新型根管充填剂——复方牡蛎粉的生物相容性的研究

新型根管充填剂——复方牡蛎粉的生物相容性的研究 青岛大学 硕士学位新型根管充填剂——复方牡蛎粉的生物相容性的研究 姓名:刘梦冬 申请学位级别:硕士 专业:口腔临床医学 指导教师:邓婧钟德钰 20060513 , ,,,,,, 新型根管充填剂——复方牡蛎粉生物相容性的研究 研究生 刘梦冬 导师 邓婧 摘 要〔目的〕评价一种新型根管充填剂——复方牡蛎粉的生物相容性。〔〕参照国际标准化组织发布的关于医用材料的评价标准(上,, ,嗍)以及医疗器械和生物材料生物学评价试验指南(，,, ,嗍,,)所推荐的生物学和动物试验，应用、，,,细胞作为实验细胞，以新型根管充填剂复方牡蛎粉的粉剂及粉液混合物的浸提液为实验组，,(,,的苯酚为阳性对照组，用,～,,法评价其细胞毒性。应用材料浸提液为实验组，丝裂霉素;为对照组，以,,,细胞中所形成的微核数作为标准，应用体外微核试验评价其基因毒性。将实验材料埋置入动物皮下组织内，设空白对照组，在不同时相点取材，行大体标本和病理组织切片观察，评价其局部刺激性。采用皮肤致敏试验的最大剂量法，即选用健康白色豚鼠，分别于皮内注射生理盐水、材料浸提液、,,甲醛溶液，,周后进行二次致敏，于末次致敏后第,,天进行激发接触，分别于,,小时、,,小时、,,小时后观察有无红斑、水肿现象，并计算致敏率。〔结果〕在细胞毒性实验中，实验组的,订值在各个时间段与阴性对照组均无显著性差异 (,，,,(,,)。基因毒性实验中，实验组与阴性对照组所形成的微核数无显著性差异(,,,(,,)，而与阳性对照组有显著性差异(,,,。,,)。动物皮下植入根充材料后，组织炎症反应甚微，实验组与对照组无明显差别限,(,,)。病理组织切片示材料周围的包裹组织，其炎性变化符合一般的炎症变化转归规律。皮肤致敏试验显示该材料无明显致敏性。〔结论〕本实验显示新型根管充填毒～，复方牡蛎粉无细胞毒性、无基因毒性、无皮肤致敏性以及局部刺激性，具有良好的生物相容性。关键词:根管充填材料; 生物相容性; 牡蛎粉; 羧甲基壳聚糖 ,,,;伽,,,,,,, ,,,,, ,, ;,,,,,,,, ,,,,,, ,,枷,,,,, ,, , ,,, ,?, ,,舱, ,哳,, ,,,,,,, ,,,,,瑚,,,,, ,,，,,,,, ,,, ,蛐,,明, ,,;，,,,, ,,?, ,,?, ,,,,，鼍;, 旧,,,“,,,】,, ,,,,,,,, ,,, ,,,;,,,,,,,脚,, ,,, ,,,, ;,,叫衄咄,,，,砌( 眦,山,,,】,;;,,,吨,, ,; ,,“,,,,, ;,,，,,,, ,, ,;,,;,, ,,,,,,,，,，,,,，,,,卸,柚,,,,仃,,，, ，,;,衄,,王,,面，,, ,,,,,，血, ,,仃,;,, ,, ,,啊,盯,,,, ,,,也, ,奴重,,,, ,, ,,,?,,瑚,,,:,,, ,,,, ,,,,,, ,,,?,,;,, ,,, ,;,,咖,勰山,,,,,, ,,, ;,, ,,,眦,?,;,,,,?,(,, ,,,,,?, 啪, ,?, ,,山,,,,, ;,,,,,,柚,,,, ,,,?,勰,,,,,,,,,,, ;,,仃,,(,,,,,瓣,,,,, ,,,,,,,,,, ,，,, ,,,,,, ，, ,,,，,,,, ;,,,,,】【,; ,位;,(, ,,; ,,,;姗,;,,,, ,,,, ,, ,,,,,四，,, ,,,,,,;,, ,(,讧,) ,勰,,,,勰,,, ,,,,,,, ;,,,，,,，也, ,岫,,, ,, ,,唧,,,,, ,勰,,,, ,, ,,,商,,,,,, ,,, ,,, ,;,;;,,,, ,,擘,,,,,面;,够,,, , ,,， ;,,,,丘,王,,, ,,蜘,, ,,, ,,纠,,,,, ,,,量,, ,,,;,,田,?,,石,,,, ,, ,,,,(,,?,,,,柚, ,,,，,;,,,,,;,, ,瑚,,,,廿。