枣的糖分构成分析及低聚糖的研究

枣的糖分构成分析及低聚糖的研究 单位代码: ’分类号:墨鱼鱼: 鱼 密 级: 公开 学 号: 枣的糖分构成分析及低聚糖研究 学位申请人:王为为 指导教师:刘孟军教授 赵智慧 副研究员 学科专业:微生物与生化药学 学位类别:理学硕士 授予单位:河北农业大学 答辩日期:二。一三年六月三日独创性声明 本人声明所呈交的学位是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。据我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其他人 已经发表或撰写过的研究成果,也不包含为获得塑皇垦盔些盘堂或其他教育机构 的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已 在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签字同期: 刃膨年‖月尹 学位论文作者签名:互为为 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解塑主垦壅些盘鲎有关保留、使用学位论文的规定, 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘,允许论文被查 阅和借 阅。本人授权塑宴堡垒些盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数 据库进 行检索,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 保密的学位论文在解密后适用本授权书 学位论文作者签名: 王为.为 导师签名:矶 签字日期: 年 月 日 签字目期:矽口年易月争日 学位论文作者毕业后去向: 工作单位: 电话: 通讯地址: 邮编:摘要 .为鼠李科枣属 .植物, 枣 在我国已有余年的栽培利用历史,种植面积达到万公顷,年产量达到 万吨,是重要的传统中药和特色果树。枣果药食同源,具有补血、健脑、镇静、安 神、抗癌、抗衰老、增强免疫力等功效,被人们誉为“天然的保健食品,尤以含 糖量高而著称。一般干枣中可溶性糖含量高达%一%,鲜枣中达%一%.本课 组研究发现,枣果中不仅葡萄糖、果糖、蔗糖、果胶类多糖含量丰富,而且含有 功能性低聚糖。目前,对枣低聚糖的分离分析还处于摸索阶段,对枣水溶性多糖降 解制备低聚糖的研究尚属空白。本试验比较分析枣不同品种、不同发育时期果实及 不同器官中糖分组成,对天然枣低聚糖的分离、枣多糖降解制备低聚糖及低聚糖活 性进行了初步研究。旨在为枣的综合利用和功能食品开发提供理论依据。 主要研究结果如下: .以金丝小枣、冬枣及赞皇大枣为试材,采用高效液相色谱法及分光光度计比 色法比较分析了枣不同品种、不同发育时期果实及不同器官中糖类物质单糖、蔗 糖、低聚糖、多糖及总糖的构成变化。结果表明:随枣果实发育,葡萄糖和果糖 先升后降,低聚糖递减,蔗糖和可溶性总糖逐渐上升;成熟枣果糖分含量表现为蔗 糖果糖葡萄糖多糖低聚糖;相比金丝小枣成熟果实,枣花中多糖含量较高, 蔗糖含量较低。 .金丝小枣全红果枣粉通过水提醇沉去除多糖,得到粗低聚糖液。采用? 离子交换柱及. .聚丙烯酰胺凝胶对粗低聚糖溶液进行分离, 得到了一个中性低聚糖,分析为除蔗糖、乳糖、麦芽糖之外的二糖。