黑莓外植体褐化影响因素分析及适宜培养条件筛选

黑莓外植体褐化影响因素分析及适宜培养条件筛选 黑莓外植体褐化影响因素分析及适宜培养 条件筛选 植物资源与环境2009,18(3):63—68 JournalofPlantResourcesandEnvironment 黑莓外植体褐化影响因素分析及适宜培养条件筛选 王小敏,吴文龙,李海燕,于盱,李维林? [江苏省?中国科学院植物研究所(南京中山植物园),江苏南京210014] 摘要:以黑莓(Rubt~spp.)品种'Kiowa'为实验对象,研究了基本培养基类型,外植体类型,枝条暗处理时间,防褐化 剂以及光照度对组织培养中外植体褐化及腋芽诱导的影响.结果明,在供试的6种基本培养基(MS,1/2MS, B5,1/2B5,N6和1/2N6)中,在MS培养基上外植体的褐化率较低(37.78%),腋芽诱导率最高(67.89%)且生长 状况良好;褐化程度与外植体的木质化程度及取材部位均有一定的关系,以1年生半木质化枝条的上部茎段为外 植体,褐化率最低(19.67%),腋芽诱导率较高(91.89%)且生长状况良好;接种前进行一定时间的暗处理对外植体 褐化有一定的抑制作用,对枝条暗处理3d,防褐化效果最佳;在培养基中添加不同类型和浓度的防褐化剂对外植 体褐化和腋芽诱导也有一定的影响,以添加3000mg?L活性炭或200mg?L,V的防褐化效果较好;培养过程 中的光照度与外植体褐化也有一定的关系,在l500lx光照度下外植体的褐化率较低(15.66%)且腋芽诱导率和生 长状况均较好.根据实验结果,筛选出防止黑莓外植体褐化的适宜培养条件为:以1年生半木质化枝条的上部茎 段为外植体,l5?暗处理3d后,消毒并接种在添加了3000mg?L活性炭或200mg?LV的MS培养基(含20 g?L蔗糖,5.6g?L琼脂及0.2mg-L,6一BA,pH5.8)上,置于光照度1500lx的条件下 培养. 关键词:黑莓;组织培养;外植体;防褐化;腋芽诱导 中图分类号:Q943.1;$663.2文献标志码:A文章编号:1004—0978(2009)03—0063— 06 Analysisofinfluencefactorsonbrowningofblackberryexplantsandselectionofsuitableculture conditionWANGXiao.min,WUWen.1ong,LIHai—yan,YUXu,LIWei.1in? (InstituteofBotany, JiangsuProvinceandtheChineseAcademyofSciences,Nanjing210014,China),PlantResour.& Environ.2009,18(3):63—68 Abstract:Efleetsoffivefactorsincludingtypesofbasicmediumandexplant.branchdarktreatment time.anti.browningagentandilluminationintensitvonexplantbrowningandaxillarybudinducingwere investigatedusingblackberry(Rubusspp.)cultivar'Kiowa'asexperimentalobject.Theresultsshow thatonsixbasicmedia(MS,1/2MS,B5,1/2B5,N6and1/2N6),theexplantsinoculatedonMS mediumshowalowerbrowningrate(37.78%),thehighestinducingrateofaxillarybud(67.89%) andgoodgrowthstatus.Thebrowningdegreeofexplanthasacertainrelationshipwithlignificationdegree