地,, ,,,,,,,,， ,,;,,,矗,,,, ,,瑚,,,,,,, ,,,, ,,,,皿,, ,, ,,丘,,,?; ,,,,,(,?,,, ,,,, ,,,,,出,,?,, ,;,,，,,, ,,,,,,,,,,,, ,,血,, ,舾,,,;;;,,(,,粤,,,,, ?,舯呻(,(,,,,,,,,,,舒;,, ,,,,,,,?,,,衄,,,,,,,, ,,,,细,,,也, ,,仃,;,,,, ,,眦,,,,,, ,,,, 侧,;，,, ,,,,;;?,,,, ,,,, ,,,,,, ,, ,，,,,,,?,,昂叩,,,, ,,, ,,,,, ;,,,,,,,,, ,, ,,,,;,, ,,,,;曲, ,,明,，;,,,,,?,, ,,, ,,, 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,,,,,,( ,,,,,,,,,,,,, ;,,,,?“ 引言 引 言 牙髓病和根尖周疾病是口腔内科的常见疾病，该类型疾病以疼痛剧烈为特征，严重影响患者的饮食，休息和工作。目前国际公认的治疗该类疾病的最有效方法是根管治疗术。随着牙科材料及器械的发展，现代根管治疗术将重点放在 了根管预备和根管充填上。只有充分、有效而严密的根管充填才能达到根管治疗的最终目的一一治疗或预防根尖周疾病的发生。而根管治疗术的治疗效果与所采用的根管充填剂的性能戚戚相关。目前用于根管充填的材料有许多种，近年来随着我国与国际口腔医学界交流的不断增加，不同种类的根管充填材料相继进入我国，其具有较好的生物相容性及易操作性，但是由于其昂贵的价格，限制了在我国的广泛使用。而我国牙医目前常用的根管充填剂多为:氧化锌丁香油糊剂、根管充填糊剂，酚醛树脂等，虽然价格低廉，但有不少缺陷。 缺陷主要有:(,)有一定的刺激性，治疗后相当一部分病人有不同程度的疼痛，如酚醛类物质的制剂。(,)多数根管充填材料为油性材料，不溶于水，无法与潮湿的根管壁紧密接触，之间留有微缝隙导致根管密封性欠佳，操作时根管需擦干，且需要对牙胶尖进行侧压或垂直加压，操作费时费力，如氧化锌丁香油酚。(,)对根尖周有骨吸收的组织无促进骨形成的作用。(,)无持续的根管消毒作用。 鉴于上述缺陷，本课题致力于探寻一种生物相容性好，价格低廉、便于推广应用的根管充填剂。 本实验开发的新型根管充填材料的主要成分为牡蛎粉和羧甲基壳聚糖。 羧甲基壳聚糖(;,,,,,,,,,,,, ;,,,,,,,，;,;,,)是壳聚糖(;,,,,,,,)分子中引入羧甲基得到的一种水溶性壳聚糖衍生物，目前对它的理化特性和 镅 匦砸延行矶嘌芯浚 哂辛己玫纳 锵嗳菪裕 咕 裕 怪琢龌钚缘取, 宜 芍苯幼饔糜诠悄赶赴 俳 浞只 凸强笪镏实暮铣桑 岣呒钚粤姿崦傅幕钚裕 铀俟腔 实 泽宙 醪轶弑ん卫菟荏踝螅?蚕刂保桑磐此芸垢腥镜募训 男纬珊托薷醋饔谩, ,毡橛τ糜谕饪剖质醴旌舷摺?接梅罅希 鹎祷菏 ?蹲乖诳谇灰窖е校 延醒д哐腥萜湓诰蚨凰驽剩《 湛 镭 捣矫娴挠τ每冢薄?阵鱼瞒 牡蛎粉是海洋甲壳类动物牡蛎的外壳研磨所形成韵粉剂。其主要成分是以碳酸钙为主，含多种微量元素与氨基酸的复合物，其组成与根管壁的成分相近，可提供 。大量的钙离子。 以牡蛎粉为粉剂，羧甲基壳聚糖为液剂，将两者调绊成糊剂。