年产五万吨L苏氨酸发酵工艺

年产五万吨L苏氨酸发酵工艺 中北大学2014年发酵工程课程设计说明 1绪论 1.1苏氨酸简介 L-苏氨酸是一种必需的氨基酸，苏氨酸有四种异构体，天然存在并且对机体有生理作用的是L-苏氨酸。苏氨酸主要用于医药、化学试剂、食品强化剂、饲料添加剂等方面。特别是饲料添加剂方面的用量增长快速，它常添加到未成年仔猪和家禽的饲料中，是猪饲料的第二限制氨基酸和家禽饲料的第三限制氨基酸。在配合饲料中加入L-苏氨酸，具有如下的特点:?可以调整饲料的氨基酸平衡，促进禽畜生长;?可改善肉质;?可改善氨基酸消化率低的饲料的营养价值;?可降低饲料原料成本;因此在欧盟国家(主要是德国、比利时、丹麦等)和美洲国家，已广泛地应用于饲料行业。 在医药方面，苏氨酸是氨基酸大输液的主要成分之一。常用于手术前后、创伤、烧伤、骨折、营养不良、慢性消耗性疾病等的辅助治疗，是临床用量很大的品种。发酵法生产苏氨酸，其优点是可利用廉价的葡萄糖原料直接生产产品，菌种特性专一，发酵液中几乎不含其它氨基酸，提纯后产品质量好，成本低，易于大规模生产。选择具有国际先进水平高产酸、高转化率基因工程菌种，生产苏氨酸，不但附加值更高，而且能够发挥氨基酸发酵企业自身的优势，改变氨基酸发酵企业产品单一，利润较薄的状况。 发酵法生产氨基酸是利用微生物具有合成自身所需氨基酸的能力，通过诱变筛选，选育出具有各种缺陷型及抗性的菌株，以解除代谢调节的反馈和阻遏，达到过量合成目的氨基酸的生产方法。微生物细胞内的氨基酸合成都是以一些代谢中间产物为底物，保证各种氨基酸的平衡和不断供应。 1.1.1苏氨酸的结构理化性质 名 称:L-苏氨酸(L-Threonine)(β-羟基-α-氨基丁酸) 简写: Thr 法定编号: CAS 72-19-5 结 构 式: CHCH(OH)CH(NH)COOH 32 分 子 式: CHNO 493 分子量: 119.12 白色斜方晶系或结晶性粉末。无臭，味微甜。253?熔化并分解。高温下溶 第 1 页 中北大学2014年发酵工程课程设计说明书 于水，25?C溶解度为20.5g/100ml。等电点5.6。不溶于乙醇、乙醚和氯仿。 苏氨酸在机体内的代谢途径和其他氨基酸不同，是唯一不经过脱氢酶作用和转氨基作用，而是通过苏氨酸脱水酶(TDH)和苏氨酸脱酶(TDG)以及醛缩酶催化而转变为其他物质的氨基酸。途径主要有3条:通过醛缩酶代谢为甘氨酸和乙醛;通过TDG代谢为氨基丙酸、甘氨酸、乙酰COA;通过TDH代谢为丙酸和α-氨基丁酸。 1.1.2苏氨酸的作用来源及发展 苏氨酸是一种重要的营养强化剂，可以强化谷物、糕点、乳制品，和色氨酸一样有缓解人体疲劳，促进生长发育的效果。医药上，由于苏氨酸的结构中含有羟基，对人体皮肤具有持水作用，与寡糖链结合，对保护细胞膜起重要作用，在体内能促进磷脂合成和脂肪酸氧化。其制剂具有促进人体发育抗脂肪肝药用效能，是复合氨基酸输液中的一个成分。同时，苏氨酸又是制造一类高效低过敏的抗生素——单酰胺菌素的原料。 苏氨酸用于医药、化学试剂、食品强化剂、饲料添加剂等方面。特别是饲料添加剂方面用量增长快速，它常添加到未成年仔猪和家禽的饲料中，是猪饲料的第二限制氨基酸和家禽饲料的第三限制氨基酸。随着人民生活水平的提高和养殖业的发展，苏氨酸作为饲料用氨基酸，广泛用于添加仔猪饲料、种猪饲料、肉鸡饲料、对虾饲料和鳗鱼饲料等。 主要食物来源:发酵食品(谷物制品)、鸡蛋、茼蒿、奶、花生、米、胡萝卜、叶菜类、番木瓜、苜蓿 等。 苏氨酸的生产方法主要有发酵法，蛋白质水解法和化学合成法三种，目前微生物发酵法已经成为生产苏氨酸的主流方法。长期以来，国际市场对苏氨酸的需求持续稳定增长，是需求增长最快的氨基酸品种之一，特别是在化学及生化、食品添加剂、饲料添加剂等方面的用量增长快速，大有取代色氨酸而成为除赖氨酸、蛋氨酸以外的发展最迅速的第三大氨基酸。目前全世界苏氨酸的需求量不应低于8 万t/ 年，缺口较大，且每年将以10%~12% 的速度递增。苏氨酸发酵法菌种来源有大肠杆菌、短杆菌、谷氨酸棒杆菌等。 第 2 页 中北大学2014年发酵工程课程设计说明书 2菌种的选择与制备 2.1菌种选择与保藏 2.1.1菌种选择 关于菌种的选择，通过查资料工业一般使用大肠杆菌基因工程，因其产量大，没有反馈抑制，本设计采用大肠杆菌基因工程菌发酵工艺来生产苏氨酸，所以对于菌种来源需要从菌种机构来买。 2.1.2菌种保藏 菌种保藏的原理:通过低温、干燥、隔绝空气和断绝营养等手段，以最大限度的降低菌种的代谢强度抑制细菌的生长和繁殖。由于菌种的代谢相对静止，生命活动将处于休眠状态，从而可以保藏很长时间。要求保存的菌种在复苏后除保持以前的生活和繁殖能力，不发生形态特征、生理状态以及遗传性状的改变外，还不允许污染任何杂菌。此外，保存前应确保菌种的单纯性，先分离单菌落后进行鉴定，然后再繁殖保存。