andsamplingpart.Thelowestbrowningrate(19.67%),higherinducingrateofaxillarybud(91.89%) andgoodgrowthstatusareobtainedusingtheupperstemsegmentofsemi— lignifieationbranchofoneyear oldasexplants.Darktreatingforacertaintimebeforeinoculatingcaninhibitthebrowningofexplants andtheanti.browningeffectofdarktreatingfor3disthebest.Differenttypesandconcentratio nsofanti— browningagentsaddedinmediahavesomeeffectsonexplantbrowningandaxillarybudindu cing.and theanti—browningeffectsofadding3000mg?L一activecarbonor200mg?L一 Varebetter. Certainly.thebrowningdegreeofexplantassociateswiththeilluminationintensityinculture process,and under1500lxilluminationcondition,thebrowningrateislower(15.66%)andtheinducingrat eand growthstatusofaxillarybudarebetter.Accordingtotheresults.thecultureconditionssuitable foranti. browningofblackberryexplantsareasfollows:usingtheupperstemsegmentofsemi— lignificationbranch ofoneyearoldasexplants.treatingthemindarkconditionfor3dwith15?.theninoculatingon MS 收稿日期:2008—07—04 基金项目:国家科学技术部农业科技成果转化资金项目(2007GB2C100118);江苏 省农业高技术项目(BG2007311);江苏省科技基础设施建 划(BM2008101) 作者简介:王小敏(1980一),女,山东苍山人,硕士,研究实习员,主要从事植物栽培与 生物技术研究. ?通信作者E-mail:1wlcnbg@mail.cnbg.net 植物资源与环境第18卷 mediumadded3000mg?L,activecarbonor200mg-L,Vc(containing20g?L, sucrose,5.6 g?L,agarand0.2mg?L6.BA,pH5.8),under1500lxilluminationconditionforculture. Keywords:blackberry(Rubusspp.);tissueculture;explant;anti— browning;axillarybudinducing 黑莓(Rubusspp.)果实含有丰富的营养成分,是 近年来兴起的第三代水果之一L1J.黑莓是一种生 态效益及经济效益均较好的多年生果树,具有广阔 的发展前景J,但目前生产上仍主要采用压条及 扦插等传统方法进行繁殖,繁殖系数低,速度慢.对 黑莓进行组织培养,可在短期内获得大量的优质种 苗.迄今为止,国内外学者已经对黑莓组织培养技 术进行了一些研究,并取得了一定的研究进展, 但在组织培养过程中黑莓容易出现褐化现象, 特别是初代培养时外植体褐化率较高.褐化现象不仅影响黑莓外植体与继代植株的正常生长与分化增 殖,而且还影响愈伤组织的诱导,进而影响组培效率 和组培苗的质量. 作者对黑莓组织培养中与外植体褐化有关的基 本培养基类型,外植体类型,枝条暗处理时间,防褐 化剂种类及浓度以及光照度等影响因子进行了研 究,以期摸索出防止外植体褐化的培养条件,为黑莓 优良品种的推广及种质离体保存提供实验基础. 