明串珠菌乙醛脱氢酶基因失活研究.doc

明串珠菌乙醛脱氢酶基因失活研究.doc 明串珠菌乙醛脱氢酶基因失活研究 第一章 绪论 1-1明串珠菌概述 明串珠菌是一类进行异型乳酸发酵、耐氧的革兰氏阳性细菌，是韩国泡菜的优势菌种，能够保持泡菜质量[1]。明串珠菌能够代谢产生乳酸、乙酸、乙醇、双乙酰、甘露醇、葡聚糖、乙偶姻等芳香化合物。它生长范围较为宽泛，主要存在于植物的表面和根部。明串珠菌的最适生长温度为 20-30 °C，耐酸性强，生长最适 pH 为 5.5-6.2，在 pH≤5 的环境中可以生长，而在中性或初始碱性条件下生长较缓慢[2]。细胞呈椭球或者豆状，菌落常成对和短链出现，少数呈长链排列，直径通常小于 1.0 mm，光滑、圆型、灰白色，不运动，不形成芽孢。明串珠菌的生长通常需要复合生长因子和氨基酸，需要烟酸、硫胺素和生物素，而不需要钴胺素和对-氨基苯甲酸。明串珠菌通常为接触酶过氧化氢酶)阴性，不发酵多糖和醇类甘露醇除外)，无细胞色素，不水解精氨酸，很少酸化和凝固牛奶，不产吲哚，不水解蛋白，不还原硝酸盐，不溶血。明串珠菌对 2000 ppm 万古霉素有抗性。明串珠菌也具有一定的益生特性。明串珠菌Leuconostoc)归属于厚壁菌门Firmicutes)，芽孢杆菌纲Bacilli)，乳杆菌目Lactobacillales)，明串珠菌科Leuconostocaceae)[3]。到目前为止，NCBI数据库所认可的明串珠菌属包括肠膜明串珠菌L.mesenteroides)、肉明串珠菌L.carnusum)、冷明串珠菌L.gelidum)、欺诈明串珠菌L.fallax)、阿根廷明串珠菌 L.argentinum )、 嗜 柠 檬 酸 明 串 珠 菌 L.citreum )、 假 肠 膜 明 串 珠 菌L.pseudomesenteroides)和乳酸明串珠菌L.lactic)等 13 个种;其中肠膜明串珠菌包括 3 个亚种，即肠膜明串珠菌肠膜亚种L. mesenteroides subsp. mesenteroides)、肠膜明串珠菌葡聚糖亚种L. mesenteroides subsp. dextranicum)和肠膜明串珠菌乳脂亚种L. mesenteroides subsp. cremoris)[4]。 1-2基因失活 基因失活是 20 世纪 80 年代发展起来的分子生物学技术，它通过重组载体 DNA 序列和靶细胞内染色体上同源 DNA 序列，利用 DNA 转化技术如电击转化、显微注射等将打靶载体导入受体细胞 中，将载体 DNA 定点整合入受体细胞基因组的某一确定位点上，或与靶细胞基因组上某一确定片段相置换，使受体细胞的某一特定基因失活，从而改变细胞的遗传特性[22]。借助基因失活可中止某一基因的表达，引入新基因及引入定点突变，既可以用突变基因或其它基因失活相应的正常基因，又可以用正常基因失活相应的突变基因。利用基因失活技术能够对细胞染色体进行精确的修饰和改造，而且经修饰和改造的基因能够随染色体 DNA 的复制而稳定复制、稳定遗传[23]。基因失活的基本步骤是:通过 PCR 技术扩增目的基因序列，在体外插入卡拉霉素、四环素、氯霉素等受体菌自身不具有的抗性标记，再将上述基因序列构建至一个环状载体上，用 DNA 转化技术将构建好的同源重组载体转化入受体细胞内，用抗性标记初步筛选阳性重组子或进行目的基因功能的失活检测，再通过 PCR、Southern 杂交等做进一步验证。为了更好地区别单交换与双交换造成的重组，通常使用两个抗性标记。在发生单交换时，阴性和阳性抗性标记都会整合至基因组，导致两种标记都不存在;而发生双交换时，第二次同源重组会导致基因回复至野生型或失活目的基因，基因组上只有阳性标记，因此这样的重组子可以通过正负筛选而鉴别出。 第二章 明串珠菌电击转化的优化 2-1 实验材料 明串珠菌是美国 FDA 认可的 GRAS 菌，不产内毒素，能分泌特异性胞外蛋白且不会降解蛋白活性[37]，所以在食品技术中，明串珠菌是很好的表达不同蛋白的候选菌。由于明串珠菌是革兰氏阳性菌，转化方法成为了限制明串珠菌更深一步研究的关键因素。目前，明串珠菌所用到的转化方法主要有细菌接合转移和电击转化，早期研究是利用接合质粒[38]进行的，如今由于电转化方法的易操作和转化效率高而被普遍采用。本实验选择了自杀型质粒载体失活法，此法的主要缺点是整合几率低，需要数千碱基的同源序列，且对受体菌的感受态效率要求较高。所以必须首先得到较高的电击转化率，才能为外源 DNA 进入明串珠菌提供保障。本文进行了明串珠菌的电击转化条件的优化工作，为深入研究明串珠菌奠定了基础。肠膜明串珠菌 CGMCC1.10327，本实验室保藏。pCW4(5.3 kb) 为韩国国立庆尚大学金正焕教授惠赠，是大肠杆菌-明串珠菌穿梭质粒。 2-2 实验方法 本文借助 pCW4 质粒来寻找明串珠菌电击转化的最优条件。pCW4 具有红霉素抗性，为大肠杆菌-明串珠菌穿梭质粒，保存于 E.coli DH5α 中。本文先从 DH5α 中提取pCW4，再将其通过电转化导入到明串珠菌中，计算转化效率，从而优化明串珠菌电击转化的条件，得到较高的转化效率才能为后续同源重组载体导入到明串珠菌中奠定基础。从大肠杆菌 DH5α 中提取 pCW4 的方法如下[40]。 