菌种常用的保存的方法有斜面冰箱保藏法、沙土管保藏法、菌丝速冻法、石蜡油封存法、真空冷冻干燥保藏法、液氮超低温保藏法。 从菌种机构买回来的菌种，为了保证每次接种的菌种稳定，需要对菌种进行扩大并保藏，将菌种接种于LB培养基，稳定培养24h，将所得的菌用甘油冷冻保藏法于-70度保藏。使用时将菌种表面部分融化，挑取少量于摇瓶培养基中，注意菌种不要全部融化，摇瓶培养所得置于冰箱中供菌种扩大使用。 2.2培养基的设计 2.2.1培养基配置的原则 培养基是指可供微生物细胞生长繁殖所需的一组营养物质和原料，同时也为微生物生长提供除营养外的其他生长所需的条件。原则上?满足必须的原料;?生化反应的基本条件(温度、溶氧和pH);?来源丰富、价格低廉、取材方便、质量稳定;?培养基成分不影响下游产品的提取加工。 2.2.2培养基类型 培养基可以按照用途可以分成，菌种扩大培养基，摇瓶培养基、种子培养基和发酵培养基。 (1)LB培养基 LB培养基是一种培养基的名称,生化分子实验中一般用该培养基来预培养 第 3 页 中北大学2014年发酵工程课程设计说明书 菌种,使菌种成倍扩增,达到使用要求. (2)摇瓶培养基 孢子培养基是供菌种繁殖孢子的一种常用固体培养基，对这类培养基的要求是能使菌体生长迅速,产生数量多而且优质的孢子,并且不会引起菌体变异。 (3)种子培养基 种子培养基是供孢子发芽、生长和大量繁殖菌丝体，并使菌丝体长的粗壮，成为活力强的“种子”。 (4)发酵培养基 发酵培养基既要有利于生长繁殖，防止菌体过早衰老，又要有利于产物的大量合成。要求培养基的组成应丰富、完全，碳、氮源要注意速效和迟效的互相搭配，少用速效营养，多加迟效营养，还要考虑适当的碳氮比，加缓冲剂稳定pH值;并且还要有菌体生长所需的生长因子和产物合成所需的元素、前体和促进剂等。 由于本课为工业发酵生产，所以选择培养基配料时要注意到经济成本，选用廉价发酵原料根据本地条件，结合实际情况，可选用合适的碳源和氮源。采用葡萄糖作为主要的碳源，玉米浆作为底料的氮源，玉米浆除能提供必需的氮源外还含有利于产酸的有益生长因子，同时辅以适量的无机盐和其他微量元素。 大肠杆菌的培养基配方及其培养条件 2.2.3培养基配方(百分比) LB培养基 胰蛋白胨 10g/L ， 酵母提取物 5g/L ， 氯化钠 10g/L 调节pH到7.4 摇瓶培养基 葡萄搪0.5， 牛肉膏1.0 ， 蛋白胨1.0， NaCl0.5， 调节pH值在7.0~7.2之间。 种子培养基 葡萄糖3.5， 玉米浆1.5， (NH) SO0.5， MgSO 0.05， 424 4 KH PO0.1，CaCO 1。溶解后以NaOH调至pH7.0。 24 3 发酵培养基 第 4 页 中北大学2014年发酵工程课程设计说明书 葡萄糖12~14， 玉米浆3.0， (NH) SO 3.5 KH PO 0.1， 42424MgSO 0.1， CaCO 2，以NaOH调pH至7。 4 3 补料培养基 葡萄糖 15 玉米浆 3.0 (NH) SO 2.0 424 以上培养基均在121?下灭菌20min。 2.2.4培养方法: 摇瓶培养基 在32?培养18,24h经质量检查合格后，即可利用火焰接种法接种于种子罐。 种子培养基 接种时以1%的接种量接种于200L种子罐，搅拌转速300,700r/min，通过自动添加氨水控制pH在7.0。一般培养18~20h，取菌种，其pH、残糖、菌体密度及镜检正常后可供发酵罐接种用，利用压差法接种于发酵罐。 发酵培养基 接种时以10%的接种量接种于2000L标准发酵罐中，其装液量为1500L。罐内培养条件为:温度32?，气压l00KPa，通风比前期1?0.2，中后期1?0.3，搅拌300r/min，加泡敌作消泡剂。分批补料发酵周期为60h 补料培养基 在发酵培养基培养12h后，当总糖浓度低于5.5%时，开始补料，补料计量根据发酵液情况而定。 2.3 培养基的营养要求 碳源 主要以淀粉水解糖作为碳源，生产过程中应注意控制其浓度，当碳源浓度过高时，对菌体生长不利，氨基酸的转化率降低。 氮源 包括铵盐、尿素、氨水等，同时有调节pH值的作用。对于营养缺陷型菌株应以添加有机氮源水解液为主。需生物素和氨基酸时，应以玉米浆作氮源。尿素灭菌时形成磷酸铵镁盐，须单独灭菌。可分批流加。氨水用pH自动控制连续流加。此外，还应注意合适的C/N比。 第 5 页 中北大学2014年发酵工程课程设计说明书 磷酸盐 对发酵有显著影响，不足时糖代谢受抑制，要根据菌种不同的培养及生产阶段及时的调整用量。 镁 镁是已糖磷酸化酶、柠檬酸脱氢酶和羧化酶的激活剂，并促进葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活力。可通过添加MgSO4防止发酵过程中的缺乏。 