【doc】脾气虚大鼠脾

【doc】脾气虚大鼠脾 脾气虚大鼠脾 摹29卷摹6期 2002年6月 辽宁中医杂志 LIAONINGJOURNALOFTRADITIONALCHINESEMEDICINE Vol29N06 Jun2002 脾气虚大鼠脾肝组织蛋白激酶C活性变化的实验研究 易杰,李德新,林庶如.夏淑杰 (1.北京中医药太学博士后,北京100029;2.辽宁中医学院.辽宁沈阳110032) 摘要:目的:探讨脾气虚脾肝组织蛋白激酶c活性变化,以揭示脾气虚与脾肝组织PKC活性变化的关系. 方法:采用复合因素塑造大白鼠脾气虚证模型,采用底精磷酸化法检洲摸型脾肝组织蛋白激酶c活性.结果:脾气 虚证大鼠模型脾组织细胞膜中PKC活性明显降低(P<0.001.),而脾组织细胞浆中PKc活性无明显变化(尸> O.05):脾气虚证大鼠模型肝组投细胞膜PKC活性无明显变化(P>005),肝组织知胞装中PKC活性明显升高(P <0Or).健脾益气中药有提高脾组织知胞膜中PKC活性的趋势,但作用不显着无蜿计学意义.而该中药能够降 低脾组擐细胞浆中PKC活性(0.O1<P<0.05);健脾益气中药能够明显降低肝组缎细胞膜和细胞浆中PKC活性 (P<O.001).结论:脾组织细胞膜,肝组织细胞膜和细胞浆中PKC活性变化与脾气虚的病理变化密切相关;健脾 益气中药可以调节脾气虚大鼠脾,肝组织中PKC活性. 关键词:脾气虚证;蛋白激酶C;动拍模型 中图分类号:R228文献标识码:B文章编号:1000—1.719{2002)06—0374—02 蛋白激酶C(PKC)广泛参与细胞信息传递,分 泌,离子通道调节,细胞增殖和分化等一系列重要生 命相关的过程,成为细胞内信号传导过程中的关键 分子之一.PKC活性异常变化,会导致细胞功能的 异常,引起许多疾病发生.中医的脾是一个结构和 功能的综合性概念,脾虚时可出现多脏器的功能改 变.导致许多疾病的发生.脾气虚是脾虚最基本的 病理变化.因此,脾气虚证会出现多脏器的功能异 常.并与细胞信号传导异常有关. 近年来,脾气虚证细胞信号传导方面的研究国 内外报道很少.本实验对脾气虚证模型脾,肝组织 细胞膜和细胞浆中PKC活性变化加以研究.旨在探 讨脾气虚证脾肝组织PKC活性的变化. 1材料与方法 11材料 动物:SD健康大鼠24只.雌雄各半,体重(200 ?20)g,由辽宁中医学院实验动物中心提供.药物: 采用导师自拟健脾益气中药(具体药物略),一次性 购于辽宁中医学院附属医院药局.每100ml含生药 lOOg.过滤后4?冰箱保存待用.试:protamine噙 自Sigma公司;[7_32P]ATP购自北京亚辉生物医学 工程公司;其余试剂均为国产分析纯.主要仪器:高 速离心机(Dupont公司产).F一2000荧光光度计(日 立公司产).BeckmanLS-180型液闪仪. 12方法 1.21脾气虚证大鼠模型的塑造按雌雄和体重 随机分为正常对照组(对照组).脾气虚证组(模型 组)和健脾益气中药组(治疗组).每组各8只.模型 组和治疗组按目前公认的经典方法llI加以改进(跑 步改为游泳.造摸时间为1个月).塑造脾气虚证模 型. 1.2.2中药对脾气虚证大鼠的治疗依据模型判 定标准【,判定模型成立后,治疗组采用灌胃的方 法.灌服中药3ml/d,治疗1个月其它各组灌服等 量的生理盐水. 1.2.3标本的采集实验结束时,所有动物施行乙 醚麻醉.眶下静脉取血后,取新鲜组织,生理盐水洗 去血迹.一40?冰箱保存. 1.2.4PKc活rl生测定组织样本的处理:取出组 织,冻融后,称取组织0.3g.各组织样本胞浆,胞膜 蛋白的提取:取等重的各样品.加6倍于湿重的粉碎 缓冲液BufferA(含2mmol/LE;DTA,lOmmol/L EGTA,20mmol/LTris—HCLph7.5,25mol/L 糖).剪碎匀浆,4?下100O00g高速离心2h.得上 清为胞浆组分;沉淀(为红细胞)加膜抽提液(含1% TritonX一100,5ram0l/LEGTA,2mmol/LEDTA)悬 起,超声粉碎后.放置过夜.次日.以同样条件荐离 心,得上清为膜组分.蛋白定量:采用酚试法.以 牛血清白蛋白为标准蛋白.然后.调定至等蛋白浓 度备用.PKC比活性测定:参考Takai法l.底物 磷酸化:以proramine为底物.反应总体积为50~.1(含 30mmol/L2一琉基乙醇,5mmoI/L醋酸镁,02[ P1ATP,1%protamine.20mmol/Lph7.5Trs/ HCL).30?反应7rain.将反应液点于Whatman P18离子交换滤纸上晾开,用75mmol/L磷酸冲洗3 次.取出吹干,将滤膜放八含蒸馏水的液闪杯中,以 液闪记数仪测定其活性.PKC活性用比活性表示. 2结果 2.1脾组织细胞膜和细胞浆中PKC活性的变化 脾气虚证大鼠脾组织细胞膜中PKC活性.对照 收稿日期:2002一Ol—t8 作者简介:易杰(1965一).女.辽宁灯塔人,副教授.博士后在读.从事中医基础理论教 学与研究,主攻睥虚病理机制研究 374? 6期易l^等;脾气虚太蔬脾肝姐娘蛋白激酶C活性变化的宾验研究 组与模型组和治疗组分别存在明显的差异,而模型 组与治疗组之问无明显差异;脾组织细胞浆中PKC 活性,对照组与模型组之问无明显差异,而模型组与 治疗组,对照组与治疗组之间均存在明显差异,见表 1. 