[doc] 口蹄疫病毒3D蛋白在T4噬菌体衣壳表面的展示

[doc] 口蹄疫病毒3D蛋白在T4噬菌体衣壳表面的展示 口蹄疫病毒3D蛋白在T4噬菌体衣壳表面 的展示 农业生物技术JournalofAgriculturalBiotechnology2008.16(2):190~195 口蹄疫病毒3D蛋白在T4噬菌体衣壳表面的展示木 ? 研究? 覃健萍,徐维加3陈峰,马静云,谢青梅-,姚兵华-,曹永长-料,毕英佐- (1.华南农业大学动物科学学院,广州510640;2.广东温氏食品集团有限公司,新兴527439; 3.云南出入境检验检疫局,昆明650228) 摘要:通过PCR技术获得3D基因,使用拼接重叠延伸聚合酶链反应对3D基因内部的EcoRI位点进行定点突变,将突 变后的3D基因克隆至原核表达质粒pSOC和T4噬菌体的穿梭质粒pR中,通过PCR及质粒酶切鉴定,分别获得阳性重组子 pSOC-3D和pR-3D.将含有3D基因的重组质粒pSOC-3D转化大肠杆菌(Eschenehiacoli)BL21进行表达,SDS.PAGE检测表 达产物.将含有3D基因的重组质粒pR-3D转化T4噬菌体的宿主菌E2,通过同源重组获得重组噬菌体T4.3D,经SDS.PAGE 及Westernblot检测,证明展示在T4噬菌体表面的3D融合蛋白能与口蹄疫病毒(FMDV)感染血清发生特异性反应. 关键词:口蹄疫病毒;非结构蛋白3D;T4噬菌体展示. 中图分类号:S188文献标识码:A文章编 号:l006.1304(2008)02-0190.06 DisplayofNonstructuralProtein3DofFoot-and-mouthdiseaseviruson CapsidSurfaceofT4Bacteriophage QJian-ping,XUWei-jia3,CHENFeng一,MAJing?yun,XIEQing-mei, YAOBing-hua,CAOYong-chang,BIYing-ZUO (1.AnhnalScienceCollege.SouthChinaAgriculturalUniversity,Guangzhou510642,China;2.Gu~gdongWen’sFoodstuffsGroup LimitedCompany,Xinxing527439,China;3.YunnanEntryExitInspectionandQua PCR.Themutated3DgenewasinsertedintothepSOCexpressionplasmidandtheT4bacteriophagerecombinantintegration plasmidspRtoobtaintherecombinantplasmidspSOC-3DandpR-3D.Therecombinantplasmidswereselectedandconfirmedby PCRscreeningandEcoRIrestrictionendonucleasedigestion.TheexpressionplasmidpSOC一3DwasusedtotransformEscherichia coliBL21andtheexpressionproductwasanalyzedbySDS—PAGE.Resultss howedthattherecombinantintegrationplasmidpR一3D WastransinfectedintoE.coliE2straintoobtaintherecombinantphagesT4— 3D,andtheproteinbandscouldbedetectedby SDS-PAGEandreactedspecificallytoserumfromFMDV—infectedanimal s. K盯w嘶I|:Foot-and—mouthdiseasevirus;nonstructuralprotein3D;T4bacteriophage display 口蹄疫(Foot—and.mouthdisease,FMD)是由口 蹄疫病毒(F0ot.and-mouthdiseasevirus,FMDV)感 染所引起的偶蹄动物共患的一种急性,热性和高度 接触睦传染病,患病动物的口,舌,唇,蹄和乳房等部 位发生水泡,破溃并形成烂斑,发病率几乎达 100%,对畜牧业生产和发展造成巨大的危害,被世 界动物卫生组织(0IE)列为A类家畜传染病之首. FMDV的3D蛋白又称病毒感染相关抗原 (VIAA),是基因组复制的产物之一,在FMDV不同 血清型和亚型中高度保守(Alonsoeta1.,1988).在非 结构蛋白中3D免疫原性最好,检测到3D抗体说明 该物质已接触过FMDV抗原(DeDiegoeta1.,1997; Bergmarmeta1.,2000),因此,在检测中具有广泛的 应用前景.