1材料和方法 1.1材料 供试外植体取自江苏省?中国科学院植物研究 所苗圃,为黑莓品种'Kiowa'的带腋芽茎段及叶片. 1.2方法 1.2.1外植体灭菌于2007年4月采集'Kiowa' 的带腋芽茎段和叶片,洗衣粉液浸泡10min后流水 冲洗1—2h,在超净工作台上用体积分数70%的乙 醇消毒30S,再用质量体积分数0.1%HgC1,溶液处 理5min,最后用无菌水冲洗3,5次.将消毒后的 外植体修剪至长度约1.5cm后分别接种到相应的 培养基中. 1.2.2基本培养基的比较实验选择MS,1/2MS, B5,1/2B5,N6和1/2N6为基本培养基,均添加20 g?L蔗糖,5.6g?L琼脂及0.2mg?L,6一 BA,pH5.8.以1年生未木质化的'Kiowa'带腋芽 茎段为外植体,按上述方法消毒后分别接种到各培 养基上,每处理15个外植体,均重复3次.于温度 (25?2)?,光照时间14h?d,,光照度1500lx, 空气相对湿度约70%的条件下培养10d,统计外植 体的褐化率,褐化级别,腋芽诱导率以及腋芽的生长 状况. 1.2.3外植体类型的比较实验以'Kiowa'的1 年生未木质化枝条茎段,1年生半木质化枝条的上 部茎段和中部茎段,2年生结果枝条的未木质化茎 段以及1年生枝条上的幼嫩叶片为外植体,取材时 各茎段均有1个腋芽;按上述方法消毒后分别接种 在添加了20g?L蔗糖,5.6g?L琼脂和0.2 mg?L一6一BA的Ms培养基(pH5.8)上,每处理 接种15个外植体,均重复3次.于温度(254- 2)?,光照时间14h?d,,光照度1500Ix,空气相 对湿度约70%的条件下培养10d后,统计外植体的 褐化率,褐化级别,腋芽诱导率以及腋芽的生长状 况. 1.2.4枝条暗处理时间的比较实验以'Kiowa' 的1年生半木质化上部枝条为实验材料,取其中的 50%,剪去底部较大叶片后置于培养箱内暗处理,温 度保持l5?,分别于3,5和8d后各取一批枝条, 按上述方法消毒后接种;另50%枝条修剪消毒后直 接接种(对照组);每处理15个外植体,均重复 3次.所用培养基均为添加了20g?L蔗糖,5.6 g?L琼脂和0.2mg?L,6一BA的MS培养基 (pH5.8).于温度(25?2)?,光照时间14 h?d一,光照度1500Ix,空气相对湿度约70%的条 件下培养,并分别于接种后1,3,5,7和10d观察记 录外植体的褐化状况. 1.2.5防褐化剂的比较实验在含20g?L蔗 糖,5.6g-L一琼脂和0.2mg?L,6一BA的MS培 养基(pH5.8)中,分别添加不同浓度的聚乙烯吡咯 烷酮(PVP),活性炭(AC),硫代硫酸钠(NaS:0,)和 抗坏血酸(V),其中,PVP浓度分别为300,500和 1000mg?L,;AC浓度分别为1000,3000和 5000mg?L,;NaS03浓度分别为200,500和800 mg?L,;V浓度分别为100,150和200mg?L,. 以'Kiowa'的1年生半木质化枝条的上部茎段为外 第3期王小敏等:黑莓外植体褐化影响因素分析及适宜培养条件筛选65 植体,按上述方法消毒后分别接种到各培养基上,每 处理接种15个外植体,均重复3次.于温度(25? 2)oC,光照时间14h?d,,光照度1500lx,空气相 对湿度约70%的条件下培养10d后,观察统计外植 体的褐化率,褐化级别,腋芽诱导率以及腋芽的生长 状况. 1.2.6光照度的比较实验以'Kiowa'的1年生 半木质化枝条的上部茎段为外植体,按上述方法消 毒后接种到含有20g?L蔗糖,5.6g?L琼脂和 0.2mg?L,6一BA的MS培养基(pH5.8)上;分 别置于光照度1000,1500,2000和2500lx,光照 时间14h?d,,温度(25?2)oC,空气相对湿度约 70%的条件下培养,10d后观察统计外植体的褐化 率,褐化级别,腋芽诱导率以及腋芽的生长状况.每 处理接种15个外植体,均重复3次. 1.3数据处理 采用SPSS11.0软件对数据进行统计和差异显 着性分析.