葛根素对脂肪细胞糖脂代谢作用研究

葛根素对脂肪细胞糖脂代谢作用研究 第22卷第4期哈尔滨商业大学(自然科学版)Vo1.22No.4 2006年8月 JournalofHarbinUniversityofCommerce(NaturalSciencesEdition)Aug.2006 葛根素对脂肪细胞糖脂代谢作用研究 赵瑛,周游,殷惠军,张颖 (1.哈尔滨商业大学博士后工作站,黑龙江哈尔滨150076; 2.中国中医科学院西苑医院,北京100091) 摘要:探讨葛根素对脂肪细胞糖,脂代谢的影响.建立3'13一L1脂肪细胞IR模型. 葡萄糖氧化酶法 测定葛根素处理48h后培养液中葡萄糖残存量,铜试剂显色法测定游离脂肪酸浓 度.与模型组比较, 葛根素高,低剂量组葡萄糖消耗量显着增加(P<0.05),游离脂肪酸水平呈现降低 趋势.葛根素明显 增加脂肪细胞的葡萄糖消耗,对TNF一0【诱导的脂肪分解无明显作用. 关键词:葛根素;3—L1脂肪细胞;胰岛素抵抗;糖脂代谢 中图分类号:R285文献标识码:A文章编号:1672—0946【2006)04—0005—03 Studies0neffectsofpuerarinonglucoseandlipidmetabolisminaaipocytes ZHAOYing,ZHOUYou,YINHui-jun,ZHANGYing (1.Postd~-talResearchInstituteMaterialMedical,HarbinUniversityCollll/lei,-ce,Harbin150076,China; 2XiyuanHospital,Ac蜘0fTraditionalChineseMedicineScience,Beijing103391,China) Abstract:Toobserveeffectsofpuerarinonglucoseandlipidmetabolisminadipocytes.This paperestablishestheinsulinresistancemodelof3T3一L1adipocytes.Theglucoseoxidase methodiSusedtomeasuretheresidualamountofglucoseintheculturemediumaftertreat. mentwithpuerarinfor48hours.andthefreefattyacidconcentrationiSmeasuredbycuprum reagentforvisualization.Comparingwithmodelgroup,theglucoseconsumptionofpuerarin highandlowgroupincreasedsignificantly(P<0.05),andthefreefattyacidleveltended todecrease.Puerarincansignificantlyincreacetheglucoseconsumptioninadipocytes,and havenotobviouseffectonfatdecompositionwhichiSinducedbyTNF—. Keywords:puearin;3T3一L1adipocyte;insulinresistance;glucoseandlipidmetabolism 葛根是中药的辛凉解药之一,具有升阳,解 肌,通络等作用.葛根素是从葛根中提取的有效成 分,根据对葛根素的研究报道,许多整体动物实验 和临床观察发现其不仅能够调节机体的糖代谢,也 能够调节脂代谢,同时对胰岛素抵抗(IR)有一定 的改善?.为进一步明确葛根素对糖,脂代谢的 影响,本文采用游离脂肪酸(FFA)诱导建立3T3一 L1脂肪细胞胰岛素抵抗细胞模型,以培养液中葡 萄糖消耗量和FFA浓度为指标观察葛根素对脂肪 细胞糖,脂代谢的影响. 收稿日期:2006—04—26. 作者简介:赵瑛(1960一),女,博士,教授,研究方向:中药药理 1 1.1药物与试剂 313一L1细胞株购自ATCC(AmericanType CultureCollection);IMDM培养基(GIBCOBRL Co.);优等胎牛血清(Fetalbovinesemm/FBS.Hy. cloneBRLCo.);1一甲基3一异丁基黄嘌呤(IMX, Sigma);地塞米松(南京第三制药厂);生物合成人 胰岛素注射液(丹麦诺和诺德公司,批号 PW52526);棕榈酸(北京化学试剂公司,批号 940902);C盐(Celite,Serva公司);牛血清白蛋白 哈尔滨商业大学(自然科学版)第22卷 (BSA,sigma分装);FFA测定试剂盒(南京建成生 物工程研究所);葛根素注射液(烟台鲁银药业,批 号0310211). 1.2仪器 超净工作台(北京昌平长城空气净化公司), CO培养箱(TYPE4型,德国Heraeus公司生产), 倒置相差显微镜(Leica),离心机(Sigma3K30,Sig— ma公司),酶标仪(TECAN公司),光学显微镜(O— lympus). 2方法 2.1313一L1前脂肪细胞诱导分化 待313一L1前脂肪细胞在瓶壁上铺满成单层 时(0d),立即去除普通培养液,换用含IMX 0.5mmol/L,地塞米松1trmol/L,胰岛素10g/mL 的诱导分化培养液J.48h后,撤去诱导化液,再 换用含胰岛素10g/mL的IMDM培养液培养,每 2,3d换液一次,根据细胞长势传代,到第9d, 90%以上的细胞分化为成熟的脂肪细胞,再换用普 通IMDM培养液,恢复3d,即可用于实验. 