一些学者(Villingereta1.,1989;Mackayet 基金项目:广东省重大科技专项(No.2004A2090102)资助. 通讯作者.Authorforcorrespondence.毕英佐,研究员,主要从事动物传染病和营养与免疫方面的研究,E—mail:<yzbi@scau.edu.cn>: 曹永长,博士,教授,主要从事动物分子病毒学与动物病毒免疫学研 究,E—mail:<caoych@mail.sysu.edu.ell>. 收稿日期:2007—05—10接收Et期:2007.09—03 第2期覃健萍等:口蹄疫病毒3D蛋白在T4噬菌体衣壳表面的展示!! a1..1998a,b)对融合表达的3D蛋白作为诊断抗原时 发现在ELISA中假阳性率非常高,也就是疫苗免疫 动物体内也存在3D抗体,所以3D蛋白在鉴别诊断 中的作用受到了很大的限制.Bergmanneta1.(2000) 对一组NSP2C,3A,3B,3ABC和3ABC进行研究 发现,除了2C蛋白外,其它几种NSP都可以 I-ELISA区别感染动物和免疫动物.为了对3D 进行进一步研究和应用,本实验通过T4噬菌体衣 壳表面展示系统表达3D蛋白,为建立口蹄疫3D蛋 白鉴别感染动物,免疫动物诊断ELISA方法和3D 蛋白结构和功能的研究提供基础资料. 1和方法 1.1质粒和菌种 重组质粒T.3D.L1由本实验室构建和保存. pSOC质粒,pR穿梭质粒和T4噬菌体,T4.z1(SOC 基因缺失的突变型T4噬菌体,为溶菌酶依赖性病 毒株)由美籍华人任兆钧博士惠赠,本实验室保存 (Caoeta1.,2005).大肠杆菌(Escheriachiacoli) BL-21(DE3),E2和DH5均由本实验室保存. 1.2主要试剂 ExTaqDNA聚合酶和E.Z.N.APlasmid MiniprepsKit购自大连宝生物工程公司;限制性内 切酶NdeI,EcoRI,小牛碱性磷酸酶(CL),T DNA连接酶及相应缓冲液均为TaKaRa产品;高保 真KODDNAPolymeraseT酶购自广州美津公司;豚 鼠FMD感染阳性血清和阴性血清由农业部兽医诊 断中心惠赠;山羊抗豚鼠IgG.HRP购自广州华美公 司. 1.3引物的与合成 根据pSOC质粒和pR穿梭质粒的克隆位点合 成引物T4.3D1/T4.3D2用于扩增3D基因片段,该 引物理论跨幅为1410bp,包含整个3D基因序列, 在上下游引物的5’端加上EcoRI酶切位点(下划 线)和保护碱基,在上游引物T4.3D1中加入碱基T 以维持正确的阅读框,在下游引物T4.3D25’端加 上终止密码(波纹线);另外根据T4噬菌体SOC基因 序列设计1条引物,用于检测目的基因插入pSOC 或pR质粒的方向;由于3D基因存在EcoRI酶切 位点,而表达质粒pSOC和噬菌体穿梭质粒pR只 能用EcoRI酶切位点插入外源基因,为了能够准确 把整个3D蛋白展示在T4噬菌体表面,必须将3D 基因EcoRI酶切位点(GAATTC)进行定点突变,为 此,合成1对引物对3D.DTB.UP/3D.DTB.DN;引 物序列如下文所示,委托上海博亚生物有限公司合 成,用高压后的去离子水配成50I~moFL. T4.3D15’-(jA玎cTGGGT’I’GATCGTCGACACCAGA-3 3D.rB.UP:5’-rrCAACCCTGAGrrCGGGCCTGCT-3’; 3D.DTB.DN:5’-AGCAGGCCCGAACTCAGC~T’I’GAA-3’. 1.43D基因的克隆 用T4.3D1/T4.3D2引物对从T.3D-L1重组质 粒上扩增3D基因片段,100LPCR反应体系的组 成为:10xbuffer10L,dNTPs6L,T-3D-L11L, T4.3D11L,T4.3D21L,ExqDNA聚合酶1 L,ddH2080ixL;PCR扩增反应在ExpressGradient PCR仪上进行.PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶(含 0.5~g/mL的溴化乙锭)电泳检测.用VilberLour- mat凝胶成像系统观察并记录结果. 1.5SOE.PGR对3D基因进行定点突变 使用拼接重叠延伸聚合酶链反应(splicingover- lapextensionpolymerasechainreaction,SOE-PCR) 对3D基因内部的EcoRI位点进行定点突变,即用 1对含有特定点突变互补引物3D.DTB-UP/3D . DTB.DN及相应的上,下游正常引物 T4.3D1/T4.3D2作2轮PCR,即可得到含所需点突 变的3D片段. 第一轮PCR反应:分别执行下列2个反应,反 应体系为100L.反应体系I:10xPCRbuffer10 L,dNTPs6L,MgSO44L,KODDNApoly- merase1L,T4.3D11L,3j)-DTB.DN1L,模板 (3D)0.5L,ddH2076.5L,扩增条件为:94?