采用膜分离技 术成功截留分离了金丝小枣粗低聚糖液中 以上的天然低聚糖。 .通过响应面模型,研究了实验室条件下盐酸水解及纤维素酶酶解枣多糖 制备低聚糖的优化条件。酸解的优化条件为:浓度. /,底物浓度%, 酸解时间 ,得到的多糖降解率为.%;酶解的优化条件为: 反应体系中 酶液添加量. ,多糖降 /,底物量. /,酶解时间. 解率为.%. .将膜分离得到的枣天然低聚糖及多糖制备的低聚糖以不同浓度替代基础培 养基中的葡萄糖,以完全葡萄糖的基础培养基作对照,进行动物肠道益生菌的体外 增殖试验。结果表明:不同浓度的枣天然低聚糖对鸡源.肠道益生菌的生长均有 促进作用,浓度.%时效果最佳;.%的枣天然低聚糖对鸡源.、兔源.、 猪源一肠道益生菌的生长有促进作用,但高浓度不利于其生长;盐酸水解枣 多 糖制备的低聚糖生物活性较低,酶解制备的低聚糖生物活性较高。 关键词:枣;糖分构成;低聚糖;分离;多糖降解;活性 :: :, ,,., , . , ,,” ”.,?,., %. %, , , , . , . , , . , . : . ,, ,‘’,‘’ ‘’,., . ... . ‘’ . , . , . , .. ‘’. , . . /, %,. .% . . . . .. % , . ., . .% . ? 一 一 .%, ? ,? . , . , . : ;;; ; 目录 引言??一 .果品中糖分构成研究?. .低聚糖的研究概况??. ..低聚糖的来源?.. ..低聚糖的分类?.. ..低聚糖的分离方法??一 ..低聚糖的纯度鉴定??一 ..低聚糖的结构鉴定??一 ..低聚糖的活性?一 .枣中糖分构成及低聚糖的研究进展?. ..枣中糖分构成研究进展一 ..枣低聚糖研究进展??.. .研究目的和意义 材料与方法?.. .试验材料 ..试材.. ..主要试剂 ..主要仪器设备? .试验方法 ..各糖分的含量测定..低聚糖的分离纯化 ..多糖降解制备低聚糖的方法..低聚糖的活性试验 .数据处理方法结果与分析?一 .枣糖分构成分析 ..曲线的绘制 ..不同品种枣果中糖分构成分析 ..枣不同器官糖分构成分析 ..枣果实不同发育阶段糖类成分含量的变化? .枣低聚糖的分离纯化研究..低聚糖层析结果 ..膜分离研究.多糖降解制备低聚糖的研究? ..枣多糖的制备?..枣多糖的酸解条件优化结果? ..枣多糖的酶解条件优化结果??: .低聚糖生物活性??~ ..天然枣低聚糖对动物肠道益生菌的作用..酸解和酶解枣多糖制备枣低聚 糖对动物肠道益生菌的作用 讨仑?一 .枣糖分构成特点分析一 .枣天然低聚糖的分离及活性分析?.. .枣多糖降解制备低聚糖??.. .枣幼果的开发前景?一 结论?.. 参考文献. 在读期间发表的学术论文??. 作者简历. 致谢?..枣的糖分构成分析及低聚糖研究 引言 .植物,原产丁二我国,是我国的传 枣树为鼠李科枣属 统优势果树树种。据河南新郑出土的炭化枣核推测,我国对枣的利用可以追 溯到年以前。 枣属植物广泛分布在热带、亚热带和温带地区,全世界约有种,我国人约有种?。。枣树 以其抗旱耐瘠薄、早果丰产、枣果营养丰富、经济效益和生态效益显著等特点,多年来在我国广 泛种植,尤其近几年在新疆地区更是得到了迅猛发展。目前,我国枣树栽培面积已达万, 年产量万,;‘世界总产量的%以上,在我国有十分重要的地位【。 大枣是一种美味可口,营养极其丰富的食品,与桃、李、栗、杏并称为中国古代五果。