蜡块包埋、冰冻切片及HE染色技术.doc

蜡块包埋、冰冻切片及HE染色技术.doc 蜡块包埋、冰冻切片及HE染色技术 【实验目的】了解蜡块包埋切片、冰冻切片及HE染色的应用范围，了解染色的原理，掌握其操作方法。 【实验原理】 切片法，是利用锐利的刃具将组织切成极薄的片层，材料须经过一系列特殊的处理，如固定、脱水、包埋、切片、染色等，过程十分繁复。在制作过程中，还要经过一系列的物理和化学的处理，这些处理方法可根据各种不同材料的性质要求进行合理选择。切片法虽然工序繁琐，技术复杂，但是，它最能保持细胞间的正常的相互关系，能较好和较长时间地保留细胞的原貌，所以仍然是光学显微镜的主要制片方法。 【实验仪器、材料和试剂】 (一)仪器:石蜡切片机、恒温蜡箱、载玻片、盖玻片 (二)材料:洋葱根或小鼠肝 (三)试剂:福尔马林溶液(甲醛含量为35%至40%(一般是37%)的水溶液，也加入10%—15%的甲醇防止聚合)、苏木精、伊红、无水乙醇、1%盐酸-酒精(70%酒精99ml+浓HCl 1ml)、二甲苯、石蜡、加拿大树胶 A:0.5~1% 的伊红酒精溶液: 称取伊红Y 0.5~1 g，加少量蒸馏水溶解后，再滴加冰醋酸直至浆糊状。以滤纸过滤，将滤渣在烘箱中烤干后，以95%酒精(即工业酒精，如果不怕浪费，用无水乙醇配制也可)100毫升溶解。 B:苏木素染液配方:(配制3000 ml，可按比列减少) 苏木精 6 g 无水乙醇 100 ml 硫酸铝钾 150 g 蒸馏水 2000 ml 碘酸钠 1.2 g 冰醋酸 120 ml 甘油 900 ml 配制方法:将苏木素溶于无水乙醇，再将硫酸铝钾溶于蒸馏水，溶解后将甘油倾入一起混合，最后加入冰醋酸和碘酸钠。 【方法与步骤】 光学显微镜切片制作技术最简单的切片法是徒手切片，但是由于组织块往往十分柔软，切削很困难，而且无法得到十分菲薄的切片，因此必须先用某些特殊物质渗入组织块的内部起支持作用，并将整个组织块包住，然后再用精密的切片机制作切片，才能获得良好的效果。这 种方法称为包埋法，包埋的物质称为包埋剂。常用的包埋剂有石蜡、火棉胶、炭蜡、明胶等，水和塑料也可作为包埋剂。根据包埋剂的不同，分别有石蜡切片、火棉胶切片、冰冻切片等，它们各有长处，可以根据需要选用，但是使用得最多的还是石蜡切片技术。 石蜡作为包埋剂，有其独特的优点，例如:石蜡能切出极薄的蜡片(2,10μm);切片时能连成蜡带，便于制作连续切片;操作较容易，组织块可以包埋在石蜡中长期保存。然而石蜡切片的制作过程较长，步骤很多，一步不慎往往导致前功尽弃，而且这些处理引起组织块或多或少地收缩，切片时受湿度影响比较大，这些不足之处必须在制片过程中认真对待，尽量减小它的不良影响。 石蜡切片的制作过程主要包括:取材，固定，脱水，透明，透蜡，包埋，切片，贴片，染色，透明，封藏等步骤。 1( 取材 材料的好坏直接影响到切片的质量，无论取哪一种动植物材料，以下几点是必须注意的。 (1)植物材料选择时须尽可能不损伤植物体或所需要的部分;动物材料取用时常对动物施以麻醉，常用的麻醉剂有氯仿和乙醚，或将动物杀死后迅速取出所需要的组织。 (2)取材必须新鲜，这一点对于从事细胞生物学研究尤为重要，应该尽可能割取生活着的组织块，并随即投入固定液。 (3)切取材料时刀要锐利，避免因挤压细胞使其受到损伤。 (4)切取的材料应该小而薄，便于固定剂迅速渗入内部。一般厚度 2不超过2mm，大小不超过5×5mm。 2( 固定 组织和细胞离开机体后，在一定时间内仍然延续着生命活动，会引起病理变化直至归于死亡。为了使标本能反映它生前的正常状态，必须尽早地用某些化学药品迅速地杀死组织和细胞，阻抑上述变化，并将结构成分转化为不溶性物质，防止某些结构的溶化和消失。这种处理就是固定。除了上述作用外，固定剂会使组织适当硬化以便于随后的处理，还会改变细胞内部的折射系数并使某些部分易于染色。 固定剂的作用对象主要是蛋白质，至于其他成分如脂肪和糖，在一般制作时不加考虑，如要观察这些物质，可用特殊的方法将其固定下来。 固定剂的作用现在对材料体积的改变、硬化的程度、穿透的速度以及对染色的影响等方面。