急性冠状动脉综合征患者外周循环中性粒细胞髓过氧化物酶测定的临床意义

急性冠状动脉综合征患者外周循环中性粒细胞髓过氧化物酶测定的临床意义 急性冠状动脉综合征患者外周循环中性粒 细胞髓过氧化物酶测定的临床意义 第45卷第10期 2007年10月 山东大学(医学版) JOURNALOFSHANDONGUNIVERSITY(HEALTHSCIENCES) Vo1.45No.10 0ct.20D7 文章编号:1671—7554(2007)10一O996—04 急性冠状动脉综合征患者外周循环中性粒细胞髓 过氧化物酶测定的临床意义 王媛媛,黎莉,周风华,孟晓,钟明,张薇,张运 (教育部和卫生部心血管重构和功能研究重点实验室, 山东大学齐鲁医院心内科,济南250012) 摘要:目的探讨急性冠状动脉综合征(acutecoronarysyndrome,ACS)患者外周循环血中性粒细胞髓过氧 化物酶(myeloperoxidase,MPO)浓度的改变及其预测易损斑块的价值.方法91例行冠状动脉造影患者分为 4组,急性心肌梗塞(AMI)组19例,不稳定心绞痛(UAP)组30例,稳定心绞痛(SAP)组22例和对照组20例, 抽取股静脉血分别应用流式细胞技术检测MPO浓度和粒子增强散射比浊法测定高敏C反应蛋白(high.sen. sitivityC.reactiveprotein,hsCRP)水平;采用透射电镜观察中性粒细胞超微结构的变化.结果uAP组股静脉 血MPO门内百分数显着高于AMI组,SAP组和对照组(P均<0,05),AMI组股静脉血MPO平均荧光强度显 着低于UAP组,SAP组和对照组(P均<0.05);UAP组和AMI组与对照组和SAP 组相比,股静脉血hsCRP显 着增高(P均<0.05),而UAP组和AMI组,SAP组与对照组之间差异无统计学意 义;UAP组MPO门内百分数 和hsCRP在不稳定斑块明显高于稳定斑块(P均<0.05).电镜下观察对照组中性 粒细胞形态较为规则,胞 浆内含有大小,形状不一的不同电子密度颗粒,呈圆形或椭圆形,空泡较少;AMI患 者中性粒细胞颗粒明显减 少,空泡显着增多;UAP患者则显示中性粒细胞颗粒丰富,空泡少见.结论外周循环 血中MPO的含量不仅 能提示ACS易损斑块的存在,而且能反映病变的严重程度. 关键词:中性粒细胞;髓过氧化物酶;急性冠脉综合征;高敏C反应蛋白 中图分类号:R541.4文献标志码:A Clinicalsignificanceofneutrophilmyeloperoxidaseon peripheralcirculationinacutecoronarysyndrome WANGYuan-yuan,LILi,ZHOUFeng-hua,MENGXiao,ZHONGMing,ZHANGWei,ZHANGYun (KeyLabomtoryofCardiovascularRemodelingandFunctionResearch,ChineseMinistryof EducationandPublicHealth,DepartmentofCardiology,QiluHospitalof ShandongUniversity,Jinan250012,China) Abstract:ObjectiveTostudythechangesofperipheralvenousbloodconcentrationofmyelopemxidase(MPO) inpatientswithacutemyocardialinfarction(AMI),unstableanginapectoris(UAP)andstableanginapectoris(SAP). MethodsFor91patientssubjectedtocoronaryangiography,including19patientsintheAMIgroup,30intheUAP group,22intheSAPgroupand20inthecontrolgroup,theconcentrationsofMPOandhigh-sensitivityC-reactivepro- tein(hsCRP)inthefemoralveinweredetermined.Theultra.structureofleukocyteswasobservedbytransmissionelec. tronmirror.ResultsThein-gatepercentageofMPOinthefemoralveinWashigherintheUAPgroupthanintheAMI, theSAPandthecontrolgroups(P<0.05,respectively),andtherewerenodifferencesbetweenthelaterthreegroups. 