同 时,枣作为我国的传统中药和滋补佳品,环核茴酸、维生素、多糖、二萜酸等多种重要功能成分 的含量居百果前茅。现代药理研究表明,枣果具有抗变态反应、镇静、保月十、抗炎、抗衰老等多 方面的药理作用【。成熟枣果是常用的中药,作为药川在我国已有几千年的历史,早在世纪的 《名医别录》里就记有:“大枣补中益气,坚志强力,疗心卜悬之功效”。剑世纪《神农本草 经》将人枣列为上品,说它主治“心腹邪气,安中养脾,平胃气、通九窍,久服轻身延年”。明 朝李时珍的《本草纲目》记载:“干枣润心肺、止咳嗽、补五脏、治虚损,除肠胃癖气”。一般 中草药都配上儿个人枣,历代中医都认为,枣具有补脾胃、养心安神、缓汞药性等作用。近年米, 随着科技的进步与社会的发展,人们的保健意识日益增强,对保健食品的需求迅速增加。人枣以 其特有的药食同源及丰富的营养成分、优良的保健作崩、显著的疗效,被人们誉为“天然的保健 食品”,受到国内外众多科研人员的青睐,已成为近年来的研究热点之一【。 近年来,生物功能性成分的研究和开发成为研究热点。枣果不仅含有糖、蛋白质、氨基酸、 膳食纤维、矿质元素等常见的营养物质,还含有三萜酸、黄酮、皂苷、腺苷、脂肪油、多种维生 素等生理活性物质。枣中尤以糖类成分含量丰富,约占干物质的%%,按聚合度不同可分 为多糖、低聚糖和单糖。多糖又称多聚糖,是由个以上的单糖通过糖瞢键聚合而成的天然高 分子化合物;低聚糖又称寡糖,是由~个单糖结合而成的小分子糖。随着 人们生活水平的普遍提高,促使人们对营养保健日益关注,食品安全意识的逐渐增强。低聚糖作 为一种安全健康的生物功能性成分目益受到关注,对低聚糖的研究和开发成为近年来的研究热点。 前人已对多糖的提取分离及其含量的动态变化做了一定研究【卜】,枣果糖分构成的研究尚不 系统,而对枣低聚糖的研究刚刚起步,对枣多糖降解制备低聚糖的研究还未见报道。本试验拟选 用冬枣、金丝小枣、赞皇大枣三个主栽品种作为研究对象,首先对其各糖分的时空变化进行分析, 在此基础上对枣果天然低聚糖进行分离,并进一步研究枣果天然多糖降解制备低聚糖,通过微生 物试验验证天然低聚糖及人工制备低聚糖的活性。旨在延长枣加』:产业链,提高枣的综合利刚价 值,为枣保健品进一步开发提供理论依据。 .果品中糖分构成研究 果实中主要含有葡萄糖、果糖、蔗糖,总称为可溶性糖,其中葡萄糖和果糖义称为还原糖。 在一些干果如板栗、柿子等果实内含有大量的淀粉。由于各种果实糖的种类、含量及比例不同, 河北农业大学硕士学位毕业论文 果实甜味千差万别。 果实在其生长发育过程中糖分的积累来源于绿色组织的光合作用。植物叶片产生的光合同化 产物很大部分最终以蔗糖或山梨醇的形式,经韧皮部长途运输后卸载到发育过程中的果实内,进 入果实过程中或之后在有关酶的作用下,进行一系列的代谢及跨膜运输,最终以原形式蔗糖/ 山梨醇或更多地以其它形式淀粉、果糖和葡萄糖积累在果实中,产生不同的风味?。在果 实发育初期,其本身含叶绿素可进行光合作用,这在果实糖分积累上有重要作用。并且在果实成 熟过程中,还会从枝梢或根部向果运输糖分,淀粉及有机酸也会转化为可溶性糖。由此可见,果 实的发育过程也是糖分积累的过程,果实由发育初期的苦、涩、无味转化为色、香、味具佳引, 糖分的作用是巨大的,果实品质在很人程度上取决丁.果实内所含糖的种类和数量;糖不仅是影响 。 果实甜度的物质,而且还是酸、类胡萝卜素和其它营养成分及芳香物质等合成的基础原料【 许多研究者研究了果实生过程糖分的变化。