褐化率和腋芽诱导率的计算公式分别 为:褐化率=(褐化的外植体数/接种外植体数)X 100%;腋芽诱导率=(萌发腋芽的外植体数/成活 的外植体数)×100%.根据褐化程度的不同将褐 化级别划分为6个等级:1级为轻微褐化;2级为较 轻褐化;3级为中等褐化;4级为较深褐化;5级为重 度褐化;6级为褐化致死. 2结果和分析 2.1基本培养基类型对黑莓外植体褐化和腋芽诱 导的影响 不同类型基本培养基对黑莓组织培养过程中外 植体褐化及腋芽诱导率的影响差异较大(表1).在 供试的6种基本培养基中,采用1/2MS培养基,外 植体的褐化级别最低,平均值仅为2.07,褐化率只 有28.67%;采用N6培养基,褐化级别最高,达到 5.20,褐化率高达88.33%.采用MS培养基,腋芽 生长状况最好,腋芽诱导率也最高,达到89.33%; 采用1/2MS培养基,腋芽生长状况及腋芽诱导率仅 次于MS培养基;1/2N6培养基的腋芽诱导率最低, 仅为13.33%,腋芽生长状况也最差. 由表1还可以看出,在MS,B5,N6培养基上,外 植体的褐化率和腋芽诱导率均比各自的1/2培养基 高.褐化率差异最大的是B5和1/2B5培养基,前 者的褐化率是后者的1.47倍;差异最小的是MS和 1/2MS培养基,前者的褐化率是后者的1.32倍. 腋芽诱导率差异最大的是N6和1/2N6培养基,前 者是后者的2.08倍;差异最小的是MS和1/2MS 培养基,前者是后者的1.32倍.在6种培养基中, 虽然在1/2MS培养基中外植体的褐化率最低,但其 腋芽诱导率却较MS培养基低21.44百分点,且腋 芽的生长状况也比在MS培养基中差.因而,综合 外植体褐化率及腋芽诱导率2个指标的测定结果, 选择MS培养基为黑莓品种'Kiowa'外植体初代培 养的最佳基本培养基. 表1基本培养基类型对黑莓品种'Kiowa'外植体褐化和腋芽诱导 状况的影响' Table1EffectofbasicmediumtypesOilbrowningandaxillary budinducingstatusofblackberry(Rubusspp.)cultivar'Kiowa' explantsJ 'ABR:平均褐化率Averagebrowningrate;ABG:平均褐化级别 Averagebrowninggrade;AIA:平均腋芽诱导率Averageinducing rateofaxillarybud;GS:腋芽生长状况Growthstatusofaxillary bud.表中所有数据均为3次重复的平均值Alldatumsinthe tablearetheaverageofthreereplications;同列中不同的字母表示 差异显着(P<0.05)Thedifferentlettersinthesamecolumn indicatethesignificantdifference(P<0.05). 2.2外植体类型对黑莓外植体褐化和腋芽诱导的 影响 外植体的取材部位及木质化程度与黑莓外植体 的褐化及腋芽诱导状况有明显关系(表2).以 'Kiowa'1年生半木质化枝条中部茎段为外植体, 褐化级别最高(4.60),褐化率也最高,达89.33%; 以1年生半木质化枝条的上部茎段为外植体,褐化 率最低,仅为19.67%,褐化级别也最低;以1年生 未木质化枝条茎段和2年生结果枝条的未木质化茎 段为外植体,褐化率相差不大,仅差0.94百分点,但 前者的褐化级别较后者高0.80;以1年生枝条上的 幼嫩叶片为外植体,褐化率达56.33%,褐化级别达 3.82. 腋芽诱导率最高的是1年生未木质化枝条茎 段,其次为1年生半木质化枝条上部茎段,腋芽诱导 ,二者的腋芽诱导率仅相差2.24 率均达到90%以上 植物资源与环境第18卷 百分点;1年生半木质化枝条中部茎段的腋芽诱导 率最低,仅为28.67%.从腋芽的生长状况看,以1 年生未木质化枝条茎段和1年生半木质化枝条上部 茎段作为外植体,腋芽的生长状况均较好. 综合考虑褐化状况和腋芽诱导状况,在黑莓品 种'Kiowa'的初代培养中应选择1年生半木质化枝 条上部茎段为外植体. 