基金项目:卫生部临床学科重点项目资助课(20044681);山东省自然科学基金资 助课题(Y2005c32);山东省科技攻关项目(2005GG4402020). 作者简介:王嫒嫒(1981一),硕士.主要从事动脉粥样硬化的综合防治研究. 通讯作者:黎莉,医学H『t,教授,博士生导师,主要从事冠心病的发病机制和电生理 的研究. 王媛媛,等.急性冠状动脉综合征患者外周循环中性粒细胞髓过氧化物酶测定的临 床意义997 TheaveragefluoescentintensityofMPOinthefemoralveinwasmoreweakenedintheAMIgroupthanintheUAP,the SAPandthecontrolgroups(P<0.05,respectively),andtherewerenodifferencesbetweenthelaterthreegroups. Comparedwiththecontrolgroup,concentrationsofhsCRPintheUAPandtheAMIgroupsweresignificantlyincreased, butnodifferenceexistedbetweentheUAPandtheAMIgroupsorbetweentheSAPandthecontrolgroups.IntheUAP group,patientswithtypeIIlesionsshowedahigherin— gatepercentageofMPO(P<0.05)andahigherconcentrationof hsCRP(P<0.05)thanthosewithtypeIlesion.Throughanelectronmirror,fewvacuoleswerefoundinthecytoplasm oftheneutrophilinthecontrolgroup,lessparticlesandmorevacuolesintheAMIgroup,andabundantparticlesand veryfewvacuolesintheUAPgroup.ConclusionDifferentchangesofMPObetweenpatientswithAMIandUAPcan notonlypredictACSbutalsoreflecttheseverityofinflammation. Keywords:Myeloperoxidase;Neutrophil;Acutecoronarysyndrome;Hi【gh— sensitivityC—reactiveprotein . 动脉粥样硬化斑块破裂和伴随血栓形成是急性 冠状动脉综合征(acutecoronarysyndrome,ACS)的主' 要病理基础和发病机制,研究证实,不稳定斑块局部 有大量的中性粒细胞和巨噬细胞的浸润以及炎症因 子的表达,因此,由中性粒细胞介导的炎症反应与易 损斑块的关系倍受重视.目前,中性粒细胞释放的 酶一髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)作为反映 中性粒细胞激活的指标受到关注…,本研究通过检 测ACS患者外周循环MPO门内百分数和平均荧光 强度的改变,旨在探讨MPO浓度的变化及其预测易 损斑块的价值. 1资料与方法 1.1研究对象选择2002年12月,2004年1月 于山东大学齐鲁医院心内科住院行冠状动脉造影患 者91例,人选者均排除急,慢性感染,肿瘤,近期手 术,创伤,慢性结缔组织病及其它影响炎症指标的疾 病,分为急性心肌梗死组(AMI组),稳定心绞痛组 (SAP组),不稳定心绞痛组(UAP组)和对照组.