钾 钾可以促进糖的代谢，钾的量较多时利于产酸，钾的量较少时利于菌体生长。可以根据不同的目的和需要调整钾的用量。 其他微量元素 钠可调节细胞内外的渗透压，一般在调节pH值时加入。锰是许多酶的激活剂。而铜离子则对氨基酸发酵有明显毒害作用 生长因子 生长因子是指氨基酸、核苷酸、维生素、脂肪酸等菌体必须地生理活性物质。 水 水是生命活动不可或缺的物质，是细胞的主要成分，良好的介质，营养传递的道体，调节细胞生长。 2.4发酵条件的研究 细菌生长曲线可划分为四个时期，即:?延迟期，?对数生长期，?稳定期， ?衰亡期。生长曲线表现了细菌细胞及其群体在新的适宜的理化环境中，生长繁殖 直至衰老死亡的动力学变化过程。生长曲线各个时期的特点，反映了所培养的细菌细 胞与其所处环境间进行物质与能量交流，以及细胞与环境间相互作用与制约的动态变 化。深入研究各种单细胞微生物生长曲线各个时期的特点与内在机制，在微生物学理 论与应用实践中都有着十分重大的意义。 处于对数生长期的细胞，由于代谢旺盛，生长迅速，代时稳定，个体形态、化学 组成和生理特性等均较一致，因此，在微生物发酵生产中，常用对数期的菌体作种子， 它可以缩短延迟期，从而缩短发酵周期，提高劳动生产率与经济效益。对数生长期的 细胞也是研究微生物生长代谢与遗传调控等生物学基本特 第 6 页 中北大学2014年发酵工程课程设计说明书 性的极好材料。因此如果确 定了菌体的生长曲线，那么就可以选择合适的时间接种，从而达到虽好的发酵效果。 在发酵的过程中，苏氨酸产量会随时间呈曲线变化，在某一段时期内菌体产苏氨酸的量会达到最大值，这个时间段就是最佳的发酵时间。2.5灭菌 所谓灭菌，就是指用物理或化学方法杀灭或去除物料或设备中一切有生命物质的过程。 2.5.1灭菌方法 灭菌，就是指用物理或化学方法杀灭或去除物料或设备中一切有生命物质的过程。常用的灭菌方法有以下几种: (1)化学药剂能使微生物中的蛋白质、酶及核酸发生反应而具有杀菌作用，如甲醛、氯、高锰酸钾、环氧乙烷等。 -7(2)紫外线灭菌:波长为(2.1,3.1)×10m的紫外线有灭菌作用，最常用 -7的波长为2.537×10m的紫外线，但紫外线的穿透力低不适用于培养基灭菌。 (3)干热灭菌的条件为在160?下保温1小时。适用于一些要求干燥的实验器具和材料的灭菌。 (4)湿热灭菌即利用饱和水蒸气进行灭菌。通常的蒸汽灭菌条件为在121?(表压约0.1MPa)维持30分钟。 2.5.2培养基的湿热灭菌 本实验采用湿热灭菌，条件为在121?(表压约0.11MPa)维持30分钟。 对培养基进行湿热灭菌时，培养基中的微生物受热死亡速率与残存数量成正比，即 dN,,kN, d 式中:N 培养基中活微生物的个数;τ为微生物受热时间，s; κ为比死亡 ,1s速率，; 上式被称为对数残留定律。其中N为经τ时间灭菌后培养基中活微生物数。 连续灭菌 将配制好的培养基在通入发酵罐时进行加热、保温、降温的灭菌过程。 分批灭菌就是将配制好的培养基放入发酵罐或其他装置中，通入蒸汽将培养 第 7 页 中北大学2014年发酵工程课程设计说明书 基和所用设备一起进行灭菌的操作过程，也称实罐灭菌。分批灭菌是中小型发酵罐常用的一种灭菌方法。 分批灭菌的优点是不需要专门的灭菌设备，投资少，设备简单，灭菌效果可靠。分批灭菌的缺点是发酵罐占用时间长，培养基的营养成分破坏程度较大。 连续灭菌流程图如图2-1所示。 图2-1 连续灭菌的流程图 由于本设计使用的发酵罐较小所以本生产利用分批灭菌即实罐灭菌的方法。 2.5.3分批灭菌 分批灭菌是指将配制好的培养基放入发酵罐或其他装置中，通入蒸汽将培养基和所用设备加热至灭菌温度后维持一定时间，再冷却到接种温度，也叫间歇灭菌、实罐灭菌。实罐灭菌无需专门的灭菌设备，灭菌效果可靠，对灭菌用蒸汽要求低(0.1-0.3MPa)。实罐灭菌是中小型发酵罐常采用的一种培养基灭菌方法。在进行培养基灭菌之前，通常先把发酵罐空气分过滤器灭菌并用空气吹干。进料后，开动搅拌以防止沉淀。然后开启蒸汽阀，缓慢引进蒸汽，使料液升温至80?左右后关闭蒸汽阀门。开三路(空气、出料、取样)进汽阀，开排汽阀。当温度升到110?时，控制进出汽阀门直至121?(表压0.1-0.15MPa) ，开始保温，一般保温20min。保温结束后，关闭过滤器排气阀、进气阀。关闭蛇管下水道阀，开启冷却水进回水阀。待罐压低于过滤器压力时，开启空气进气阀引入无菌空气。随后引入冷却水，将培养基温度降至培养温度。 2.5.4分批灭菌的操作方法 首先确认蒸汽发生器的各开关都处于正常状态，向发酵罐内加入水，将蒸汽发生器打开，然后检查发酵罐的各个开关是否都处于关闭状态。清洗罐内，用自来水冲洗，并且取下pH电极，pH电极使用前要进行校正，校正方法与一般电极相同，校正完成后插上电极。确认排料口已经关闭，向罐内注入培养基， 第 8 页 中北大学2014年发酵工程课程设计说明书 然后旋紧加料口盖，打开搅拌，搅拌速度为200r/min。