这些作用的好坏、大小，都依所固定的材料性质而定，同样一种固定液对某一材料来说是良好的，但对另外一些组织可能就不很适用。良好的固定剂必须具备的特征是:穿透组织的 速度快，能将细胞中的内含物凝固成不溶解物质，不使组织膨胀或收缩以保持原形，硬化组织的程度适中，增加细胞内含物的折光度，增加媒染和染色能力，具有保存剂作用。 固定剂有简单固定剂和混合固定剂的划分。 简单固定剂即单一的固定剂，常用的有乙醇、甲醛、冰醋酸、升汞、苦味酸、铬酸、重铬酸钾和锇酸。其中，苦味酸、升汞、铬酸既能凝固细胞清蛋白，又能凝固核蛋白;乙醇只能凝固清蛋白，而醋酸只能凝固核蛋白;甲醛、饿酸和重铬酸钾对这两种蛋白质都不凝固。 简单固定剂的局限性较大，如将其适当混合，制成复合固定剂可以取得更好的效果。常用的混合固定剂有: Bouin液(70份苦味酸饱和水溶液+25份4,甲醛+5份冰醋酸)、Zenker液(升汞5g，重铬酸钾2.5g，硫酸钠1.0g，5ml冰醋酸，100ml蒸镏水)、Carnoy改良液(3份无水乙醇+1份冰醋酸)等。固定剂的种类甚多，我们必须依据各种固定剂的性能及制片的不同要求来加以选择。 固定时，须注意以下几点: (1)固定剂应有足够的量，一般为组织块体积的10,15倍。 (2)如所固定的材料外表有不易穿透的物质，可将材料先在含乙醇的溶液中固定几分钟，再移入水溶性的固定液。 (3)材料固定后如不立即下沉，可将其中气泡抽出。 (4)固定时间依材料大小、固定剂种类而异，可从1小时到几十小时，有时中间需要更新固定剂。某些固定剂对组织的硬化作用较强，作用时间应严加控制，不能过长。 (5)一般固定剂都以新配制的为好，用过的不能再用。有些混合固定剂由甲、乙两液合并者，一定要在使用前才混合。 (6)固定完毕，根据所用固定剂的不同，用水或乙醇冲掉残留的固定剂，以免固定剂形成沉淀，影响以后组织块的染色。 3( 脱水 生物组织中含有大量的水分，它和石蜡是不能相溶的，致使在包埋时石蜡无法渗入组织内部，因此须使用脱水剂将水分除尽，这就是脱水的作用。 脱水剂必须能与水以任何比例相混合。脱水剂有两类:一类是非石蜡溶剂，如乙醇、丙酮等，脱水后必须再经过透明，才能透蜡包埋;另一类是兼石蜡溶剂，如正丁醇，脱水后即可直接透蜡。 常用的脱水剂是乙醇，因为它价格便宜，易于得到。为了避免剧烈的扩散引起的组织的强烈收缩，脱水步骤应从低到高以一定的浓度梯度 来进行:(一般组织从30,乙醇开始，经过50,、)70,、80,、95,(如从70,开始则过两遍)、100,(如从70,开始则过两遍)至完全脱水。 对于一些柔软的组织应从15,开始。脱水时间依据组织的类型和大小而定，一般各级乙醇中放置45min到1h，如果中间须停顿，应使材料停留在70,乙醇中，因为低浓度乙醇易使组织变软、解体，高浓度乙醇有脆化组织作用，放置时间不能过长，另外，脱水必须在有盖瓶中进行，以防止高浓度乙醇吸收空气中水分导致浓度降低而使脱水不彻底。需要保存的材料可脱水至70%乙醇时停留其中，如需长期保存，可加入等量的甘油。 4( 透明 组织块用非石蜡溶剂脱水后必须经过透明。透明剂能同时与脱水剂和石蜡混合，它取代了脱水剂后，石蜡便能顺利地渗入组织。透明剂的种类很多，较常用的是二甲苯、甲苯、苯、氯仿、香柏油和苯胺油等。 二甲苯作用较快，透明力强，但组织块在其中停留过久，容易收缩变脆变硬，同时若脱水不净，就会引起不良后果，在应用时必须特别小心。通常将组织块先经纯乙醇与二甲苯的等体积混合液，再进入纯二甲苯，这样可减少上述的缺点。透明时间应由组织大小而定，—般小鼠脏器为1-5min,大鼠10-15min,大型动物脏器适当延长。在纯二甲苯中应更换2次，总时间不超过3h为宜。材料经过透明，会显示出前一步脱水的效果如何，若脱水彻底，组织则显现透明状态，如组织中有白色云雾状，说明脱水不净，须返工处理，但返工的效果往往不好。使用二甲苯透明时，应避免其挥发和吸收空气中的水分，并保持其无水状态。 5( 透蜡 包埋用的石蜡，熔点在50,60?之间，应根据材料本身的硬度、切片的厚薄和当时的气温条件来选用。一般动物材料最常用的石蜡熔点为54,56?。切片薄的用58,60?的，切片厚的则用52,54?的;室温10,19?