杨道富等】研究显示,火龙果果实生长过程中 降到 总糖含量变化呈‘’型,花后? 缓慢上升,花后? 呈‘卜.降趋势,并在花后 最低值,花后。 迅速上升,花后? 上升速度减缓,并在花后 达到了最高值。沈 志军等【 】对桃果实发育的研究认为,桃果实应属丁.典型的蔗糖积累类型,蔗糖是桃果实成熟时主 要的糖类物质,其在果实发育过程中表现出逐步积累的过程,在采前? 各品 种均表现蔗糖 含量的积累加速。对苹果果实糖积累特性进行研究,结果表明“富十”和“国光”苹果果实总糖、 果糖、葡萄糖及蔗糖含量均随着果实发育逐渐成熟早持续增加的趋势,但不同种类的糖分含量及 。甘秀海等【对火龙果的研究表明火龙 比例在不同品种果实发育的不同时期表现出一定的差异【 果果实在发育期总糖含量和可溶性固形物先升高后下降。宋哲等 研究表明,进入着色期的“富 士“苹果果实中淀粉含量逐渐降低转化为糖,葡萄糖、果糖、蔗糖及还原糖等均呈上升趋势。张 圣仓等【】比较不同品种杏成熟果糖含量表明,仁刚杏与鲜食杏品种相比,可溶性总糖含量较高; 不同颜色果肉的鲜食品种间总糖利还原性糖含量也存在差异。,.等【认为糖含量的变化与 当年的气候条件、品种和应用的生产技术有关,同一树种不同果实个体间的含糖量变化不一,这 主要是由于花芽分化、花芽的位置及其它因素造成的。 影响果实含糖量的因素很多,人们试图用施肥,施用生长调节剂,修剪,改变光照和温差等 方法提高果实品质,促进果实糖分积累【‘】。水分对果实发育及品质的调节具有双重性,土壤水 分不足常降低果实的产量,但在果树生长的特定时期适当控水却常常提高一些果实的品质,许多 的研究证明,适当控水可提高苹果、梨、桃、柑橘和葡萄的含糖量删。 .低聚糖的研究概况 低聚糖,亦称寡糖或寡聚糖,是由?个单糖经糖苷键结合而成的直链或 支链的一类糖,相对分子量约为?。也有一些聚合度超出此范围的低聚糖也归为低聚糖类, 如菊糖等。许多低聚糖及其糖缀合物因独特的结构而成为重要的生命物质,如低聚异麦芽糖、大 豆低聚糖、低聚果糖等不仅以其缀合物起作用,而且其本身具有重要的生理功能,可作为促双歧 杆菌生长因子,有拮抗机体过氧化损伤及降脂作用【】。目前,我国功能性低聚糖的研发尚处于起 步阶段,对一些功能显著、附加值高的低聚糖产品的研发相对滞后。人们对低聚糖在食品、医药 及农业方面的开发寄予厚望。 枣的糖分构成分析及低聚糖研究 ..低聚糖的来源 目前主要有从天然产物直接提取、酶法合成、天然多糖降解和化学合成等种途径。 ...天然产物直接提取 从天然原料中提取低聚糖步骤较为简便。目前研究中应用较为厂泛,如从甜 菜提取的棉籽糖 低聚糖、从菌体提取的黑曲霉寡糖等‘?。近年来,武卫红九用不同体积的%乙醇室温提取鲜地 /摇床提取 ,用薄层色谱和 黄中的总寡糖。等四用%乙醇室温浸泡菜豆, 纸色谱在提取液中检测到筋骨草糖六糖。潘慧芳等】在番木瓜中分离得到了 从枸杞中分离得到了 ??一【.一?,..?.??..;徐鹏等【 【?葡萄糖?葡萄糖【?果糖,孚糖?葡萄糖【?果糖。此外,还有很多 植物中提取到丰富的低聚糖,如巴戟大中菊粉耍低聚糖‘;雪莲果中富含水溶性低聚果糖【”;玉 米芯中水二糖,术三糖四;大豆中棉籽糖,水苏糖川;肉从蓉中甘露糖四等。 ...酶法合成 酶催化反应立体特异性强,对反应底物、糖苷键的类犁及位置等均有特定要求。川于寡糖合 成的酶包括糖基转移酶、糖苷水解酶及磷酸化酶等人类。