及。MALDI-TOFMS还能实现利用非常少量的DNA的超高通量分析。最主要的MALDI-TOFMS平台是Sequenom的MassArray 基因分型系统。 一次基因分型分析所能够检测的遗传突变的数量正在快速增长，比如能进行全基因组联合研究的微点隈杂交 （Hybridization to microarrays）。虽然实验过程比较简单，但对于有多个旁系同源体的基因或相关的假基因，不能 简单地相信自动分析仪或者微列阵得到的结果。研究它们的突变，首先要对这些片段进行选择性扩增和基因分型， 基因的数量无关紧要，而且，单核苷酸多态性只代表了基因组突变的80%。还有要牢记一点：全基因组相关性研究并不是检测全基因组。 Comments for pENTRTM3C 3756 nucleotides rrnB T1 transcription termination sequence: bases 106-149 rrnB T2 transcription termination sequence: bases 281-308 attL1: bases 358-457 (complementary strand) Chloramphenicol resistance gene (CmR): bases 610-1268 ccdB gene: bases 1610-1915 attL2: bases 1985-2084 Kanamycin resistance gene: bases 2207-3016 pUC origin: bases 3080-3753 polylinker MCS for pENTRTM3C Dual Selection Vector