表2外植体类型对黑莓品种'Kiowa'外植体褐化及腋芽诱导状况的影响) Table2Effectofexpla~typesonbrowningandaxillarybudinducingstatusofblackberry(Rub usspp.)culfivar'Kiowa'explants 表中所有数据均为3次重复的平均值Alldatumsinthetablearetheaverageofthreereplications;同列中不同的字母表示差异显着(P(0.o5) Thedifferentlettersinthesamecolumnindicatethesignificantdifference(P<0.05). 2.3枝条暗处理时间对黑莓外植体褐化的影响 在消毒接种前对黑莓品种'Kiowa'1年生半木 质化上部枝条进行暗处理,均可降低外植体的褐化 率,但随培养时间的延长,外植体褐化率均持续增加 (表3).与对照相比,接种前对枝条进行暗处理均 可降低外植体褐化率,且暗处理时间不同褐化率也 不同.3个暗处理组外植体的褐化率在培养第1天 差别不大;暗处理3和5d的外植体在接种后5d内 褐化率差别不大,且均低于暗处理8d的外植体;培 养5d后,按外植体褐化率从小到大对各处理组进行 排序,依次为暗处理3d,暗处理5d,暗处理8d,对 照. 表3暗处理时间对黑莓品种'Kiowa'外植体褐化率的影响) Table3Effectofdarktreatmenttimeonbrowningrateofblack- berry(Rubusspp.)cuitivar'IOowa'explants' 暗处理不同培养时间外植体的褐化率/% 时间/dBrowningrateofexplantatdifferentculturetimes Dark treatmenttime1d3d5d7d10d 33.23de6.67d11.11bcl4.33b19.56a 52.33e6.14dl1.68Cl6.11b25.89a 85.42e10.45d19.32c28.67b43.15a 0(CK)11.22e18.78d26.22e37.11b48.33a 表中所有数据均为3次重复的平均值Alldatumsinthetableare theaverageofthreereplications;同行中不同的字母表示差异显着 (P<0.05)ThedifferentlettersinthesameCOWindicatethe significantdifference(P<0.05). 暗处理8d的外植体褐化率从光照培养3d后 开始增加,培养10d时褐化率已接近对照组.另外 还观察到,暗培养时间长的枝条,随接种后光照培养 时间的延长,外植体的污染率也呈递增趋势,以暗培 养3d的外植体污染率最低.因此,经过综合比较后 确定,黑莓品种'Kiowa'枝条暗处理的最佳培养时间 是3d. 2.4防褐化剂对黑莓外植体褐化和腋芽诱导的影 响 在培养基中添加一定浓度的防褐化剂对黑莓外 植体的褐变有一定程度的抑制作用(表4).以活性 炭(AC)和V作为防褐化剂,外植体的褐化率随其 添加量的增加而降低;以聚乙烯吡咯烷酮(PVP)作 为防褐化剂,当浓度为500mg?L时外植体的褐化 率最低,随其浓度的增加褐化率有所增加;而以 NaS0作为防褐化剂,随其浓度的增加,黑莓外植 体的褐化率也不断增加.添加AC作为防褐化剂,外 植体褐化级别最低;添加V.和PVP作为防褐化剂, 外植体的褐化级别也较对照组低;而以N%SO,为防 褐化剂,褐化级别最高. 虽然PVP浓度为500mg?L时外植体的褐化 率最低,但腋芽诱导率不高,且腋芽生长状况也较 差.当Ac浓度为5000mg-L时,外植体的褐化 率较3000mg?LAC处理组仅低2.56百分点,但 第3期王小敏等:黑莓外植体褐化影响因素分析及适宜培养条件筛选67 其腋芽诱导率却比后者低22.22百分点,且后者的 褐化级别仅为2.11.V浓度为200mg?L时,外 植体的褐化率最低,比150mg?LV处理组低 9.45百分点,而腋芽的诱导率比后者仅低1.45百分 点,且其褐化级别仅为1.98.