预变 性2min;94?变性15S,58?退火30S,68?延伸 2min,29个循环;72?延伸10min,扩增产物取名 为3D.1;反应体系II:10xPCRbuffer10L,dNTPs 6L,MgSO44L,KODDNApolymerase1L,3D - DTB-UP1L,T4.31721L,模板(3D)0.5L, ddH2076.5L,扩增条件与上述相同,扩增产物取 名为3D.2;PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检 测和纯化,以纯化的PCR产物3D.1和3D.2互为引 物(即含有所需点突变5’端重叠部分产物作为引 物),在高保真KODDNA聚合酶作用下,延伸合成 含有所需点突变的融合3D片段,反应体系为:lOx PCRbuffer10L,dNTPs6L,MgSO44L,KOD DNApolymerase1L,3D-DTB-UP1,3D - DTB-DN1L,3D-1PCR产物2L,3D.2PCR产 物2L,ddH2064L,扩增条件为:94?预变性3 min,然后94?变性1min,58?退火45S,68?延 伸2min,7个循环;72?延伸10min.再加入以下 农业生物技术2008年 组分:T4?3Dl1L,T4.3D21L,KODDNApoly- merase1L,dNTPs6L,扩增条件为:94?预变性 2min,然后94?变性15S,68~C2min,30个循环; 72?延伸l0min.PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶 电泳检测. 1.6pSOC.3D和pR.3D重组质粒的构建 将EcoRI消化的3D基因(经过定点突变后的 基因)与EcoRI消化pSOC或pR质粒连接,连接 好的质粒转化DH5a感受态细胞,转化子分别用 T4.3D1/T4.3/Y2和SOC.up/T4.3132两对引物进行 PCR筛选.用两种引物鉴定均为阳性的克隆即为有 3D片段且插入方向正确的转化子. 1.7pSOC.3D质粒在大肠埃希氏菌中的表达 用上述阳性重组质粒pSOC.3D转化E.coli BL.21(DE3),加入IPTG至终浓度1mmol/L诱导 表达,分别于诱导后1,2,3,4和5h取样检测表达 产物.12000r/min离心1min,细菌沉淀中加入100 LSDS.PAGE上样缓冲液,一8O?反复冻融3次. 取不含外源片段pSOC质粒菌液进行表达,诱导4h 后同样处理,作为对照. 1.8pR.3D质粒在T4噬菌体衣壳表面的展示 用上述阳性重组质粒pR.3D转化E.coliE2,与 溶菌酶依赖性病毒株T4一zl进行同样重组,在没有 溶菌酶的SC平板上筛选噬菌斑,将噬菌斑扩大培 养后使用T4.3D1/T4-3D2和SOC.up/T4.3D2两对 引物进行PCR筛选.取重组噬菌体T4.3D进行扩 大培养,悬液3500r/min离心25min去除残留的细 菌碎片.使用赛多利斯切向流(Vivaflow200)超滤系 统对离心后的重组噬菌体进行浓缩收集.过滤浓缩 后的噬菌体经过蔗糖梯度离心进行提纯,去除浓缩 液中残存的来自宿主菌或培养基中的非噬菌体物 质.将阳性重组噬菌体于一8O?反复冻融3次后进 行SDS.PAGE检测.取不含外源片段野生型T4噬 菌体作为对照. 1.93D表达产物的SDS.PAGE及Westenblot 用SDS.PAGE检测目的蛋白的表达,浓缩胶浓 度为5%,分离胶浓度为12%.Westernblot所用一 抗为豚鼠FMD感染阳性血清和阴性血清,二抗为 山羊抗豚鼠IgG.HRP,DAB显色. 2结果 2.13D基因的扩增 用PCR方法,从质粒T.3D重组质粒上扩增出 3D基因片段,理论跨度为1410bp(图1,A),与预期 结果相符,表明已成功地扩增到3D的DNA片段. 2.23D基因定点突变 以含有所需点突变的互补寡核苷酸引物3D . DTB—UP和3D.DTB.DN,分别与上,下游正常引 物T4.3D1和T4.3D2组成两个PCR反应体系,以 双链无突变3DDNA作模板分别作PCR.PCR结果 M123M45M A,LB TGTTCAACCCTGAATTCGGGCCTGCT C TGTTCAACCCT鱼垒鱼!!CGGCCTGCT 310 盎.320 图1.3D基因的PCR扩增与定点突变 Fig.1.PCRamplificationandpoint.directionmutationof3Dgene A.3D基因的PCR扩增;B.3D基因第1轮PCR;C.3D基因第2轮 PCR;D.3D基因突变前序列;E.3D基因突变后序列.M,DNA分子量 DL2000;1,3D基因PCR产物;2,3D2PCR产物;3,3D1PCR产物;4和 