通过前期实验应用该糊剂型童签堑堂堑壑筻充茧(,强翔堙娃班难雠旦～』型,越直～遍垫堡墼野，而且,—,,阻射，另外此材料属于水溶性材料，在根管峦填前不必擦干根管，节省 青岛大学硕士学位论文了临床操作时间。羧甲基壳聚糖还具有良好的生物降解性，可作为药物的包裹材料及载体，提高药物稳定性，控制药物的释放，现己被广泛应用于缓释药物的研制。另外，羧甲基壳聚糖本身就对多种口腔重要厌氧菌有抑制作用【,,，如果制备成缓释根管充填材料，可保证根管充填后较长的时间内保持根管内的无菌状态。因此复方牡蛎粉根管充填材料具备根管充填剂应具备的一些特性，将其应用于根管治疗有着良好的理化性能和生物学基础。同时，牡蛎粉和羧甲基壳聚糖是天然的海洋生物制剂，来源极为丰富，作为一种新型根管充填材料的研发应用，具有巨大的社会效益和经济效益。检索国谕馕南祝 形捶?制溆糜诟 艹涮畹奈南住?任何一种医用材料应用于临床，不仅需要具备与机体组织相匹配的理化特性，还应首先具备良好的生物相容性，这是医用材料获准,临床使用的前提。根据国际标准化组织发布的关于医用材料的评价标准(，,, ,,,,,)，根管充填材料属永久性的植入材料，应具有良好的生物相容性。新型根管充填材料在临床使用前，必须进行生物相容性。 本实验参照医疗器械和生物材料生物学评价试验指南(，,,(,,,,,(,)选择规定的相应试验，应用,,,【,,(,，,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,一,,)(,，,,,,,,,,,,(, ,,,,,,,,,, ,,,,,,,，全称为溴化(,一(,，,—,甲基噻唑基(,)(,，,(二苯基四唑，又名四甲基偶氮唑盐】微量酶反应比色法评价其细胞毒性(;,,,,,,,;,,,)，体外微核试验评价其基因毒性 (,,,,,,,,;,,,)，最大剂量试验评价其皮肤致敏性(,“, ,,?,,,,,,,,,,)，皮下埋植试验评价其局部刺激性(,,,,;,, ,?,,,,,,,)，对复方牡蛎粉生物相容性进行评价，验证其应用于根管治疗的可行性。 第一章材料与方法 第一章(材料与方法,(, ,,,比色法评价细胞毒,陛 ,(,(,材料与试剂 实验组:复方牡蛎粉根管充填剂(原材料由青岛海洋大学提供)，分为粉液两组分。 阴性对照组:,,,,,,,,培养基(,，,,,，美国) 阳性对照组:,(,,苯酚(,,;,,,)(,,,,,,,,,,,～,;,,,,,，美国) 主要试剂:,,,【,,(,，,一,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,)?,，,一,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,〕全称为溴化一,((,，,(,甲基噻唑基一,)(,，,(二苯基四唑(美国,,,,,公司产，华美生物工程公司分装) 二甲基亚砜(,,,,,,,, ,,,,,,,,,,，,,,,上海金山化工厂生产) ,,,， ,,,,培养基(,，,,,，美国)加入,,,胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司) 青霉素,×,,,,,,，链霉素,×,,,,,,。 ,,,(,,,,,,,,, ,,疵,,, ,,,,,,)粉末(上海西唐生物科技有限公司) ,(,,,胰酶消化液(上海化学试剂采购站分装厂) 细胞株:中国仓鼠肺成纤维细胞(,,,，中国科学院上海生物科学院细胞资源 中心提供)，实验所用细胞为传代,,,生长旺盛的细胞。 