以NaS0为防褐化 剂,腋芽的诱导状况最差,浓度为200mg?L时腋 芽的诱导率最高,但也仅为16.11%;浓度为800 mg?L时,腋芽的诱导率降至最低,仅为3.49%. 研究结果显示,在添加了V的培养基上外植体的腋 芽生长状况最好,腋芽诱导率也较高;在添加了AC 的培养基上外植体的腋芽生长状况也较好. 综合上述结果后认为,在进行黑莓品种'Kiowa' 的组织培养时,在培养基中添加3000mg?LAC 或200mg?LV可保持适宜的腋芽诱导率并能有 效防止外植体褐化. 表4防褐化剂对黑莓品种'Kiowa'外植体褐化及腋芽诱导状况的 影响) Table4Effectofanti—browningagen~onbrowningandaxillary budinducingstatusofblackberry(Rubusspp.)cultivar'Kiowa explantsl ABR:平均褐化率Averagebrowningrate;ABG:平均褐化级别 Averagebrowninggrade;AIA:平均腋芽诱导率Averageinducing rateofaxillarybud;GS:腋芽生长状况Growthstatusofaxillary bud.表中所有数据均为3次重复的平均值Alldatumsinthetable aretheaverageofthreereplications;同列中不同的字母表示差异 显着(P<0.05)Thedifferentlettersinthesamecolumnindicatethe significantdifference(P<0.05). 2.5光照度对黑莓外植体褐化和腋芽诱导的影响 在组织培养过程中,光照度对黑莓外植体褐化 状况及腋芽诱导率均有较大的影响(表5).随着光 照度的增加,外植体的褐化率逐渐升高,褐化级别也 逐渐提高;光照度为2500lx时,外植体的褐化率最 高,达到55.51%,褐化级别也最高,为4.11.较弱 (1000lx)或较强(2500lx)的光照度均不利于腋芽 的诱导和生长.尽管在光照度1000lx条件下,外植 体的褐化率最低,但其腋芽诱导率也较低;而当光照 度为1500lx时,外植体的褐化率和褐化级别仅次于 1000lx处理组,腋芽诱导率却最高,腋芽的生长状 况也最好. 对外植体的褐化状况和腋芽诱导状况进行综合 分析后认为,黑莓品种'Kiowa'初代培养时最适宜的 光照度为1500lx. 表5光照度对黑莓品种'Kiowa'外植体褐化及腋芽诱导状况的影 响) Table5Effectofilluminationintensityonbrowningandaxillary budinducingstatusofblackberry(Rubusspp.)cnitivar'Kiowa explants1) ABR:平均褐化率Averagebrowningrate;ABG:平均褐化级别 Averagebrowninggrade;AIA:平均腋芽诱导率Averageinducing rateofaxillarybud;GS:腋芽生长状况Growthstatusofaxillary bud.表中所有数据均为3次重复的平均值Alldatumsinthetable aretheaverageofthreereplications;同列中不同的字母表示差异 显着(P<0.05)Thedifferentlettersinthesamecolumnindicatethe significantdifference(P<0.05). 3讨论和结论 植物褐化是指离体繁殖过程中培养材料向培养 基中释放褐色物质,使培养基逐渐变褐,培养材料也 随之变褐死亡的现象??.在果树尤其是木本果树 的组织培养过程中,比较容易出现外植体或培养物 的褐化,枯死现象.由于各种因素的影响,黑莓 外植体在组织培养过程中也极易出现褐化现象. 培养过程中过高的无机盐浓度能引起某些植物 外植体中酚类物质的氧化,从而产生褐化现象. 因此,在MS,B5和N6三种基本培养基上黑莓外植 体的褐化率均高于各自的1/2培养基.