5,3D基因定点突变产物. A.PCRamplificationof3Dgene;B.FirstroundPCRamplificationof3Dgene;C.SecondroundPCRamplificationof3Dgene;D.Nucleotide sequenceof3Dgenebeforemutation;E.Nucleotidesequenceof3Dgeneaftermutation.M,DNAmarkerDL2000;1,PCRamplificationproductof 3Dgene;2.PCRamplificationproductof3D1;3,PCRamplificationproductof3D2;4and5,piontmutationproductof3D. 第2期覃健萍等:口蹄疫病毒3D蛋白在T4噬菌体衣壳表面的展示 193 显示,已成功扩增到一大一小的已经定点突变的 PCR产物3D1和3D2(图1,B).以纯化的PCR产物 3D1和3D2互为引物(即含有所需点突变5’端重 叠部分产物作为引物),在高保真DNA聚合酶作用 下,延伸合成含有所需点突变的融合DNA片段.然 后加入3D基因的上下游引物T4.3D1和T4.3D2, 经过30个循环后,得到定点突变的3D基因,长约1 410bp(图1,C).其序列测定结果见图(1,D)和图(1, E). 2.3pSOC.3D重组子的构建与鉴定 从LA抗性平板上随机挑取6个单菌落,用LA 液体培养基作增菌培养,以此菌液为模板,用两对引 物对T4.3D1/T4.3D2和SOC.up/T4.3D2进行PCR 筛选,其扩增结果如图(2,A和2,B)所示,获得6个 正确的方向插入的阳性转化子.对PCR检测获得的 阳性转化子,用E.Z.N.A.plasmidMinipreps试剂盒 1410— 123456M 抽提质粒.含有3D基因的重组质粒命名为 pSOC.3D.将重组质粒pSOC.3D用EcoRI消化获 得2条带,其中1条为pSOC载体,大小约4800 bp,另1条为3D基因,大小为1410bp;重组质粒 pSOC.3D用NdeI消化获得1条带,大小约6111 bp(图2,C),与预期相符. 2.4pR.3D重组子的构建与鉴定 挑取在LA抗性平板上生长的单菌落,接种于 LA液体培养基,于37?培养8,10h后以菌液为 模板,用PCR方法进行筛选.其中T4.3D1/T4-3D2 引物对用于检测3D与pR连接产物的转化子,获得 大小约1410bp的PCR扩增条带,用 SOC.up/T4.3D2进行PCR检测时获得大小约1659 bp的扩增条带(图3,A和3,B).将正确插入pR整 合质粒的重组子命名为pR-3D.重组质粒pR-3D用 NdeI消化获得l条带,大小约6510bp;pR-3D质 M123456M178M2 2000 1000 750 500 图2.pSOC一3D重组子的PCR筛选和酶切鉴定 Fig.2.PCRscreeningandrestrictionendonucleasedigestionofrecombinant pSOC一3D A.用T4—3Dl/T4—3D2引物扩增的3D基因;B.SOC-up/T4—3D2引 物扩增的SOC一3D融合基因的PCR扩增产物;C.重组质粒pSOC一 3D的酶切 鉴定.M,DNA分子量标准;1~6,不同的克隆;7,pSOC一3D的EcoRI 酶切产物;8,pSOC一3D的NdeI酶切产物. A.PCRamplificationproductof3DgenebyprimerspairT4—3D1/T4—3D2 ;B.PCRamplificationproductofSOC一3Dfusiongenebyprimerspair SOC—up/T4—3D2;C.Restrictionendonucleasedigestionofrecombinant plasmidpSOC一3D.M,DNAmarker;1---5,sixdifferentclones;7, plasmid pSOC一3DdigestedbyEcoRI:8,plasmidpSOC一3DdigestedbyNdeI. 141O_? 12345MM12345 AB 141O 65 5l M167M2 C 图3.pR一3D重组子的PCR筛选和酶切鉴定 Fig.3.PCRscreeningandrestrictionendonucleasedigestionofrecombinant pR一3D A.用T4—3D1/T4—3D2引物扩增的3D基因;B.SOC—up/T4—3D2 引物扩增的SOC3D融合基因的PCR扩增产物;C.