合成原料主要有淀粉类、蔗糖、乳糖 等。卢丽丽等介绍了获得和筛选各种糖苷合成酶及其合成反应机制,为寡糖的.业化生产提供 了新的选择。 ...天然多糖降解 目前天然多糖的降解主要有三火类:化学降解法、物理降解法和生物降解法。 化学降解法: ?酸水解法:酸性溶液如盐酸、硫酸、过碘酸、醋酸等能引起多糖中糖苷键的断裂,使多 糖降解为低分子片断。控制酸浓度、温度、时间可获得不同分子量火小的降解产物。目前工业上 大多数采用盐酸水解多糖,因为盐酸容易挥发,简化了后续一:艺中盐酸的处理。但较高酸浓度. /署较高温度?水解时会破坏糖链的结构,使多糖中的硫酸根脱落,而且随着温度的增 加,脱硫酸根程度也会增加。 吴永沛等四以海带为试材,用水解岩藻聚糖成功制备低聚岩藻聚糖;林奇玲等‘采用 稀盐酸水解玉米麸皮制备低聚糖阿魏酸酯,以的量为指标,研究了液料比、酸浓度、 温度、时间和提取次数个因素对酸解效果的影响,并在此基础上,通过中心组合试验对工艺进 行了优化。 等【】对浓磷酸水解植物多糖作了较为深入的研究,所得到的产品分子量分布都比较 窄,均一性好。可见,用浓磷酸水解法得到寡糖是可行的。但是,该方法反应周期太长,应用于 生产有一定的困难,且产率也不够高。 此外,还有关于用硫酸、三氟乙酸、乙酸降解法、氟化氢降解法等的报道【舶】。 ?氧化降解法:氧化降解法是近年来国内外研究比较多的植物多糖降解方法。尤其是关于 氧化降解的研究,降解是将植物多糖溶解在醋酸溶液中,加入溶液进行均相降解 反应,再用中和,加入过量无水乙醇沉淀,最后分离得到降解的产物【】。这种方法降解植 物多糖速度快、产率高,溶性产品达%以上,但降解的产物分子量比较大,为降低降解产物的 分子量,李邦良掣】提出非均相氧化降解法,就是用溶液直接氧化降解,得到的产物有很 河北农业大学硕士学位毕业论文 好的水溶性。 生物降解法: ?酶降解法:由于酶法不发生副反应,反应条件温和,环境污染少,工艺较易控制等优点被 广’泛应用。杨洋等利用一甘露聚糖酶对皂荚多糖胶进行解聚改性,酶解产物主要为甘露四糖、 甘露三糖、甘露二糖; 等【】用木聚糖葡萄糖基转移酶与木糖基转移酶降解罗望子木聚 糖,成功得到聚合度的低聚糖; 】等用一琼脂糖水解酶对琼脂糖进行降解, 得到不同聚合度的琼脂低聚糖。 ?微生物发酵法:目前,:业生产中最主要的应用方法。刘芳等【】以甘蔗渣为原料进行微生 物发酵,制各低聚糖,提高甘蔗渣附加值。解春艳【以麦麸为原料,进行食药用真菌发酵制备了 阿魏酰低聚糖,生理活性更好,其生产过程简便,成本低廉,产品无异味,易于实现.:业化。 物理降解法:植物多糖降解,除了上述的化学降解和酶降解法,还有一些物理的方法,如 微波法、辐射法和超声波法。其中对超声波降解法的研究比较多,据等【】研究报道,超声 波处理植物多糖,可以降低分子量,使其分子量分布明显的变窄。 ...化学合成 化学合成法目的性较强,主要用丁.制备一些结构特殊、性质特别的低聚糖。在合成前需要严 谨的合成殴计策略,包括设置保护基团,选择适合的催化剂和反应条件,确定控制反应时间的区 域和立体选择性。合成时各条件的控制需要十分严格,操作步骤也较为繁琐,在:业应用上暂时 体现不出经济价值。合成的主要方法有:收敛分段合成法、选择性糖基化合成法、自动合成法和 同相合成法。最常用的糖菅键合成法是年由等建立的,由于氯代或溴代异头 碳 稳定性差,故反应产率低,立体选择性差。此法的改进以异头碳氟代物作为糖基供体最为成功。 