打开蒸汽发生器的蒸汽输出阀门，打开发酵罐的蒸汽通路总阀和排料口的蒸汽阀，排尽管路中残存的冷凝水，等出料口只有水蒸汽冒出时，就说明冷凝水排尽，此时关闭排料口的蒸汽阀门，打开通入夹套中的蒸汽阀门，与排污阀，控制夹套中的压力，使其处于0.11MPa左右，罐内的温度会迅速上升，等温度达到95?时就可以关闭搅拌了，此时罐内的培养基已经沸腾无需搅拌，混合的效果已经很好，同时要开始控制罐顶端的排气阀，先全开，以排尽罐内的空气，然后适当关小此阀，使罐内的压力略大于大气压。当温度达到121?时，实罐灭菌开始计时，同时控制罐压和夹套内的压力，温度才能维持在121?。 至此，实罐灭菌过程完成。 2.5.5空气除菌 大多数生物培养基都需要氧气，通常以空气作为氧源。根据国家药品生产质量管理规范(GMP)的要求，生物制品、药品的生产场地业需要符合空气洁净度的要求。过滤是空气除菌的主要手段，按过滤介质孔隙将空气过滤器分为两类:绝对过滤和相对过滤。过滤介质有棉花、玻璃纤维、活性碳等。 2.5.5.1过滤除菌流程及设备 流程如下:采风塔——空气粗过滤器——空气压缩——机储气罐——冷却器——旋风分离器——冷却器——丝网除沫器——空气加热器——总空气过滤器。 设备如下: (1)采风塔:采风塔建在工厂的上风头，高至少10米，气流速度8m/s。 (2)粗过滤器:主要作用是拦截空气中较大的灰尘以保护空气压缩机，同时起一定的除菌作用，减轻总过滤器的负担。 (3)空气压缩机:作用是提供动力，以克服随后各设备的阻力。 (4)空气储罐:作用是消除压缩空气的脉动。 要求:H/B=2,2.5 , V=(0.1,0.2)V1 其中，H为罐高;B为罐直径; 5 V为空压机每分钟排气量(20?，1×10Pa状况下)。 1 (5)旋风分离器:是利用离心力进行气-固或气-液沉降分离的设备。作用是分离空气中被冷却成雾状的较大的水雾和油雾粒子。 第 9 页 中北大学2014年发酵工程课程设计说明书 (6)冷却器:空压机出口温度气温在120?左右，必须冷却。另外在潮湿的地域和季节还可以达到降湿的目的。 (7)丝网除沫器:可以除去空气中绝大多数的20µm 以上的液滴和1µm以上的雾滴，一般采用规格为直径0.25?×40孔且高度为150?的不锈钢丝网。 (8)空气加热器:列管内走空气，管外走蒸汽。 (9)总过滤器:填充物按下面顺序安装:孔板?铁丝网?麻布?活性炭?麻布?棉花?麻布?铁丝网?孔板。介质要紧密均匀，压紧一致，上下棉花层厚度为总过滤层厚度的1/4,间活性炭层为1/3。 空气除菌的目的是出去空气中的微生物，关键在于保证介质的干燥，要求空气湿度小于50%。气净化系统流程，如图2-2所示。 图2-2 空气净化系统流程图 2.5.5.2无菌空气的检测 现在采用的无菌实验方法有肉汤培养法、斜面培养法和双碟培养法这里我们采用斜面培养法来检查。具体方法如下: 500 mL三角瓶内装斜面培养基50mL,其组成为可溶性淀粉2,，黄豆饼粉1,，KHP0 0(25,，NaCI 0.2,，MgS00(05,，CaC0 0(3,，琼脂1(8,，2443 pH 6.5,7.0，接种后置旋转式摇床，(30?1)?下培养28h左右备用。接种于斜面上，培养24h后观察有无菌落。 2.6种子扩大培养 种子扩大培养是指将保存在砂土管、冷冻干燥管处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养而获得一定数量和质量的纯种的过程。本发酵属于一级种子罐扩大培养，二级发酵。设计流程如下: 菌种——锥形瓶——种子罐——发酵罐 第 10 页 中北大学2014年发酵工程课程设计说明书 2.6.1生产车间种子制备 将生产菌种悬浮液用火焰接种法接入种子罐进行扩大培养，种子罐接入发酵罐采用压差接种法。 种子罐级数确定的原则: ?保证种子量足够，满足生长需求。 ?尽量减少级数，简化工艺，减少污染。 种子罐培养的目的是使种子量增大，以缩短发酵罐的发酵延滞期。大肠杆菌基因工程菌，因其生长速度较快，产苏氨酸采用一级种子罐，也称二级发酵。若取接种量为10,。种子罐用一个。种子罐的体积按照接种量来确定 2.6.2影响种子质量的因素 影响种子质量的因素有原材料的质量，培养条件(温度、湿度、通气量)和斜面冷藏时间。生产过程中经常出现种子质量不稳定的现象，其主要原因是原材料质量波动。原材料质量的波动，起主要作用是其中无机离子含量不同。种子质量的控制可以通过菌种稳定性检查，无菌检查，保证原材料质量和控制培养条件等。 第 11 页 中北大学2014年发酵工程课程设计说明书 3发酵过程的工艺控制 3.1 发酵过程技术原理 微生物发酵过程可分为:分批发酵、补料-分批、半连续(发酵液带放)和连续发酵。分批发酵是一种准封闭式系统。