实验器材与测试仪器: 一次性微孔滤膜(直径,,,,，孔径,(,孤,，,，,皿,,,，美国) 微量加样器(,，,,，,,,，日本) 酶联免疫测定仪(,,一,,,，美国)(见图,(,) 超净工作台(,,,,,,,,型，苏净集团安泰公司制造) ,,锄细胞培养瓶(;,,,,, ，,;,,,,,,,,, ;,,,,,,，美国) ;,,恒温细胞培养箱(,,,,,,,,,,,,,,;,，美国)(见图,(,) ,,孔细胞培养板(;,,,,,, ，，,;,,,,,,,,, ;,,,,,,，美国)， 细胞计数板，冰箱，电热干燥箱，高压蒸汽锅(山东金华器械厂，,(,,,,,，,,,?)。 ,(,(,方法 配制,,,,,,,,培养液:在,,,,,,三蒸水中含,,,， ,,,, ,,,，葡萄糖,,,，丙酮酸钠,,,,，谷氨酰胺,,,,，碳酸氢钠,,,，青霉素,,万,，链霉素,,万,， , 青岛大学硕士学位论文抽滤灭菌后，加入,,,胎牛血清,,,,,。置于,?冰箱中保存。 配制,,,溶液:将,,;, ,,，,;, ,(,,，,,,,,,, ,(,,,，,,,,,, ,(,,，加入,,,,,, 三蒸水中，抽滤灭菌。置于,?冰箱中保存。 配制,,,试剂:将粉状,(,, ,,,溶于,,,,,新鲜配制,,,溶液，抽滤灭菌。 置于,?冰箱中保存。 材料浸提液制备:根据我国国家标准,,厂,,,,,,(,—,,,,(医疗器械生物学评 价标准第,部分:细胞毒性试验体外法，材料质量与浸提介质体积比)的规定，将 复方牡蛎粉粉液混合固化,,,后的固化物研磨成粉末，与复方牡蛎粉粉剂经高温高 压(,(,,,,,，,,,?)消毒，各取,,分别加入,,,, ,,,， ,,,,培养液中，置,, ?恒温箱内,,,，提取上清液，即成材料浸提液。再以,,,， ,,,,培养液稀释，分 别配 制成,,,、,,,、,,,,浓度的材料浸提液。 细胞相对增殖率及细胞毒性分级的测定:取三块,,孔细胞培养板，每板内有,组，每组四孔，每孔加入相应物质,,吮,。实验分组具体如下:(,)阴性对照组:,,,,,,,,培养液，(,),,,粉剂浸提液，(,),,,粉剂浸提液，(,),,,,粉剂浸提液，(,),,,混合物浸提液，(,),,,混合物浸提液，(,),,,,混合物浸提液， (,)阳性对照组:,(,,苯酚。将中国仓鼠肺成纤维细胞,,,进行体外培养，经过传代达到生长情况稳定。取对数生长期的该细胞，,(,,,的胰酶消化后制成单细胞悬液，以,,,个细胞,,,的细胞悬液分别接种于各试验孔中。 将三块,,孔细胞培养板置,,?、,,;,,培养箱中开放培养,,,，待细胞贴壁，弃去原培养液。再分别以各实验组材料替换(,,,“,,孔)，置,,?，,,,,,细胞培养箱中，各板分别继续培养,、,、,天后，每孔再加入,,,,吮,，继续在,,?条件下培养,,，生成蓝色结晶。吸弃原培养液，每孑,加入,,,缓冲液,,毗,，清洗,次。弃除余液，立即加入二甲基亚砜(,,,,),,,,,孔，室温放置并轻度振荡,,(,,,,,，使结晶物充分溶解。使用酶联免疫检测仪在,,,衄波长处测定各孔的吸光度值 (叩,,;,, ,,,,,,,，,,)。 统计学:运用,,,,,,(,软件包处理数据。同一时相点内各组吸光度均值应用单因素方差分析，数值达为均数?标准差(,?,)，显著性检验水平定为,,,(,,(。 细胞毒性评价:根据所测定的各组,,值，按照下列公式分别计算各实验组细胞相对增殖率(,,,,,,,,鼬,,,, ,,,,，,,,)。 脓,罐器蒜蹁×,,,, , 第一章材料与方法 根据表,(,规定将各组的,,,转换成,级细胞毒性以评定材料的毒性程度。