等【?将人体内两种成分较为复杂的低聚糖通过固相合成法与两个肽片段以酰胺 键结合,合成了一种新型糖肽,为糖缀合物数据库提供了新的结构模型。 ..低聚糖的分类 根据低聚糖的生理特点分为:普通低聚糖和功能性低聚糖。普通低聚糖包括蔗糖、麦芽糖、 乳酸糖、海藻糖和麦芽二糖等引,它们可被机体消化吸收,一般只作为甜味剂使用;功能性低聚 糖是指对人、动物、植物等具有特殊生理作用的一类寡糖,它的甜度一般只有庶糖的%~%. 由于糖苷键的结构或分子构象不同,不能被胃肠道内消化酶作用而分解,动物不能直接消化利用, 但却能被肠道内的双歧杆菌和乳酸菌等有益菌利用,产生细菌素、有机酸等,能够抑制沙门氏菌、 大肠杆菌等有害菌的生长,对肠道微生物区系、免疫等功能有较好的促进作用。且具有低热量、 抗龋齿、防治糖尿病、改善肠道菌落结构等生理作用,在功能性食品的配料中十分重要,正在日 益受到消费者的青睐。根据组成功能性低聚糖单糖的不同,常见的功能性包 括低聚异麦芽糖、大 豆低聚糖、果糖低聚糖、低聚半乳糖、壳聚糖、壳低聚糖、低聚木糖等,根据分子中是否存在 半缩醛羟基可以分为还原性低聚糖和非还原性低聚糖。 枣的糖分构成分析及低聚糖研究 ..低聚糖的分离方法 在制备低聚糖的技术中,分离提纯是关键之一。目前,主要的分离纯化方法有层析法,膜分 离法,酶法和微生物发酵法。 ..层析法 层析法是基于混合物中各组分于色谱柱的填料间结合力强弱的差异,即各组分在固定相填 料与流动相间分配系数不同的性质而使混合物中难吸附与易吸附组分分离的技术。层析技术的 进步是现今低聚糖研究进展的重要原冈。 凝胶过滤层析 凝胶过滤层析法在糖类成分的研究中应用’.泛,其吲定相凝胶具有分子筛作用,分离时糖类 物质按相对分子质量递减的顺序被洗脱剂洗出。常川的凝胶柱填料有葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶和 聚丙酰胺凝胶。凝胶分离法克服了砖胶柱层析法对糖吸附力太强的缺点,分离效果理想且所刚洗 脱剂较少,层析时问也相应减少,吲定相反复使心斤性质依然较为稳定。 等人通过串连使用聚丙烯酰胺凝胶 .凝胶柱 . 一和 对不同聚合度的低聚木糖进行了分离;张军华等【以聚丙烯酰胺凝胶 .和 一 为分离介质进行了低聚木糖的分离制备,分析了凝胶过滤层析分离低聚术糖的规律;唐岚等【】 川大孔吸附树脂和葡聚糖凝胶柱分离纯化了生地黄中水苏糖。 离子交换柱层析 离子交换色谱法是利刚被分离组分离子交换能力的不同,因而选择性系数不同而实现分离的 色谱法,按填料所带电荷不同可分为阴离子交换柱和刚离子交换柱。不同的洗脱条件可分离单糖 混合物、单糖、双糖、三糖、四糖雨五糖组成的体系,也可用丁二分离单糖、脱氧糖和糖衍生物的 复杂样品,以及含有不同构型的吡喃营及呋喃糖营的混合物及其它糖类的混合体系【】。 纠?研究利用酸水解海藻酸得到聚合度值、汞 的低聚糖,阴 离子交换法和排阻色谱法结合分离;许牡丹等【采朋离子交换树脂法分离纯化甘露低聚糖; 等【 用阴离子交换树脂柱层析对夹竹桃样品酸水解后的寡糖成分进行了分离;毛跟年等四用强酸 性阳离子交换树脂较好地分离了麦芽低聚糖浆中的麦芽低聚糖。 硅胶柱/薄层层析 此法是极为常用的糖类物质分离手段之一,由于糖的极性强,进行色谱分离时要求承载的样 品量要非常少一般不大于 ,否则对某些相近的样品分离效果会产生的影响,在薄层上 涂铺用硼酸溶液或无机盐水溶液调制的吸附剂可适当提高样品承载量,改善分离效果。 