连续发酵是在发酵过程中一边补入新鲜的料液，一边以相近的流放速放料，维持发酵液原来的体积。本生产采用补料-分批发酵，即在分批发酵(一次性加入发酵罐内等发酵完全后放罐)的基础上，加入新鲜的料液，也克服由于养分的不足导致发酵过早结束。 3.1.1补料的控制 在发酵培养基培养12h后，当总糖浓度低于5.5%时，开始补料，后每4小时补一次,每次10-15L。发酵培养基培养10h,18h，控制总糖浓度6.5%,8.5%。发酵培养基培养19h,24h，控制总糖浓度5.0%,6.3%。发酵培养基培养40h后，控制总糖浓度4%,5%。当pH小于6.7时，补加氨水，使pH维持在6.7左右，控氨水平在45mg/100ml以上。 3.2发酵条件的影响 苏氨酸的发酵生产水平取决于生产菌种的特性和发酵条件(包括培养基)的控制)。其中发酵条件包括:发酵温度、溶氧、PH、培养基营养成分等。 3.2.1初始pH对苏氨酸影响 初始pH值影响菌件对基质的利用速度和细胞的结构状态，以致影响菌体生长速度和代谢产物的变化。对pH值的适应范围缺定于微生物的生忐学，每种微生物都有自己的生长最适pH值，如果培养液的pH值不合适，则微生物的生长就要受到影响。不仅不同种类的微生物对pH值的要求不同，就是同一种微生物，由于pH值的不同也可能形成不同的产物。另外，微生物生长的最适pH值往往不一定相同。苏氨酸生产菌的最适pH为7.0，菌体的呼吸作用最强。 3.2.2温度对苏氨酸发酵的影响 菌体的生长和合成抗生素的代谢活动都是在各种酶的催化下进行的，然而酶的催化作用需要有适当的温度。从酶反应动力学来看，随着温度的升高，酶的活性加强，反应速率加大，生长代谢加快，抗生素分泌期提前，但温度过高，则酶易失去活性，菌体易迅速衰老，发酵周期缩短，抗生素产量就降低，因此维持产 第 12 页 中北大学2014年发酵工程课程设计说明书 生菌的生长和合成抗生素所需要的最适温度是苏氨酸发酵的重要条件。研究表明, 大肠杆菌最适温度为37度，在发酵中后期，温度转换至39?对L-苏氨酸发酵有促进作用。 3.2.3溶氧对苏氨酸发酵的影响 对于好氧发酵，溶解氧浓度是最重要的参数之一。微生物深层培养时，需要适量的溶解氧以维持其呼吸代谢和某些产物的合成，氧的不足会造成代谢异常，产量降低。微生物发酵的最适氧浓度与临界氧浓度是不同的。前者是指溶解氧浓度对生长或合成有一最适的浓度范围，后者一般指不影响菌体呼吸所允许的最低氧浓度。为了避免生物合成处在氧限制的条件下，需要考察每一发酵过程的临界氧浓度和最适氧浓度，并使其保持在最适氧浓度范围。 溶氧对发酵的影响及其控制:工业发酵微生物多数为需氧菌，少数为厌氧菌;需氧菌发酵过程，发酵液中溶氧浓度的控制是重要的控制参数之一;对维生素发酵来说，氧的供给更为重要。溶氧异常下降可能原因有:一是污染好气性杂菌，消耗大量溶氧;二是菌体代谢发生异常现象，需氧要求增加，使溶氧下降;三是某些设备或工艺控制发生故障或变化，引起溶氧下降等。本设计为需氧发酵需通入较多无菌空气。 本设计中要求溶氧为20%，通过控制罐压和通气量进行调节。 3.2.4发酵过程泡沫的控制 起泡会带来许多不利因素，如发酵罐的装料系数减少，氧传递系统减少等。泡沫过多时，影响更为严重，造成大量逃液，发酵液从排气管路或轴封逃出而增加染菌机会等，严重时通气搅拌也无法进行，菌体呼吸受到阻碍，导致代谢异常或菌体自溶，所以，控制泡沫是保证正常发酵的基本条件。 泡沫的控制，可以采用两种途径:1调整培养基中的成分(如少加或缓加易起泡的原材料)或改变某些物化参数(如pH值、温度、通气和搅拌)或者改变发酵工艺(如采用分次投料)来控制，以减少泡沫形成的机会。但这些方法的效果有一定的限度;2采用机械消泡或消泡剂消泡这两种方法来消除已形成的泡沫。还可以采用菌种选育的方法，筛选不产生流态泡沫的菌种，来消除起泡的内在因素。 第 13 页 中北大学2014年发酵工程课程设计说明书 3.3发酵终点的判断 判断放罐的指标有:产物浓度，过滤速率，菌丝形态，氨基氮，pH，DO,发酵液的年度和外观。一般，菌丝自溶前总有些迹象，如氨基氮，DO和pH开始上升，菌丝碎片增多，黏度增加，过滤速率下降。 图3-1 分批补料发酵过程曲线 查阅资料显示，在实验室条件下，各个条件都为最优时，发酵终点苏氨酸产量为 118. 9g/L。在工业条件下我们选终点产量为70g/L。 3.4染菌的控制 在工业发酵中，染菌轻则影响产品的质和量，重则倒罐，颗粒无收，严重影响工厂的效益。因此要采取一些防治措施。控制染菌可以通过降低培养温度，调整补料量，调pH值，缩短培养周期等措施予以补救。 可能出现的异常发酵现象: (1)培养基变稀:可能是噬菌体污染或营养成分缺乏; (2)培养基过浓:会抑制微生物的生长，考虑可能是污水污染; (3)耗糖较慢:可能原因是种子生长能力降低，检测种子是否衰退，发酵条件是否合适，以及营养成分是否全面，尤其注意缺磷; (4)pH值不正常:用缓冲对来调节，检查是否染杂菌，碳氮比是否合适; (5)生长缓慢:最可能的原因就是营养成分不足。 