表1睥气虚证太鼠睥组织细胞膜和细胞浆中PKC活性(?S) 注:与对照组比较.1)P<0001;治疗组与模型组比较.2)P< 005 2.2肝组织细胞和细胞浆中PKc活性的变化 脾气虚证大鼠肝组织细胞浆中PKC活性.每两 组之间均存在明显差9-;肝组织细胞膜中PKC活 性,对照组与治疗组,模型组与治疗组均存在明显差 异,而对照组与模型组之间无明显差异,见表2. 表2脾气虚证太鼠肝组织细胞膜和细胞浆中PKC活性(S) 注与对照组比较,1)P<0.001;治疗组与模型组比较,2)P< 005. 3讨论 近年来.中医脾虚证与细胞信息传导的相关蛋 白激酶的研究,已见报道.关崇芬【]报道了脾虚证 大鼠模型酪氨酸激酶活性降低.本实验结果表明, 脾气虚证大鼠模型脾组织细胞膜中PKC活性降低, 日组织细胞浆中PKC活性升高.脾气虚证出现睥 肝组织细胞PKC活性的异常变化,说明脾气虚证的 病理变化与脾肝密切相关 刘春明等峙道温补脾阳中药能够明显提高脾 组织细胞膜中PKC活性.本实验结果表明.健脾益 气中药也有提高脾气虚证大鼠模型脾组织细胞膜中 PKC活性的趋势,但作用不显着,无统计学意义. 而该中药可以减低脾组织细胞浆中PKC活性,降低 肝组织细胞膜和细胞浆中PKC活性.说明健脾益 气中药可以调节脾,肝组织细胞浆和细胞膜中PKC 活性. 实验中还现一个有趣的现象.脾气虚时,模 型组脾组织细胞膜PKC活性下降,肝组织细胞浆 PKc活性升高;经过健脾益气中药治疗后,脾组织 细胞浆和肝组织细胞膜PKC活性均明显下降,但低 于正常水平,肝组织细胞浆PKC活性降低,但是尚 未达到正常水平.这,现象能否说明脾气虚的病理 变化在于脾组织细胞膜和肝组织细胞浆PKC活性 变化,健脾益气中药通过调节肝组织细胞浆PKC活 性改善脾气虚状态,有待今后实验证实. 誊考文献: [1】王晓明,孪德新.易杰.等睥为后天之本的分子生物学基础一 睥气虚证太白鼠模型LPO及其相关抗氧化酪变化的实验研究 [J].辽宁中医杂志.1994.21(3,:139 【2]TakMTCalciumdependentactivationofamuhiftmctionalpro- reinkinasemembranephospholipid【J】.JBio]Chem.1979, 254:3692 [3】关崇芬蛋白酪氨激酶与中医睥虚证研究【J】.中国中医药信息 杂志.1996,3(11);14. f4j刘春明.李游新,吕爱萍,等.睥用虚证太鼠摸型肝脏和脾脏蛋 白激酶c话性的实验研究[】]辽宁中医杂卷2000,27【1);44 编辑:刘劲 ExperimentalStudyonActivitiesofProteinKinaseCinSpleenandLiver TissuesofRatswithSpleen-QiDeficiencySyndrome YIJie,IJIDexin,LINShurLt2,XIAShujid f1Beiji~CollegeofTraditionalChm~eMedicine,Beijing100029.China: 2Lia~ingCo~egeofTra出tL(埘ChineseMedicine,Shengyang110032,Liaoning.ch】衄) AbstractObjmq~:Researchiorrelationshipbetweenspleen-Q;deficiencyandactivitiesoipmteinkln~eCinspleenmadliver tissuesoiratsMethod:Ratmodelwithspleen— QideficiencysyndromewerebuiltbyclassicalmethodandactivitiesoiproteinkinaseC weredetectedwith8ubstratepbamphorylatlonmethodResults:PKCactivitiesincellmembraneoispleentissueoirat5withspleen Yangdeficencvsyndromesdecreased(P<0O1)PKCactivitiesincytopia~wnofliverofratwithspleenQjdeficiencysyndromesin- creased(P<001)RecipeforreplenishingspleenQisignificantlydecreasedPKCactivitiesinceilmembraneofliverandincytoplasm ofspleenandliverfP<0.O1)C.~ndus,bns:ThechangesofPKCactivitiesarecJmelyrelatedrothepathologicalch~nge,sofspleenQi deficiencyChineseherbsforreplenishingspleenoicanadjustPKCactivitie~inspleenandliverofratwithspleenyangdeficiencysyn- drome Kwords:spleenQideiicency;proteinkin~seC;animalmodel , 375,