小鼠单离前庭神经节细胞培养和形态学观察

小鼠单离前庭神经节细胞培养和形态学观察 小鼠单离前庭神经节细胞培养和形态学观 察 中华耳鼻咽喉科杂志1999年12月第34卷第6期ChinJOtodailmlart~ol,纰nb1999,Vol34,No6 tieUe~techniques.indications.restdtalsAnnOto— ChitC,;ervi,:x~fac,1987,104:163—173 6ChevaL~rD,LacelO,RT哪D,el?bd0ePd forglaticeare~withfm~tion町hnpalr,~dd帅曲oftheti’~aevocal .:5 本研究建立前庭神经节细胞 (vihllar1?cells,VGC)的分离及 体外培养技术,并用免疫组化染色观察 和识别培养的神经细胞. 一 ,材料和方法 1.细胞分离和培养:出生后1—5d 的ICR/IER小鼠100只,由日本关西医 科大学实验动物中心提供.动物处死后 将颞骨置于4?EaIle缓冲盐水液(earle l~[eredsolution,EBSS;GBICO,美 国),自内耳道摘取前庭神经节,37”12下 酵消化9_5min,ElLiS冲洗2次,加A培养 液.单离的细胞被接种到硅胶培养皿底 部的玻片上,培养皿体积约200山玻 片预先涂覆50te-/,’~的鼠尾胶原(5re-/ ?;Bib-tonDickinsanLabwa~,美国)备 用.于免疫组化染色时,细胞被接种于 双槽塑料培养皿(Lab-Tak,美国),置于 37’125%c啦孵箱中培养.培养液组成: 27%z,~teminimumessentialmedium (GIBCO,美国),33%EBSS,4o%马血清 (GIBCO,美国)和1001U/rid青霉素(Sig- ?如美国).葡萄糖最终浓度6.6k 培养液中马血清渐减(每次换液减少 10%)而加人等量人血清. 2免疫细胞化学染色:培养7—14d 将标本置于4%甲醛固定30nfizt.采用 等1的免疫荧光法和ABC法染 色.一抗为抗神经微丝(z枷inmb, NF)抗体(a,美国). 免疫荧光法:标本经15%羊血清和 作者单位:10(~53北京解放军总医院耳 鼻咽喉科(杨仕暇,姜泗长,杨伟炎,顾瑞);日 本关西医科大学耳鼻咽喉科(山下敏夫) 0.3%TritonX-100(PBs稀释)处理印 rain,加人一抗(1:25o)孵育2h后.滴加 荧光素标记的羊抗兔I(1:50;Jackson Immunoresea~h,美国)孵育1h,荧光显 微镜下观察. ABC法:选用美国Veetcxhes 公司生产的VectastainABC试剂盒.标 本经5%健康羊血清封闭30mar..一抗 孵育2h(同荧光法).用新鲜配制的 O01%过氧化氢和0.05%二氨基联苯胺 显色30n后显微镜下观察 上述两种染色方法实验过程均在室 温下进行.对照组略去一抗,均未见阳 性染色. 二,结果 1单离VGC培养结果:单离小鼠 VGC接种后24h,在倒置相差显微镜下 观察大部分细胞贴壁,72h后细胞有明 显的突起长出,胞体呈圆形或椭圆形,双 折射现象明显;突起较细而长,多数为双 极型.成纤维细胞在72it内增长迅速, 覆盖于培养皿底部,随着培养液中人血 清的浓度渐增其过度增长受到抑制,而 伴有神经突起的VGC生长更为浅,更 易于观察,培养1O一14d后神经突起不 再延长.培养至20d,VGC仍能保持良 好的形态,但细胞数量自14d后有渐减 的趋势.VGC存活天数为5—24d,平均 (?,下同)为(11.66?2.g8)d. 2.免疫组化染色结果:免疫荧光法 (图1)和ABC法(图2)结果显示抗NF- 200000抗体对VGC胞体和突起均呈阳 性染色,并且经染色后更易于观察神经 突起.神经突起长度为32.34—72.68 ,urn,平均为(59.77?8.82)n.VGC胞 体大小不均,直径约1O一25n.阳性染 色不因胞体太小不同而有明显差异,典 型VGC呈椭圆形或圆形,为双极型,还 发现少量多极型并经阳性染色而确认 (图2),神经细胞之间经突起相互连接 形成局部的神经网络(图1,2).非神经 细胞不着色,易与神经细胞相区别. 三,讨论 本实验的结果显示单离的VGC可 培养至?d以上,并且神经突起生长良 好.突起之间相互连接,形成神经网络, 因此,我们认为本实验已成功建立单离 及培养VGC技术.NF是神经细胞所特 有的细胞内蛋白,它们具有可被免疫细 胞化学染色标识的特性,因此,用抗神经 微丝抗体免疫组化染色,检测培养细胞 中的NF,可较容易证明其为神经细胞. 已报道,VGC内具有神经微丝蛋白【. 本实验结果表明,抗NF-~00000抗体对 培养的小鼠VGC胞体和突起均具有很 好的染色,可以证明它们的神经细胞特 性. (图1,2见插页第4o页) 参考文献 lIIaD,】,Deeheme口 ??0fdiffe~ntml—p0?in m?m0B?cm抽eulult~Rn R鹧.1994.652:.~,9-256 2}B6A.PsmsodRN日吐0m叫,哪ira. mmaov~etivityinv耐ihIi岫u珊of theadu].Irat.HearR器.1989.42203-209 (收稿:1999-01.28修回:1999-~-2S) (本文编辑:何膺远)