一旦染菌根据染菌情况放灌或调节各种因素使发酵条件远离杂菌，例如: 第 14 页 中北大学2014年发酵工程课程设计说明书 1)(前期染菌，重新灭菌，补充新鲜培养液; 2)(中期染菌，偏离杂菌的生长条件; 3)(发酵后期染菌，提前放罐。 污染噬菌体常表现在发酵液变稀，DO迅速回升。处理方法:灭菌放罐，清除生产环境，调换生产菌株，停产整顿(极其严重情况下)，选育抗性菌。 因此，发酵过程应严格按照无菌操作的步骤进行杜绝染菌的发生。 第 15 页 中北大学2014年发酵工程课程设计说明书 4 发酵罐的设计 4.1发酵罐标准尺寸 因为大肠杆菌为兼性厌氧菌，发酵苏氨酸时为有氧发酵，故发酵过程中需要用到通风设备，因而采用机械搅拌通风发酵罐。常用的机械搅拌通风发酵罐的结构和主要几何尺寸已标准化设计。其几何尺寸比例如下: H/D=1.7,3.5; 0 H/D=2,5; d/D=1/3,1/2; W/D=1/12,1/8; B/D=0.8,1.0; h/D=1/4; 单位全部为m。 发酵罐大小用公称体积表示，其中: 23V(公称体积)=V(筒身容积)+V(底部)??DH/4+0.15D 0ab0 H-发酵罐圆柱形筒身高度 0 D-发酵罐内径 H-罐顶到罐底的高度 d-搅拌器直径 W-挡板宽度 B-下搅拌器距罐底的距离 h-底封头或顶封头高度 4.2发酵罐的计算 利用大肠杆菌发酵年产五万吨的苏氨酸，产品纯度99% ，年生产日期为260天。发酵周期包括发酵时间和辅助时间，发酵时间根据菌种的特性定为60h，辅助时间为27h，其中包括灭菌总时间为3h，清洗及维修发酵罐总时间为24h,总发酵周期为87h，为4天。发酵终点目标产物含量为70g/L，发酵液预处理收率约为90%，提取时收率约为92%，浓缩干燥收率为93%，装料系数为75%，倒罐率为0.001。 第 16 页 中北大学2014年发酵工程课程设计说明书 总提取率为:90%×92%×93%=77.0% 产品实际总产量=设计产量×纯度/总提取率=5000/99%/77%=6559.1kg 年生产批次(批) = 年生产日期/发酵周期=260/4=65 每批次发酵液体积(L)=年实际发酵液质量/(年批次×终点目标产物含量) =6559.1/(65×70) =1443L 根据装料系数粗算， 发酵罐的公称体积=每批次发酵液体积/装料系数 =1443/0.75=1924(L) 则需V=2000L的发酵罐1个 0 23 由V(公称体积)=V(筒身容积)+V(底部)??DH/4+0.15D，得 0ab0 D=0.94m(H=2.5D) 0 那么: H=2.5D=2.5×0.94=2.35 m 0 H=3D=3×0.94=2.82 m d=D/2=0.5×0.94=0.47 m W=D/12=0.94/12=0.078m 0.94=0.846 m B=0.9 D=0.9× h=D/4=0.94/4=0.235m 本发酵过程中选用机械搅拌式发酵罐，国内普遍采用六弯叶或六箭叶圆盘涡轮式，本设计中因罐小要求加强轴向混合，故选用六箭叶圆盘涡轮式。 第 17 页 中北大学2014年发酵工程课程设计说明书 5物料衡算 5.1 总物料衡算 本系统采用1个发酵罐，体积为2m3，苏氨酸发酵终点含量70g/L, 发酵液预处理收率约为90%，提取时收率约为92%，浓缩干燥收率为93%，装料系数为75%。则: 发酵罐在一个发酵周苏氨酸产量为: 2×70×90%×92%×93%×0.75=80.85(kg) 那么1个发酵罐1年的总产量为: 80.85×65=5255.25(kg)=5.255(t) 故符合年产量为五吨的生产要求。 5.2 原料用量计算 表5-1 维生素C发酵工艺指标如下表所示 指标名称 单位 指标数 生产规模 t/a 5 年生产天数 d/a 260 产品质量 99% 发酵周期 h 4d 发酵时间 h 60 发酵辅助时间 h 27 发酵罐装料系数 % 0.75 提取总收率 % 77 生产批次 批 65 5.2.1 发酵罐原料计算 发酵培养基配方如下(%): 葡萄糖12~14， 玉米浆3.0， (NH) SO 3.5 ， KHPO 0.1， 424 24MgSO 0.1， CaCO 2，以NaOH调pH至7。 