时选用52,54?的石蜡可顺利切片，冬季可用熔点46,48?的石蜡，夏季可选56,58?的。 石蜡的优劣与切片的成败密切相关。鉴别石蜡质量的方法是:将石蜡熔化后倒入纸盒使其凝结且无气泡和裂痕，30,35?放置24h且无气泡和不透明的晶状小点出现，蜡块裂面不呈颗粒状，切成薄片不碎成细粒。这种石蜡即为品质优良。含有杂质的新蜡或用过的废蜡可清洁 后再用，方法是将石蜡放入锅内，加热到开始冒白烟，然后用小火继续加热30min(注意别超过发火点)，使其去除水分和挥发性杂质，并在温箱中过滤以去除灰尘等颗粒。 透蜡须在恒温箱中进行，恒温箱的温度调节至高于石蜡熔点3度，使经过透明的组织块依次用石蜡与二甲苯的等量混合液、纯石蜡处理。纯石蜡应处理2,3次，透蜡的时间依材料性质而定，一般每次需15,30min。 透明的关键是控制温度的恒定，切忌忽高忽低，温度过低石蜡凝固无法渗透，温度过高使组织收缩发脆。 包埋是使浸透蜡的组织块包裹在石蜡中。具体做法是;先准备好纸盒(具体折法见图1-3及说明)，将熔蜡倒入盒内，迅速用预温的镊子夹取组织块平放在纸盒底部，切面朝下，再轻轻提起纸盒，平放在冷水中，待表面石蜡凝固后立即将纸盒按入水中，使其迅速冷却凝固，30min后取出。 6( 包埋 包埋用蜡的温度应略高于透蜡温度，保证组织块与周围石蜡完全融为一体。石蜡的迅速冷却也很重要，否则包埋块中将会产生结晶。以后切片时引起碎裂。 7( 切片 (1)石蜡块的固着与整修 在包埋以后，就可进行切片。包埋好的石蜡块装上切片机进行切片前还须进行固着和整修。 固着:一般旋转式切片机上都附有可固着石蜡块的金属小盘。用加热的蜡铲将包埋块粘贴于固着物上，并使组织块朝外，便于以后迅速切出所需的片子。 整修:用加热的蜡铲或刀片将固着的包埋块四周修平，使上下两面修成平行面，修好的蜡块呈长方形。还可削去一角以便于在蜡带上识别切片。 (2)切片机和切片刀 切片机是用来作各种组织切片的一种专门的精密机械，常用的是旋转式切片机，它的夹物部分是上下移动前后推进的，而夹刀部分则固定不动。切片时切片刀固定不动，转动转轮，标本台上下运动并按调好的切片厚度向前推进一定的距离，组织块上下运动一次，便在刀片上得到一张合乎厚度要求的切片。切片刀与切片的质量直接相关。(3)切片方法 切片前，选择刀口平整无缺刻的部分来进行切削。将所要切的包埋块 固定在标本台上，使包埋块外切面与标本夹截面平行，并让包埋块稍 露出一截。将刀台推至外缘后松开刀片夹的螺旋，上好刀片刀，包埋 块上下边与刀口平行。在微动装置上调节切片要求的厚度，将刀台移 至近标本台处，让刀口与组织切面稍稍接触，这时就可以开始切片了。 方法是:右手转动转轮，左手持毛笔在刀口稍下端接住切好的片子， 并托住切下的蜡带，待蜡带形成一定长度后，右手停止转动，持另一 枝毛笔轻轻将蜡带挑起，清水内，注意摇动转轮用力应均匀，防止切 片机震动厉害引起切片厚薄不均匀，还应注意转动的方向，以防标本 台后移而切不到片子。 8( 常规HE染色 (1)二甲苯(?) 10 min (2) 二甲苯(?) 10 min (3)无水乙醇(?) 1-3 min (4)无水乙醇(?) 1-3 min (5) 95%乙醇(?) 1-3 min (6)95%乙醇(?) 1-3 min (7)90%乙醇 1 min (8)80%乙醇 1 min (9)70%乙醇 1 min (10)蒸馏水 1 min 以上步骤称为脱蜡至水 (11)苏木精液染色 8-10 min (12) 流水稍洗去苏木精液 1-3 s (13) 1%盐酸乙醇(分化) 30-40 s (14) 流水冲洗(返蓝) 10-20 min (15) 95%乙醇 1 min (16) 0.5%伊红液染色 1-3 min (17) 蒸馏水稍洗 1-2 s (18) 95%乙醇(?) 1min (19) 95%乙醇(?) 1 min (20) 无水乙醇(?) 1 min (21) 无水乙醇(?) 1min (22) 二甲苯(?) 5 min (23) 二甲苯(?) 5 min (24) 二甲苯(?) 5 min (25) 中性树胶封固 结果:细胞浆红色，细胞核蓝紫色。