重组质粒pR3D的 酶切鉴定.M,DNA分子量标准.l~5,不同的克隆;6,pR一3D的EcoRI 酶切产物;7,pR一3D的NdeI酶切产物. A.PCRamplificationproductof3DgenebyprimerspairT4—3Dl/T4—3D2. B.PCRamplificationproductofSOC一3Dfusiongenebyprimerspair SOC—upff4—3D2.C.Restrictionendonucleasedigestionofrecombinantp lasmidpSOC一3D.M’DNAmarker;l---5.fivedifferentclones; 6,plasmidpR一3DdigestedbyEcoRI;7,plasmidpR一3DdigestedbyNdeI. : 农业生物技术2008年 粒用EcoRI于37~C消化3h,用琼脂糖凝胶电泳检 测可见2条带,1条为载体pR,大小约5100bp,另 1条为3D基因片段,大小为1410bp(图3,C),与预 期结果相同. 2.53D基因的诱导表达 经过PCR鉴定和酶切鉴定的重组质粒 pSOC一3D送交上海博亚生物技术公司进行序列测 定,结果表明3D基因按预期设计插入了正确位点, 且读码框正确.经过序列测定的重组质粒pSOC一3D 转化E.coliBL一21(DE3),在LA平板上挑取单菌落 培养,以菌液为模板,用T4—3D1/T4—3D2进行PCR 鉴定,所有转化菌均获得预期大小的扩增片段,将获 得的重组表达菌分别命名为BL—pSOC一3D.取 BL—pSOC一3D接种于LA液体培养基,待细菌浓度达 到)f蜘为0.4,0.5时加入IPTG并使其终浓度达到 1mmol/L,分别于加入IPTG后0,1,2,3和4h取1 mL菌液,用SDS—PAGE检测表达产物,同时以 pSOC质粒转化BL一21(DE3)的诱导表达产物作为 对照.检测结果表明IPTG能很好地诱导SOC一3D 蛋白表达,在加入诱导剂lh后即可在表达菌中检测 融合蛋白,表达的融合蛋白分子量约63kO(图4) kI) 63— 图4.SOC.3D融合蛋白表达的SDS—PAGE分析 Fig.4.SDS-PAGEanalysisofSOC一3Dfusionproteinexpression product M,蛋白质分子量标准;1-6,分别为/PTG诱导0-5h的BL-pSOC?3D 细菌裂解物,箭头指为SOC一3D表达条带;7,空质粒对照,加入IPTG 诱导4h的细菌裂解物. M,proteinMWmarker.1-6,BL-pSOC?3DcelllysatesafterIPTG indutionforo~5h,respetively,thearrowpointedtothefusionprotein SOC.3Dband.7,BL21celllysateofthecontrolplasmidafterIPTG indutionfor4h. 2.6T4—3D重组噬菌体的获得 用重组质粒pR一3D转染T4噬菌体宿主菌E. coliE2,挑取LA平板上生长的单菌落用PCR方法 检测.将阳性的重组细菌与溶菌酶缺陷型噬菌体 T4.zl进行同源重组,在不含溶菌酶的SC培养基 上,重组成功的噬菌体可不依赖溶菌酶生长,挑取单 斑经梅花斑增殖,用磷酸盐缓冲液浸泡出噬菌体,以 此浸出液为模板,用PCR方法对重组噬菌体进行筛 选.将阳性的重组噬菌体T4—3行扩大培养和离 心收集,利用赛多利斯切向流(Vivaflow200)超滤系 统对离心后的重组噬菌体进行浓缩,过滤浓缩后的 噬菌体经过蔗糖梯度离心进行提纯,将上述浓缩收 集的重组噬菌体在一80?和37?反复冻融数次, 加入样品缓冲液,在沸水浴煮沸3,5min,用12% SDS—PAGE检测重组噬菌体上的目的蛋白(图5, A).用特异性FMDV感染血清对T4—3Di行West— emblot检测,结果表明,在硝酸纤维素膜上的 T4—3D样品检测到特异性条带(图5,B),分子量大 小为63kD. kI) 63— kI) 63— AB 图5.重组噬菌体T4—3D的SDS.PAGE 和WesternbloR分析 Fig.5.SDS—PAGEandWesternblottinganalysisofrecombinant phageT4—3D A,T4噬菌体的SDS-PAGE分析;B,重组噬菌体T4—3D的Western blot分析.M,蛋白质分子量标准;1,T4—3D重组噬菌体;箭头指为 SOC一3D蛋白;2,T4-Z1噬菌体. A.SDS?PAGEanalysisofphageT4;B.Westernblottinganalysisof recombinantphageT4—3D.M.proteinMWmarker;1.recombinant phageT4?3D;ThedirectionofarrowwasthefusionproteinSOC?3D;2, phageT4?Z1. 