43 本设计选的2000L发酵罐装料系数为0.75，则发酵料液=2000×0.75=1500L 2000L发酵罐每周期葡萄糖用量=1500×14%=210kg 第 18 页 中北大学2014年发酵工程课程设计说明书 2000L发酵罐每周期玉米浆用量=1500×3%=45 kg 2000L发酵罐每周期CaCO用量=1500×2%=30kg 3 2000L发酵罐每周期KHPO用量=1500×0.1%=1.5kg 24 2000L发酵罐每周期(NH4)2SO4用量=1500×3.5%=52.5 kg 2000L发酵罐每周期MgSO用量=1500×0.1%=1.5kg 4 表5-2 发酵物料衡算汇总表 成分 每批次用量/kg 年用量/kg 葡萄糖 13650 210 玉米浆 2925 45 (NH)SO 3412.5 52.5 424 MgSO 97.5 1.5 4 KHPO97.5 1.5 24 30 CaCO 1950 3 5.2.2种子罐的物料衡算 1% 10% 二级发酵罐 三角瓶 一级种子罐 图5-3 接种量示意图 首先将各级发酵罐培养基体积求出，设二级发酵罐培养基的体积为V，一3级种子罐培养基的体积为V，三角瓶内种子液的体积为V，并按每批次所用的21量进行计算。则有: V = 2000L 3 V = 2000×10%=200L2 V = 200×1%= 2L 1 一级种子罐装料系数定为0.8，则需250L一级种子罐1个。 一级种子培养基成分 葡萄糖3.5， 玉米浆1.5， (NH)SO 0.5， MgSO 0.05， 4244KHPO 0.1， CaCO 1。 243 第 19 页 中北大学2014年发酵工程课程设计说明书 表5-4 一级种子罐培养基内各成分用量表 成分 每批次用量/kg 年用量/kg 葡萄糖 7 455 玉米浆 3 195 (NH)SO 1 65 424 MgSO 0.1 6.5 4 KHPO0.2 13 24 130 CaCO 2 3 5.2.3 补料培养基的物料衡算 补料培养基成分 葡萄糖 15 玉米浆 3.0 (NH) SO 2.0 424 补料每个批次部150L，分十次补完。 表5-5 补料培养基内各成分用量表 成分 每批次用量/kg 年用量/kg 葡萄糖 22.5 1462.5 玉米浆 4.5 292.5 (NH)SO 3 195 424 第 20 页 中北大学2014年发酵工程课程设计说明书 6下游加工 下游加工过程是生物工程的一个组成部分，是生物化工产品通过微生物发酵过程、酶反应过程或动植物细胞大量培养获得，以上述发酵、反应液或培养液分离、精制有关产品的过程。下游加工过程可分为4个阶段:?发酵液的预处理和固液分离;?细胞破碎;?初步纯化(提取);?高度纯化(精制)。 6.1发酵液的预处理和固液分离 发酵液预处理和固液分离的目的:分离菌体和其他悬浮颗粒(细胞碎片、核酸和蛋白质的沉淀物);除去部分可溶性杂质和改变滤液性质，以利于提取和精制的顺利进行。 发酵液的预处理:采用理化方法设法增大虚浮液中固体粒子的大小、或降低粘度，以利于过滤。去除会影响后续提取的高价无机离子。(一)预处理的方法?高价无机离子的去除方法;?杂蛋白质的去除;?发酵液的凝聚和絮凝。 苏氨酸的提取与结晶 a、将L-苏氨酸发酵液经灭菌后进入金属微滤膜进行微滤，除去菌体蛋白杂质，得到澄清的L-苏氨酸发酵液;所述金属膜采用不锈钢管式膜分离系统，其孔径为50nm,100nm，截留分子量2000,50000MW，pH范围0,14，操作温度为0,80?，操作压差为0.1,1.0MPa; b、将上步得到澄清的L-苏氨酸发酵液调整pH为3.0,9.0，加入活性炭进行脱色，活性炭加入量为发酵液体积的0.2,2,，脱色温度为10,80?; c、将上步脱色后的L-苏氨酸发酵液进行减压蒸发，浓缩体积至原液的20,,80,; d、浓缩液调pH为3.0,9.0，搅拌转速为0,300rpm，结晶0-20h，过滤、洗涤得到L-苏氨酸晶体和母液; e、将d步所得晶体溶于蒸馏水中，使L-苏氨酸浓度达到16,20,，加入等体积95,乙醇，搅拌转速为0,300rpm，养晶0-20h，可得精制L-苏氨酸结晶。 6.2发酵液残液的处理 由于本设计采用的是基因工程菌，残夜的直接排放会对环境造成不可预测的影响，因此需要对发酵液残液进行灭菌无害化处理，灭菌方法与培养基灭菌方法 第 21 页 中北大学2014年发酵工程课程设计说明书 一样，将残液加压加热达到121度，保持25到30分钟，使发酵液中的细菌灭亡。 6.3离心 离心机是一种分离机械，其作用是将固体和液体的混合液(液体和液体)进行分离，从而分别得到固体和液体(或液体和液体)。 本次设计采用多个三足式离心机联合的方式离心，三足式离心机是用途最广泛离心机，广泛用于各行各业，至今天仍在全世界范围内广受欢迎，其造价低廉，抗震性好，结构简单，操作方便。 6.4 干燥 生物工业产品干燥通常采用沸腾干燥、气流干燥、喷雾干燥。 1.沸腾干燥 沸腾干燥也叫做流化干燥，是流化技术在药物干燥中的新发展。所谓流化床，是指在一个设备中，将颗粒物料堆放在分布板上，当气流由设备的下部通入床层，随着气流速度加大到某种程度，固体颗粒在床内就会产生沸腾状态，这种床层就称为流化床。