1)取培养液 1.5 mL 于 2 mL 离心管中，10000 rpm 离心 1 min，去掉上清液，加入 100 μLGET 溶液，充分混匀后在室温下放置 5 min。 2)加入200 μL新配制的变性液，缓慢颠倒2-3次使之充分混匀，冰上放置5 min。 3)加入 150 μL 冰冷的乙酸钾溶液(pH 4.8)，颠倒数次混匀后，冰上放置 5 min。 4)用台式高速离心机，10000 rpm 离心 5 min，将上清液移入另一离心管中，并加入等体积异丙醇混匀，室温放置 5 min 后，12000 rpm 离心 5 min，弃去上清液。 5)沉淀用 70%乙醇洗一次，室温下自然干燥。 6)加入 20 μL 的 TE 使 DNA 充分溶解。pCW4 的浓度检测:质粒 DNAμg/mL)=OD260×50μg/mL)×稀释倍数[41]。 第三章 明串珠菌 ALDH 基因同源重组载体...... 21 31 实验材料.... 21 311 菌株与质粒 ....... 21 312 培养基....... 21 313 实验试剂 ....... 21 314 实验仪器 ....... 22 32 实验方法.... 22 33 实验结果.... 29 331 ALDH 基因的克隆.... 293 311 明串珠菌基因组 DNA 提取结果 ...... 29 3312 ALDH 基因的克隆....... 30 3313 阳性重组子的筛选 ....... 30 332 中间载体 pTA2ErmAM 的构建 .... 30 3321 ErmAM 基因的克隆 .... 30 3322 阳性重组子的筛选 ....... 30 333 基因失活载体的构建 .... 31 3331 LALDH 和 RALDH 基因的克隆.... 31 3332 质粒重组 ..... 32 34 讨论........ 32 35 小结........ 33 第四章 突变菌株生理生化特性的检测..... 35 41 突变菌株的筛选与鉴定 ...... 35 42 突变菌株发酵产物的检测....... 37 43 讨论........ 41 44 小结........ 43 第五章 结论..... 45 第四章 突变菌株生理生化特性的检测 4-1 突变菌株的筛选与鉴定 将同源重组载体通过电击转化导入到明串珠菌中，挑取平板上的单菌落，筛选红霉素抗性的菌株，并检验是否抗氨苄青霉素，从而获得抗红霉素而氨苄青霉素敏感的菌株发生双交换的菌株)，废弃双抗的菌株发生单交换的菌株)，再通过 PCR 进一步验证是否发生了同源重组，重组的方式是单交换还是双交换。只有发生了双交换的突变菌株 LeuALDH-才是目的菌株。同源重组时发生交换的方式有两种，一种是单交换，一种是双交换。在发生单交换时，阴性和阳性抗性标记都会整合至基因组;而发生双交换时，第二次同源重组会导致基因回复至野生型或失活目的基因。在前一种情况下，两种标记都不存在，也就是在两种抗生素中均能生存;在后一种情况下，基因组上只有阳性标记，因此这样的失活子可以通过正负筛选鉴别出。将电转化后复苏的菌液涂布在含有红霉素浓度为 5 μg/mL 的 MRS 固体平板中，同时取相同量的菌液涂布于含有不同氨苄青霉素浓度的 MRS 固体平板中，培养一定时间后观察平板上的菌落生长情况。 结论 本文首先以肠膜明串珠菌 CGMCC1.10327 为研究菌株，以大肠杆菌-明串珠菌穿梭质粒 pCW4 为载体，从细胞壁处理方式、电击参数、复苏时间等因素来优化明串珠菌电击转化的条件，得到较高的转化效率，为失活载体进入明串珠菌细胞奠定了基础;然后 ALDH 为失活的靶基因，以红霉素为抗性标记，选择 pTA2 为环状载体，构建了同源重组载体 pTA2-ErmAM-Aldh;最后同源重组载体通过电转化导入明串珠菌中，筛选出突变菌株 LeuALDH-，通过发酵检测其产葡聚糖、甘露醇、双乙酰、乳酸、乙酸、乙醇等的能力，从而进一步研究 LeuALDH-的代谢走向，为基因工程育种提供理论依据。现将实验过程中得到的主要结论分述如下。 1 本文以肠膜明串珠菌 CGMCC 1.10327 为研究菌株，以大肠杆菌-明串珠菌穿梭质粒 pCW4 为载体，用氨苄浓度 0.7 μg/mL 的 MRS 培养基培养明串珠菌至 OD600为0.5 左右，以 PBS 作缓冲液，收获制成感受态细胞，与 10 μLDNA 混合，在电场强度12 KV/cm、电阻 200 Ω、电容 25 μF 下电击转化，以含 80 mmol/L MgCl2的 MRS 培养基复苏培养 3 h，得到最高的转化效率为 1.75×105CFU/μg DNA。 2 本文以肠膜明串珠菌 CGMCC 1.10327 为研究菌株，ALDH 为失活的靶基因，选择 T 载体 pTA2 作为失活载体的主体部分，根据其带有的抗性基因，克隆了红霉素抗性基因以此构建了中间载体 pTA2-ErmAM，这样有利于后续筛选阳性重组子;本文又克隆了 R-Aldh、L-Aldh 作为失活载体的同源部分，在 R-Aldh、L-Aldh 两端分别设计合适的酶切位点，将两者分别连接到 pTA2-ErmAM 上，以此构建好了基因失活载体即 pTA2-ErmAM-Aldh。