其 中,AMI组19例,男12例,女7例,平均年龄(58.25? 9.74)岁,均为sT段抬高型心肌梗死7,10d的患 者,冠脉造影示单支病变10例,两支病变7例,三支 病变2例,病变血管中1例为稳定斑块,18例为不 稳定斑块.SAP组22例,男10例,女12例,平均年 龄(58.73?7.81)岁,采用世界卫生组织的诊断标 准,劳力性心绞痛发作性质和程度稳定在1,3个月 内无改变者,冠脉造影示单支病变5例,两支病变9 例,三支病变8例,病变血管中13例为稳定斑块,9 例为不稳定斑块.UAP组30例,男18例,女12例, 平均年龄(6o.62?6.73)岁,除上述劳力性心绞痛以 外的缺血性心绞痛,冠脉造影示单支病变7例,两支 病变11例,三支病变12例,病变血管中5例为稳定 斑块,25例为不稳定斑块.对照组10例,男5例,女 5例,平均年龄(51.37?7.82)岁,冠状动脉造影均正 常.4组受检者年龄和性别匹配. 1.2方法按本研究室常规方法行冠状动脉造影 检查,各组受试者在冠状动脉造影时抽取股静脉血 10mL待测. 1.2.1冠状动脉病变分型冠状动脉造影结果由 两名有经验的医师完成,对狭窄程度>50%的 斑块进行形态学分型,进一步将偏心性的狭窄病变 分为二类,稳定斑块:基底部较宽,表面光滑的偏心 病变;不稳定斑块:基底部较窄呈尖角状的病变,有 龛影,表面凹凸不平或火山口样的病变. 1.2.2MPO和高敏c反应蛋白(hscRP)测定采用 全血溶血法检测粒细胞表型,应用流式细胞技术检测 中性粒细胞MPO,结果以MPO平均荧光强度及MPO 门内百分数表示;采用粒子增强散射比浊法在Behring Nephelometer100(BN100)特定蛋白分析仪上测定 hsCRP.MPO试剂盒由美国BECTON.DICKINSON公 司生产,hsCRP试剂盒由德国DateBehring公司生产. 1.2.3电镜检查中性粒细胞由肝素抗凝血4mL, 经淋巴细胞分离液分离后获取.加入3%的戊二醛 4?下固定4h,PBS冲洗10min×3,1%锇酸固定 1h,PBS冲洗10min×3,梯度乙醇脱水.丙酮逐级 脱水,环氧树脂812包埋,制成超薄切片,经醋酸双 氧铀,柠檬酸铅染色各30min,日本电子株式会社 JEM一1200EX型透射电镜观察. 1.3统计学处理采用SPSS11.0软件系统分析,所 有测量参数均以?s表示,不同组问计量资料比较 采用非配对t检验,P<0.05为差异有统计学意义. 2结果 2.1临床资料比较AMI组,UAP组和SAP组与对 照组相比,低密度脂蛋白胆固醇(LDL)均明显增高 998山东大学(医学版)45卷10期 [(3.63?0.73)mmol/LVS(2.62?0.57)mmol/L; (3.79?0.94)mmol/LVS(2.62?0.57)mmol/L; (3.55?0.49)mmol/LVS(2.62?0.57)mmol/L; P均<0.05],但3个冠心病亚组间差异无统计学意 义(P>0.05);各组患者临床用药情况亦无显着性 差异. 2.2冠状动脉病变的比较UAP组和SAP组冠状 动脉病变支数明显多于AMI组(P<0.05),UAP组 和SAP组冠状动脉病变支数差异无统计学意义. AMI组和UAP组的不稳定斑块发生率明显高于SAP 组(P<0.05),AMI组和UAP组之间差异无统计学 意义(P<0.05),见表1. 表1冠心病各组冠状动脉病变的比较(牙?s) -p<0.05vsSAP组和UAP组;?P<0.05VSSAP组 2.3股静脉血MPO和hsCRP的测值比较UAP组 的MPO门内百分数显着高于AMI组,SAP组和对照 组(P均<0.05),SAP组,AMI组与对照组比较差异 无统计学意义;MPO平均荧光强度AMI组显着低于 UAP组,SAP组和对照组(P均<0.05),UAP组,SAP 组和对照组比较差异无统计学意义.UAP组和AMI 组与对照组和SAP组相比,hsCRP显着增高(P均< 0.05):而UAP组和AMI组,SAP组与对照组之间差 异亦无统计学意义,见表2. 