徐强等】用酸解琼脂制备得到琼胶低聚糖,并州薄层层析对得到的低聚糖混合物进行了不同 聚合度的分离; 等四对硅胶柱/薄层层析法近年来在部分酸性单糖、酸性双糖和酸 性低聚糖来源于自然界动植物的分析进展进行了较为详细的报道,弥补了此方法在酸性糖中应 . 用的不足。 活性碳柱层析 一般用活性碳与天然硅藻‘十等量混合作为填料分离低聚糖,是一种较为传统的分离技术。活 性碳选择性强、吸附量大且价格低廉;天然硅藻士作为分离载体使溶液易流 过。此法采用梯度洗 河北农业大学硕士学位毕业论文 脱,先用水洗脱单糖,继而增加乙醇的浓度从而按分子量大小依次洗脱。此法分离效率较高,不 受分离溶液浓度和溶液中无机盐的影响,但洗脱液用量较大。 等【用活性碳层析柱从种蔬菜和水果的发酵液中分离到个新的低聚糖; .%. 等用活性碳柱从糖混合物中分离得到低聚果糖,其纯度分别可达到%年 ..等 还在温度相同的条件下比较了活性碳、硅藻土和?沸石对果糖、葡萄糖、蔗糖及低 聚果糖的吸附性能,并得出活性碳对低聚果糖有较高的性能,而硅藻土和沸石则都对葡萄 糖有较强的吸附力。 ...膜分离法 膜分离过程的实质是物质透过或被截留的过程,近似于筛分过程,依据滤膜孔径的大小而达 剑物质分离的目的引。林勤保等”,首先选用截留分子量 的膜进行试验,主要目的是 除玄人枣中的多糖、蛋白质等大分子物质,收集透过液;透过液采用截留分子量为 的膜 进行试验,以除去以单糖为主的小分子物质,从而获得低聚糖粗提物。 ...酶法 酶法的基本原理是利刚酶制剂将低聚糖混合物中的某一或某些组分专一性地除去。有文献报 道 ’,在低聚糖纯化中,葡萄糖氧化酶或葡萄糖过氧化物酶相结合作用于葡萄糖,把葡萄糖氧 化为葡萄糖酸,然后以葡萄糖酸钙沉淀法或离子交换树脂法将其除去;以果糖转移酶作用于蔗糖 制得低聚果糖。该方法可以川米制备纯化低聚半乳糖、低聚异麦芽糖、低聚蔗果糖、纤维低聚糖 等低聚物。此法的优点是设备投资少,操作简单,缺点是葡萄糖氧化酶在氧化葡萄糖的同时,料 液的值降低而偏离酶的最适作用值范围,故在操作过程中需调节控制料液值,另外, 葡萄糖氧化酶价格较高,使得分离纯化操作成本高。葡萄糖氧化酶固定化技术的发展,有望降低 其使用成本。 ...微生物发酵法 微生物发酵法主要基于多数功能性低聚糖的难发酵性,选择合适的微生物将非功能性低聚糖 主要为单糖成分发酵除去。已有报道,酿酒酵母可以选择性的将粗功能性低聚糖混合物中 的葡萄糖或蔗糖发酵成酒精除去。主要是因为酿酒酵母等微生物对麦芽糖、 蔗糖等的发酵反应具 有专一性,因此通过基因工程的手段,有可能得到可以专一发酵麦芽糖、葡萄糖、蔗糖等单糖或 二糖成分而不利用功能性低聚糖成分的变异菌种。目前,我国也己驯化出了具有糖化和发酵能力 的酿酒酵母,并且用此酿酒酵母发酵制取大豆低聚糖,投资小,成本相对较低。但目前可分离的 低聚糖种类较少,分离时间长。 ..低聚糖的纯度鉴定 纯度的概念是随着分离手段的进展不断变化的,当一种方法技术已不能将某样品进一步分离 时,即称为该方法下的纯样品,如色谱纯、生化纯、电泳纯等。低聚糖的纯度标准不能用普通的 小分子化合物的纯度来衡量,因为即使是纯品的低聚糖也存在微观不均一的问题,它的纯度只代 表某一类糖相似链长的均一组分。目前常用的纯度鉴定方法有比旋光度澍、高压电泳法‘、 高效液相色谱法引、超离心法刚等. 枣的糖分构成分析及低聚糖研究 ...