采用这种方法进行干燥的则称为流化床干燥。特点:利用热空气与粉、粒状湿物料在流动中充分接触，剧烈地相对运动，使气体与固体物料之间进行传热与传质，从而获得干燥的物料。干燥时间短，一般1~5秒。沸腾干燥一般适用于6mm~30um颗粒物料进行干燥，同时要求被干燥由于水分存在而产生结团现象不严重的场合。所以，沸腾干燥常作为经过气流干燥或喷雾干燥之后的物料做进一步干燥之用。 2.气流干燥 干燥原理:被加热以后的空气在管道内快速流动，湿物料进入管道后被高速气流带走向管道出口运行;这个过程中由于对流传热传质的作用同时水蒸汽被蒸发。由于物料进入管道后被高速气流冲散二者充分混合，通常在管道出口使用旋风分离器进行气固二相得分离。气流干燥一般干燥的时间在1秒左右。 气流干燥主要优缺点:气流干燥在我国是一种应用最广发最久远的干燥器，随着不同新型气流干燥器的开发成功，气流干燥我干燥领域方兴未艾。由于干燥时间短适合容易受高温变质物料的干燥;不适合粘性大的物料干燥，管道较厂一般超过20米，安装的限制制约了其发展。 气流干燥器的主要缺点在于干燥管太高，为降低其高度，近年来出现了几种新型的气流干燥器:?多级气流干燥器。将几个较短的干燥管串联使用，每个干 第 22 页 中北大学2014年发酵工程课程设计说明书 燥管都单独设置旋风分离器和风机，从而增加了入口段的总长度。?脉冲式气流干燥器。采用直径交替缩小和扩大的干燥管(脉冲管)，由于管内气速交替变化，从而增大了气流与颗粒的相对速度。?旋风式气流干燥器。使携带物料颗粒的气流，从切线方向进入旋风干燥室，以增大气体与颗粒之间的相对速度，也降低了气流干燥器的高度。 3.喷雾干燥 喷雾干燥是系统化技术应用于物料干燥的一种方法。于干燥室中将稀料经雾化后，在与热空气的接触中，水分迅速汽化，即得到干燥产品。该法能直接使溶液、乳浊液干燥成粉状或颗粒状制品，可省去蒸发、粉碎等工序。 优点是干燥过程非常迅速，可直接干燥成粉末，易改变干燥条件，调整产品质量标准;由于瞬间蒸发，设备材料选择要求不严格;干燥室有一定负压，保证了生产中的卫生条件，避免粉尘在车间内飞扬，提高产品纯度;生产效率高，操作人员少。 依据多得产物原则，本设计选用旋风式气流干燥器对苏氨酸进行干燥。 第 23 页 中北大学2014年发酵工程课程设计说明书 7后记 通过此次课程设计，使我更加扎实的掌握了有关发酵控制方面的知识，在设计过程中虽然遇到了一些问题，但经过一次又一次的思考，一遍又一遍的检查终于找出了原因所在，也暴露出了前期我在这方面的知识欠缺和经验不足。实践出真知，通过亲自动手制作，使我们掌握的知识不再是纸上谈兵。 过而能改，善莫大焉。在课程设计过程中，我们不断发现错误，不断改正，不断领悟，不断获龋最终的检测调试环节，本身就是在践行“过而能改，善莫大焉”的知行观。这次课程设计终于顺利完成了，在设计中遇到了很多问题，最后在老师的指导下，终于游逆而解。在今后社会的发展和学习实践过程中，一定要不懈努力，不能遇到问题就想到要退缩，一定要不厌其烦的发现问题所在，然后一一进行解决，只有这样，才能成功的做成想做的事，才能在今后的道路上劈荆斩棘，而不是知难而退，那样永远不可能收获成功，收获喜悦，也永远不可能得到社会及他人对自己的认可! 回顾起此课程设计，至今我仍感慨颇多，从理论到实践，在这段日子里，可以说得是苦多于甜，但是可以学到很多很多的东西，同时不仅可以巩固了以前所学过的知识，而且学到了很多在书本上所没有学到过的知识。通过这次课程设计使我懂得了理论与实际相结合是很重要的，只有理论知识是远远不够的，只有把所学的理论知识与实践相结合起来，从理论中得出结论，从而提高自己的实际动手能力和独立思考的能力。在设计的过程中遇到问题，可以说得是困难重重，但可喜的是最终都得到了解决。此次设计也让我明白了思路即出路，有什么不懂不明白的地方要及时请教或上网查询，只要认真钻研，动脑思考，动手实践，就没有弄不懂的知识，收获颇丰。 在本次设计过程中高莉老师，贾万利老师及王芳老师给予了大力指导和帮助和支持，这才使得我能够顺利地完成课程设计。在此，我对课程设计所有老师表示诚挚的感谢～ 第 24 页 中北大学2014年发酵工程课程设计说明书 参 考 文 献 [1] 吴思方 .发酵工厂工艺设计概论.中国轻工业出版社，1900 [2] 张濂 .化学反应工程原理.华东理工大学出版社，2007 [3] 俞俊棠，唐孝宣，邬行彦(新编生物工艺学(上、下册)(北京:化学工业出版社，2005 [4] 韦革宏,杨祥.发酵工程.北京:科学出版社,2008 [5] 蒋新龙.发酵工程.浙江:浙江大学出版社,2011 [6] 张卉.微生物工程.北京:中国轻工业出版社,2010 [7] 葛绍荣,乔代蓉,胡承.发酵工程原理与实践.上海:华东理工大学出版社,2011 第 25 页 中北大学2014年发酵工程课程设计说明书 第 26 页