表2股静脉血MPO,hsCRP结果(?s) .P<0.05vsUAP组;<0.05VSAMI组 2.4UAP组冠状动脉病变与MPO,hsCRP,WBC,中 性粒细胞的关系UAP患者单支病变组,两支病变 组及多支病变组之间MPO门内百分数,hsCRP, WBC,中性粒细胞差异无统计学意义(P均>0.05); MPO门内百分数和hsCRP在不稳定斑块组明显高 于稳定斑块组(P均<0.05),见表3. 2.5电镜结果对照组中性粒细胞形态较为规则, 多为圆形,细胞表面有少量短而细的微绒毛,周边少 见伪足,核多分叶,胞质内含有大小,形状不一的不 同电子密度颗粒,嗜天青颗粒着色略深,体积较大, 电镜下呈圆形或椭圆形,电子密度高,胞质内空泡较 少(见图1);UAP患者则显示中性粒细胞内含有丰 富的颗粒,空泡少见(见图2);AMI患者中性粒细胞 内颗粒明显减少,空泡显着增多(见图3). 表3UAP组冠状动脉病变与MPO,hsCRP,WBC,中性粒细胞的关系(牙?s) -p<0.05VS稳定斑块 图1电镜下正常人中性粒细胞的形态学变化(×8000) Fig.1Neutrophilsexaminationbyanelectronmicroscopeinthe controlgroup(×8000) 图2电镜下UAP患者中性粒细胞的形态学变化(×6000) Fig.2Neutrophilsexaminationbyallelectronmicroscopeinthe UAPgroup(×6000) 王媛媛,等.急性冠状动脉综合征患者外周循环中性粒细胞髓过氧化物酶测定的临 床意义999 图3电镜下AMI患者中性粒细胞的形态学变化(X6000) Fig.3Neutrophi]sexaminationbyallelectronmicroscopeinthe AMIgroup(X6000) 3讨论 炎症反应在ACS发病中起关键作用,且与疾病 的预后密切相关,流行病学研究发现,hsCRP是预测 死亡的独立危险因素[2].但在UAP患者中,hsCRP 的结果差异很大.在hsCRP高于3mL人群中, 65%是UAP,其中95%可发生心肌梗死,另外有不 到50%的心肌梗死患者hsCfuP不增加,可见有约 30%的UAP患者hsCRP并不增加J,从而促使人 们努力寻找能反映易损斑块特点的敏感特异血清学 标记物. 研究表明,白细胞总数与冠状动脉事件发生的 危险性密切相关,且与冠心病的严重程度有关_5]. 但白细胞总数只能粗略反映白细胞的活性,中性粒 细胞和单核细胞膜表面的CDb/CD是由炎症诱导 而表达的,促进白细胞与内皮细胞黏附J.最近,测 定中性粒细胞所特有的酶一MPo被认为是一个较 好的反应中性粒细胞活性的指标J.中性粒细胞中 含有分泌MPO的嗜苯蓝颗粒,中性粒细胞被激活 后,可以脱颗粒而将MPO释放到细胞外,具有强力 的感染后特征,引起组织的损伤.因此,MPO有可 能成为反映斑块易损的生物标记物,对ACS的识别 提供信息. MPO活性的高低代表中性粒细胞的量,是中性 粒细胞的标志.其中,MPO门内百分数和平均荧光 强度含量的变化分别反映中性粒细胞激活的数量和 中性粒细胞内MPO位点的多少.本研究在UAP, SAP,AMI和对照组患者中,分别检测MPO平均荧光 强度及MPO门内百分数,并与传统的全身炎症性标 记物hs.CRP比对.结果显示,正常人血液中的中性 粒细胞仅60%75%MPO呈阳性反应,可能中性粒 细胞内MPO位点在正常情况下没有全部激活,大约 有30%40%处于休眠状态.UAP组的MPO门内 百分数显着高于ANII组,SAP组和对照组;AIVII组 IPO平均荧光强度显着低于UAP组,SAP组和对照 组,提示炎症反应时,中性粒细胞被激活,MPO从休 眠中恢复呈激活状态,或者是中性粒细胞激活以后, 为了应答炎症反应,细胞生产MPO能力及数量增 加,而发挥其生物学作用.而AMI时炎症反应较 UAP强,激活的中性粒细胞MPO过度释放,致使细 胞内含量迅速降低,直至耗竭,与标有荧光的MPO 抗体结合量显着减少.复习以往文献,MPO耗竭的 特征表现为中性粒细胞内出现空泡_8].电镜下观察 显示,AMI患者血液标本中性粒细胞内有大量的胞 浆空泡;对照组仅有少量空泡;UAP患者则显示粒细 胞内含有丰富的颗粒,空泡少见.证实炎症反映强 烈时中性粒细胞中的MPO耗竭.