如果实验结果为,或,级反应为合格;实验结果为,级反应则应结合细胞形态分析进行综合评价;实验结果为,(,级反应为不合格。 表,，,细胞毒性的分级 细胞相对增值率(,) 细胞毒性分级 ,,,, ,,(,, ,,(,, ,,,,, ,(,, ,,(,体外微核试验评价基因毒性 ,(,(,材料与试剂 实验材料: 复方牡蛎粉根管充填材料，分为粉液两组分。 阴性对照:砌，,,,,,,培养基 阳性对照组:靴,,,,丝裂霉素,(,,,,, ,,,,, ,,,,, ,,(，,,,，日本) 实验仪器及试剂:,孔细胞培养板(;,,,,, ，，,;,,,,,,,,, ;,,,,,,，美国)， 盖 玻片(,,,,×,,,,，盐城市信泰医疗器械厂)。 双目显微镜,,,恒温细胞培 养箱 甲醇冰醋酸,,,,,,溶液丝裂霉素,(,,,,,, ,,,,, ,,,,, ,,(，,,,) 细胞株:中国仓鼠肺成纤维细胞,,,(中国科学院上海生科院细胞资源中心提供) 实验所用细胞为传代,,,生长旺盛的细胞。 ,(,(,方法 本实验分为实验组、阳性对照组和阴性对照组，实验组加入,,,粉剂和混合物的初始浓度浸提液(,(,‖,,)，阳性对照组加入靴,,,,丝裂霉素;，阴性对照组加入,,,,,,,,培养基。 将中国仓鼠肺成纤维细胞以,,,个细胞,,,的细胞悬液的浓度接种于,孔细胞培养板中的玻片上，每个孔放入,块(,,,,×,,,,)玻片。分为三组，每组三孔。 , 青岛大学硕士学位论文置,,?、,,;,,培养箱中培养,,,，待细胞贴壁后，更换培养基，按实验分组加入不同的试剂。再培养,,,，终止反应。将玻片取出，用甲醇和冰醋酸(,:,)固定,(,,,,,后，用,,,缓冲液洗涤玻片，取出晾干。用,:,,的,,锄,,一磷酸缓冲液 (口,,,(,)染 色,,(,,,,,，自然晾干后用树胶封片。在显微镜(高倍镜，×,,)下随机视野下计数,,,,个细胞中的微核数(见图,(,)，每张玻片计数,次取平均值，而每组,张玻片的均值为该组的微核数。 统计学分析:应用,,,,,,(,软件包处理数据，实验组与阴性对照组微核率应用单因素方差分析，实验组与阳性对照组方差不齐，应用,’检验。,(,(皮肤致敏实验评价其致敏性 ,(,(,实验动物、材料与试剂 实验动物: 健康白色豚鼠,,只，雌雄均可，体重,,,(,,,克，随机分为,组，每组,,只，分为粉剂组、粉液混合物组、阴性对照组和阳性对照组(见图,(,)。 样品制备: 将复方牡蛎粉按,(,咖,的比例置于,(,,的生理盐水中，,,?条件下浸提,,,。阳性对照组选用,,的甲醛，阴性对照组选用,(,,生理盐水。 试验试剂: 完全佛氏佐剂(,,,,,,’, ;,,,,,,, ,,,,,,,,，,;,，,，,,,—,,),，;,,,(美国) 取等量的完全佛氏佐剂与材料浸提液及等量的,(,,生理盐水和,,甲醛分别制备成混合乳化液。 ,(,(,实验方法 采用，,, ,,,,, ,,: ,,,,,,,生物学评价中皮肤致敏试验的最大剂量法(,,口,,,,,,?,,，,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,,,,, ,,,,，,,,,)。 ,(,(,(,诱导接触(第,,) 在豚鼠背部剪毛,;，，,×,;,，常规消毒后于肩胛骨内侧从头向尾成对地注射,个点，对称两点为一组，共分三组，每点注射,(,,,，一组注射完全弗氏佐剂与生理盐水的等体积乳化物，另一组注射浸提液、生理盐水或,,甲醛溶液，第,组注射浸提液、生理盐水或,,甲醛溶液与完全弗氏佐剂等体积乳化物。 ,(,(,(,诱导接触(第,,) , 第一章材料与方法 试验第,天同区域剪毛，用,,,十二烷基硫酸钠涂布各注射点，,,,后将涂有受试样品浸提液的,;,×,;,滤纸敷贴在上述再次去毛的注射部位，然后用两层纱布，一层玻璃纸覆盖，无刺激胶布封闭固定,,,。 ,(,(,(,激发接触(第,,,) 于末次致敏后的第,,天，在豚鼠背部剪毛，用涂有受试样品浸提液的,;,×,;,滤纸片敷贴在去毛区，然后再用两层纱布，一层玻璃纸覆盖，无刺激胶布封闭固定,,,。对照组动物作同样处理。激发接触结束，除去涂有受试样品的滤纸后,,小时、,,小时、,,小时观察注射点的情况(见图,(,一图,(,)。并按照皮肤反应程度评分标准(见表,(,)对各注射点的反应程度记分。皮肤致敏试验以致敏率表示致敏的程度，致敏率是反应评分为,或以上的动物数占该组动物总数的百分比，即致敏率,致敏动物数,动物总数×,,,,，计算出致敏率，并按,,,,,,,,,致敏率分级标准(见表,(,)分级。 表,(,皮肤反应程度评分标准 刺激反应 分值 红斑无红斑 , 轻度红斑勉强可见 , 中度红斑明显可见 , 严重红斑 , 紫红色斑并有焦痂形成 , 水肿无水肿 , 勉强可见 , 中度水肿明显可见 , 重度水肿皮肤隆起,;,，轮廓清楚 , 最高积分 , 青岛大学硕士学位论文 表,(, ,,,,,,,?动物致敏率分级标准 注:致敏率是反应评分为,或以上的动物数占该组动物总数的百分比 ，级致敏度没有意义，在实际使用下无致敏危险。,(,(皮下埋置试验评价局部刺激性 ,(,(,实验动物、材料与试剂 实验动物:,,,,,,大鼠,,只，雌雄各半，体质量,,,,一,,,,，随机分为四个观察期，每个观察期,,只大鼠。四期分别为:,周，,月，,月，,月。 实验材料:复方牡蛎粉根管充填材料，人体医用硅胶管(乙烯基二甲硅氧烷，长,,,,，内径,?,，外径,,,),,,个，水合氯 醛溶液，,,,甲醛，光学显微镜，牙科用铸造蜡，苏木精—伊红(,,,,,,,,,,,,(,,,,,，既)。 制备根管模型(埋植体):将人体医用硅胶管清洗，干燥，消毒，分为实验组和对照组，在无菌条件下，试验组填入复方牡蛎粉根充糊剂，对照组则不加任何材料。两组硅胶管两端均用牙科铸造蜡封闭，再于封闭孔处应用,,,根管扩大针制孔径为,(,,,的微孔，模拟人牙根尖孔，制各成根管模型。 ,(,(,实验方法 埋植方法:硅胶管植入前经高温高压消毒，动物术前,,对手术部位脱毛，腹腔注射水合氯醛,(,,,麻醉，固定后用碘伏对脱毛部位消毒，然后铺巾。在大鼠背部两侧距脊柱各,;,，,处切开皮肤，切口长约,(,;,。分离皮下组织，将硅胶管于无菌情况下植入,,,,,,大鼠背部皮下，每侧各有一个植入点，分别植入实验组和对照组 , 第一章材料与方ü杞汗堋,寡 旌舷叻旌希 迹保 匆煌迹保 保埃 ?观察内容:实验动物在埋植实验材料后，于,周，,月，,月，,月后分期处死。取出包括皮肤、皮下组织的植入块，仔细修整组织块并取出种植物，对界面和材料周围组织进行大体观察，然后将标本置于,,,甲醛中固定,,(见图,(,,一图,(,,)，标本石蜡包埋切片，沿种植物长轴切片，苏木精一伊红(,,,,,,,,,,,(,,,,?，,,)染色，组织学观察。主要观察纤维包膜的形态和结构，炎细胞浸润程度，有无脓肿、变性坏死、增生等情况出现。 根据管端组织有无变性、坏死及其程度、炎症细胞的数量、类型和浸润范围进行组织学评价。将组织反应程度分为以下四级。重度反应(，，，):管端组织失去原有形态结构，形成大面积坏死区。较多嗜中性多形核白细胞、淋巴细胞等炎性细胞浸润;中度反应(，，):管端组织小范围变形坏死呈中度的炎症细胞浸润;轻度反.