由于MS培 养基的总盐浓度相对低于B5和N6培养基,因此,使 用MS基本培养基可减轻黑莓外植体的褐化. 取材部位及木质化程度对培养过程中黑莓外植 体的褐变有重要影响.研究结果显示,2年生结果枝 条未木质化茎段的褐化率高于1年生枝条上的幼嫩 叶片,而后者的褐化率又高于1年生枝条,导致这种 68植物资源与环境第l8卷 现象的原因可能是生长部位和生理状态不同的外植 体中酚类物质的含量及多酚氧化酶(PPO)的活性有 一 定差异?.选择处于旺盛生长状态的1年生半 木质化枝条的上部茎段作为外植体,可大大减轻黑 莓外植体的褐化程度,降低褐化率. 在培养前对材料进行一定时间的暗处理可使黑 莓外植体的褐化率有所降低,但随接种后培养时间 的延长,褐化级别也随之增加.这可能是因为暗培 养只是暂时降低了多酚氧化酶的活性,减缓了酚类 化合物的合成,一旦恢复正常培养,多酚氧化酶的活 性又会有所提高?.暗培养超过5d,培养材料的 生活力降低,木质化程度加深,进而导致外植体褐化 率升高.此外,长时间的暗培养也会使培养材料滋 生大量细菌,导致外植体污染率增加.因此,黑莓枝 条暗处理的最佳时问是3d. 聚乙烯吡咯烷酮(PVP)对外植体褐化有一定的 抑制作用,但是对腋芽的生长却十分不利,可能是由 于PVP有一定的毒害作用,在一定程度上影响了腋 芽的正常生长.活性炭(AC)可有效抑制黑莓外植 体的褐化,可能是因为活性炭有较强的吸附能力,对 外植体产生的褐色物质有一定的吸附作用,从而有 效抑制了外植体褐化,但AC同时也吸附了培养基中 的营养物质,导致培养材料营养缺失,因此在添加 AC作为防褐化剂的培养基中,蔗糖和激素等的浓度 应适当提高.在培养基中加入V也可有效防止培 养材料褐变,这是因为V为多羟基还原物质,既可 以使PPO失活,阻止酚类物质氧化,又能在酶的催化 下消耗溶解氧,使酚类物质因缺氧而无法氧化?. Na:S:O对外植体的褐化没有显着的抑制作用,反而 影响腋芽的产生,可能是NaSO,自身对植物细胞有 一 定的毒害作用所致.因此,在培养基中添加一定 浓度的AC或V可以有效防止黑莓外植体的褐化. 培养过程中,低光照度(1000lx)可有效抑制黑 莓外植体褐化,但不利于腋芽萌发;较强的光照度 (2500Ix)虽可增加腋芽诱导率但也提高了PPO活 性,催化更多的酚类物质氧化形成醌,从而使外植体 褐化程度增加.因此,在黑莓组织培养初期,光照度 应设定为1500lx,有利于降低外植体的褐化. 综上所述,黑莓品种'Kiowa'组织培养的最佳条 件为:以1年生半木质化枝条的上部茎段为外植体, 接种前枝条在培养箱内(15?)暗处理3d,然后经 过消毒,修剪后接种到添加了3000mg?LAC或 200mg?L—Vc的MS培养基(含20g?L蔗糖, 5.6g?L一琼脂及0.2mg?L一.6一BA,pH5.8)上, 并置于光照度1500lx的培养室内培养. 参考文献: [1]吴文龙,顾姻.新经济植物黑莓的引种[J].植物资源与环 境,1994,3(3):45—48. [2]吴文龙,李维林,闾连飞,等.不同品种黑莓鲜果营养成分的 比较[J].植物资源与环境,2007,16(1):58—61. [3]徐玉秀,王友升,王贵禧.树莓的利用研究及其在我国的发展 前景[J].经济林研究,2003,21(1):64—66. [4]李维林,孙醉君,吴文龙,等.江苏省黑莓区域性栽培试验 [J].植物资源与环境,2003,12(1):38—42. [5]徐桂娟,罗晓芳,姚洪军.黑树莓的组织培养与快速繁殖[J]. 北京林业大学,2002,24(1):99—100. [6]蒋桂华,吴延军,谢呜,等.树莓,黑莓组织培养及遗传转化 研究进展[J].果树,2006,23(4):593—598. [7jPopescuAN,IsacV.Highfrequencyshootregenerationfromleaf- derivedcallusinraspberry(RubusL.)[J].Aeta Horticuhurae,2000,538(2):667—670. 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