因此,MPO含量的 升高和降低可能反映炎症的不同严重程度,MPO降低 可能代表较为严重的炎症反应.本研究结果表明, UAP组和AMI组的hsCRP测值虽然升高,但两组之 间比较无差异,进一步证实hsCRP是一个全身炎症的 非特异标记物,不能作为炎症的病变程度的指标. 综上所述,检测冠心病患者外周静脉血中的 MPO含量不但能提示易损斑块的存在,同时也能反 映炎症的程度,在UAP患者中表现为MPO含量增 加,而在ANI患者中则表现为MPO含量明显减低, 其机制可能是MPO过度释放至耗竭.因此,MPO可 作为斑块不稳定的标志,并且优于hCRP,同时有可 能为ACS患者提供预后信息. 参考文献: [1jZhangR,BrennanML,FuX,eta1.Associationbetween myeloperoxidaselevelsandriskofcoronaryarterydisease [J].JAMA,2001,286(17):2154-2156. 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MSC的表面标志具有非单一性的特性,目前一 般认为CD29,CD44,CD105,CD166及SH2,SH3是 MSC的重要标志物.MSC表面不表达造血细胞表 面抗原,如造血前体细胞表面抗原CD34,白细胞表 面抗原CD45等,证明MSC为一群非造血类细胞. 本实验通过流式细胞术检测并鉴定了由克隆扩增出 的MSCs具有高度的同源性,可通过其表面抗原结 合细胞外基质,参与细胞——细胞之间或细胞—— 基质之间的相互作用,具有产生细胞外基质蛋白和 细胞因子的功能J.骨组织基质包括有机质和无机 质两种成分,无机质是骨盐(主要成分为羟基磷灰石 结晶),有机质包括骨胶原纤维和无定型的有机质, 骨胶原纤维蛋白主要是I型胶原,是钙盐沉着和细 胞附着的支架.参照国外有关文献],本实验配制 简单的成骨诱导液,经过茜素红染色染色发现MSCs 先后出现特征性的骨细胞标志,与国内外相关研究 类似. 端粒是真核细胞染色体末端的结构,细胞每分 裂一次,其端粒DNA序列就会丢失若干长度.当端 粒DNA序列缩短一定长度时细胞就会停止增殖,并 逐渐衰老,死亡.端粒酶能特异性地识别端粒引物 位点,并复制端粒添加到染色体末端,以补充由于细 胞分裂时端粒DNA的丢失,从而维持端粒长度.因 此,端粒酶活性间接反应了细胞增殖能力的强弱. 大多数正常体细胞通常无端粒酶的表达,而生殖细 胞,造血细胞和肿瘤细胞有较高的端粒酶活性.干 细胞的端粒酶活性与其所处的细胞周期密切相关. 处于静止期的细胞端粒酶活性低水平表达.在本实 验中,人骨髓MSCs的端粒酶活性呈阳性反应,但其 反应强度明显弱于作为对照的卵巢癌细胞的端粒酶 活性,这说明该细胞较幼稚,生命周期较长,不具有 恶性肿瘤的无限增殖能力.有报道骨髓MSCs在l2 代以内核型正常,且保持端粒酶活性],与本实验结 果相吻合. 本研究结果显示,人MSCs可通过抽取骨髓分 离获得,易培养扩增;经体外的诱导后具有明确的多 向分化的干细胞潜能.因此,人MSCs是目前较为 理想的组织工程种子细胞来源,具有良好的临床应 用前景. 参考文献: [1jTseHF,KwongYL,ChanJK,eta1.Angiogenesisinis chaemicmyocardiumbyintr~myocardialautolngousbonemar- lOWmononuclearcellimplantation[J].Lancet,2003,361 (9351):47-49. 12jKitzawaS,KitoaawaR.Epigeneticcontrolofmousereceptor activatorofNF-KappaBligandgeneexpression[J].Biochem BiophysResCoinmun,2002,293(1):126-131. 13jKottonDN,MaBY,CardosoWV,eta1.BoneHlarrow- derivedcellsasprogenitorsoflungalveolarepithelium[J]. 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