3讨论 本实验首次使用拼接重叠延伸聚合酶链反应 (splicingoverlapextensionpolymerasechainreaction, SOE—PCR)对3D基因进行定点突变,SOE—PCR比 传统人工定向突变方法简单便捷,不需克隆制备单 链DNA模板,也不需杂交筛选,1d内即可得到结 牾” 牾”7 ““ 第2期覃健萍等:口蹄疫病毒3D蛋白在T4噬菌体衣壳表面的展示 195 果,且阳性率可达100%(Ho,1989),有很大推广价 值.不过引物设计要求较高,使用较昂贵的高保真的 TaqDNA聚合酶.如果DNA聚合酶的保真度不高, PCR产物可能存在随机错误掺人.本研究结果表 明,使用KODDNApolymerase可以达到定点突变 的目的.SOE.PCR可以避免传统人工定向突变方法 较繁琐提高突变效率,缩短定点突变时间. 噬菌体表面展示技术是由Smith(1985)首先建 立起来的一种新的基因工程技术,该技术的最大特 点是:直接将表达型与其基因型联系在一起,实现了 基因型和表现型的转换,利用其配体的特异性的亲 和力,将目的蛋白或者多肽挑选出来,提供了高效率 的筛选系统.本实验使用的T4噬菌体是所有噬菌 体中结构较大且遗传结构较复杂的有尾噬菌体,属 参考文献 AlonsoA.GomesIandBahnemannHG.Theinductionofanti- bodiesagainstVIAAincattlevaccinatedandrevaccinated withinactivatedfoot-and-mouthdiseasevaccine(J).Biologi- calCenterPanamaFiebreAflosa,1988,54:53-54 BergmannIE,MaliratV,NeitzertE,BeckEandPanizzuttiN. 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T4展示系统容量大(至少35kD的蛋白质),拷贝数 高,可以展示的肽或蛋白质范围广,尤其适用那些不 易被大肠杆菌分泌的复杂蛋白质(Efimoveta1., 1997).本实验成功地在T4噬菌体表面展示3D蛋 白,而且展示的3D蛋白经蔗糖梯度纯化后保持相 对独立的空间构象和生物学活性,可被FMDV感染 血清有效识别和反应,为将来建立以展示3D蛋白 为包被抗原的鉴别感染动物和免疫动物诊断方法和 进一步研究3D蛋白的结构与功能提供了基础资 料,对FMD诊断与防制具有重要意义. phageT4asasurfacedisplayvector(J).VirusGenes, 1997,l95:303-311 HoSN,HuntHDandHo~onRM.Engineeringhybridgenes withouttheuseofrestrictionenzymes:Genesplicingby overlapextension(J).Gene,1989,77(1):51-59 MackayDKJ,ForsythMA,DaviesPR,BerlinzaniA, BelshamGJ,FlintMandRyanMD.Differentiatinginfec- tionfromvaccinationinfoot??and??mouthdiseaseusingapanel ofrecombinant,non-structuralproteinsinELISA(J).Vaccine, 1998a,16:446--459 MackayDKJ,ForsythMA,DaviesPR,BerlinzaniA, BelshamGJ,FlintMandRyanMD.Antibodyto Foot-and-mouthdiseasevirusinvaccinatedanimalsexposed toinfection(J).TheVeterinaryQuarterly,1998b,20:9-11 RenZJ,LewisGK,BlackLWandWingfieldPT.Phagedis- playofintactdomainsathighcopynumber:Asystembased onSOC,thesmalloutercapsidproteinofbacteriophageT4 (J)Prote/nScience,1996,5:1833-1843 SmithGP.Filamentousfusionphagenovelexpressionvectors thatdisplayclonedantigensonthevirionsurface(J).Science, 1985,228:315-317 VillingerF,MuellerHKandBrucknerL.Antibodiesto Foot-and-mouthdiseasevirusinfectionassociated(VIA)anti- gen:UseofabioengineeredVIAproteinasantigeninan ELISA(J).VeterinaryMicrobiology,1989,20:235-246