2.2313一L1脂肪细胞胰岛素抵抗模型的建立 诱导分化成熟的脂肪细胞,接种于6孔培养板 中J,待生长融合后,用浓度为10nmol/L葡萄糖/ 1%BSA/FFA/KRP缓冲液(KRP缓冲液:131.2 mmol/LNaCI,4.71mmol/LKCI,2.48mmol/L Na3PO4?12H2O,10mmol/LHepes,1.24mmol/L MgSO4?7H2O,2.47mmol/LCaCI2,pH值为7.2, 7.4.)洗涤3次,并用此液孵育,每孔2mL.对照组 用含10nmol/L葡萄糖/1%BSA/KRP缓冲液做同 样处理.孵育时间12h,根据细胞贴壁情况,每4h 换液一次,液体与原孔同.12h后,均用1mmol/L 丙酮酸1%BSA/KRP缓冲液洗3次,并用该液 孵育1h.然后用1%BSA/KRP缓冲液洗2次,并用 该液孵育1h.然后用D—hanks洗2次,换用无血 清IMDM培养液孵育2h.最后用D—hanks洗2 次,全部换用普通IMDM培养液孵育. 2.3葛根素对脂肪细胞葡萄糖消耗的影响 将IR模型细胞分组如下:对照组(contro1),模 型组(mode1),二甲双胍组(Met),葛根素高剂量组 (PueH)(1.5mg/mL),低剂量组(PueL)(0.75mg/ mL)及丙二醇组(PG),每组6个平行孔.各组加入 相应质量浓度药物,作用48h后取出培养液,1000 r/min离心5min,取上清液,葡萄糖氧化酶法测培 养液中葡萄糖残存量,以未接种细胞空白复孔的糖 含量均值为基础值,计算出各孔细胞葡萄糖消耗 量. 2.4葛根素对TNF—诱导脂解作用的研究 除对照组外,均用TNF—诱 细胞分组同前. 导脂解,TNF—培养液中终质量浓度5g/mL.各 药物组在培养基中,除加TNF—外,还分别加入 相应质量浓度药物作用.48h后吸取培养液,用铜 试剂显色法(试剂盒)检测培养液中FFA的质量浓 度. 2.5统计学处理 数据以x?S表示,多组比较用SPSS11.5软 件作方差分析,组间比较用g检验. 3结果 3.1葛根素对脂肪细胞葡萄糖消耗的影响 各组葡萄糖消耗量如表1.模型组与对照组比 较差异有显着意义(P<0.01),证实FFA可以减少 脂肪细胞对葡萄糖的消耗,诱导IR的发生,这与文 献报道相符.与模型组比较,葛根素高,低剂量 组均具有促进葡萄糖消耗作用,差异显着(P< 0.05).丙二醇与模型组比较无显着差异. 表1葛根素对脂肪细胞葡萄糖消耗的影响(x?) 与对照组比较,'P<0.05,一P<0.Ol;与模型组比较.'P <0.05.P<0.0l 3.2葛根素对TNF—诱导脂解作用的研究 各组游离脂肪酸浓度如表2.模型组与对照组 比较,差异显着(P<0.01);二甲双胍组与模型组 比较,差异显着(P<0.01);与模型组比较,葛根素 高,低剂量组数值显示出降低趋势,但无统计学意 义(P>0.05). 表2葛根素对脂肪细胞脂解作用的影响(x?) 与对照组比较,P<0.o5,一P<0.Ol;与模型组比较,P <0.0l 4讨论 本实验证实葛根素具有促进脂肪细胞葡萄糖 第4期赵瑛,等:葛根素对脂肪细胞糖脂代谢作用研究?7? (上接4页) 具有抗肿瘤活性,结合我国用青龙衣治疗某些肿瘤 疾病大多数是汤剂的现状,针对青龙衣多糖是否具 有抗肿瘤活性,以及在其多糖具有抗肿瘤基础上, 研究其多糖的抗肿瘤机制进行一次深入的研究,是 青龙衣作为抗瘤药物的开发研究的空白和重点. 参考文献: 刘薇,季宇彬.青龙衣毒性作用及体内抗肿瘤作用的实验 研究[J].哈尔滨商业大学:自然科学版,2004,20(1):4 一 l0. 季宇彬,汲晨锋,马宏图.青龙衣冷,热乙醇提取物对H22小 鼠肿瘤细胞膜生化功能影响的研究[J].中国中药杂志, 2005,30(7):53l一534. 徐巍.青龙衣的药用研究概述[J].中医药信息,2002,19 (6):l3一l4. 季宇彬,马宏图,杨波,等.青龙衣不同提取部位的抗肿瘤 作用研究[J].中草药,2004,35(10):l145一l147. ALKHAWAJA.StudiesontheantimicrobialactivityofJuglan~ regiaAm[J】.ChinMed,1997,25(12):175—180. XUSY.MethodologyinPharmacologicalExperimentonmedical [M].Beijing:People'sMedicalPublishingHouse,2002.97. 韦巍,李雪华.多糖的研究进展[J].国外医学:药学分册, 2005,32(3):179,184. YEKZ,LIBN,WANGKL,eta1.ExtractionandSeparation ofPolysaccharide[J].Guan~ouFoodScienceandTechnole- gY,2004,20(3):144—145. 叶振南,邵家坪,陆惠文.粗多糖的提取,分离及结构研究 [J].中国药事,2000,14(5):329—332. [10]陆国栓,吴小蓉.黑豆皮色素的提取及其理化性质研究[J]. 中国粮油,1997(3):53—58. [11]吴寿金,赵泰,秦永琪.现代中草药成分化学[M].北京: 中国医药科技出版社,2002.214—217. [12]谭仁祥.植物成分分析[M].北京:科学出版社,2002.87— 89. 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