比旋光度法 糖的结构具有旋光性,比旋光度的值不变则为纯品。此法受溶液的温度、浓度特别是微量成 分的改变而影响较大,受到限制。 ...高压电泳法 糖类在电场的作用下,受电场力的作用,移动的距离与其分子大小、形状及所带电荷的多少 有关。所以在电场作用一卜.,不同的糖的相对迁移距离各不相同,当电泳结束后显色呈一个斑点, 则证明是均一组分。 ...凝胶过滤法 不同分子量火小的糖分子,上样流动相洗脱,在层析柱中的移动速度也不同,从收集器中组 分检测的峰的多少和形状可判断该糖的纯度。最常用方法为部分收集器收集,苯酚.硫酸法,得到 流出体积与糖浓度的关系曲线。若为单一对称的峰,则表示为均一组分;或经示差检测器检测, 如果是单一对称的峰,则表明为均一成分。因为高效液相色谱的快速、分辨率高和重现性好的优 点,此方法最为常用。 ...超离心法 微粒受到高速旋转时离心力和重力的作用,移动的速度与微粒的质量、大小与形状有关。如 果混合糖样品在离心力场作用。卜.形成单一的区带,则表明其分子质量、大小与形状相似。 ..低聚糖的结构鉴定 目前应刚的低聚糖结构分析法主要包括:化学法、物理法和生物学方法,为了取得较好的效 果,通常鉴定过程中会几种方法结合使用。 ...化学方法 化学分析法主要包括:甲基化、酸水解、降解、高碘酸氧化、乙酰解和甲醇解等,常 用的有以下方法。 酸水解法:通过一定的酸浓度、水解温度和水解时间等因素,会使低聚糖链完全水解成为单 糖,然后再采用层析和色谱方法进行分析,由此得出低聚糖中单糖的组成。李兴军等四从乙烯催 熟猕猴桃果肉提取半纤维素,纯化术葡聚糖,用 /三氯乙酸溶液在?水解 ,用气相 一液相色谱进行了单糖组成的摩尔比测定。 甲基化法:甲基化法是用甲基与低聚糖中的所有游离羟基形成甲氧基,再经过水解,断裂糖 苷键,先进行完全乙酰化处理,然后采用色谱法、质谱法或核磁共振法分析,通过乙酰基和甲基 化位置便可得知各糖基间的连接方式和相互分子比等信息。郑小迅等以葡聚寡糖为模型分子, 经甲基化,乙酰氯/盐酸裂解,.甲酸荧光衍生化及高效液相色谱分析,建立一 种新的寡 糖链结构分析方法。该方法可以同时获得组成单糖种类、糖链分支位点及组成单糖的,.构型 种结构信息。 ...物理方法 物理方法主要包括:质谱,核磁共振波谱分析和红外拉曼光谱技术等。 质谱法 在糖类结构分析中最常用的就是质谱技术,它的优点是灵敏度高、结构信息直观。应用于糖 河北农业大学硕士学位毕业论文 类成分分析的质谱方法有:场致电离与场解吸电离质谱、化学电离质谱、电子轰击质谱和反应质 谱等,下面介绍几种常用的质谱技术。 快速原子轰击质谱?:与传统质谱相比,其被分离糖类成分可直接在基质液中电离, 因此可以用于未衍生化处理的强极性、难挥发或热不稳定的糖类成分,也可测定出低聚糖及其衍 生产物的分子量、糖残基序列和连接位点。 电喷雾电离质谱.:能将分子软电离,形成气相离子,可直接对非衍生化糖进行测定, 可分析多个个以上单糖残基组成的糖类物质,弥补了快原子轰击质谱此处的不足,亦可测 定低聚糖的分子量、糖基序列和连接位点信息,且灵敏度高,效果好。可以与高效液相色谱或毛 细管电泳等分离技术联用,大大提高了检测的灵敏度与精确度。张军华等【用酶水解玉米芯木聚 糖,刚?的分析方法确定制备的木二糖和木二糖组分相对分子质量分别为和, 且小二糖不含阿拉伯糖基及其它取代基,术二糖的.和一均不含任何取代基。 基质辅助激光解吸离子质谱?:同样采取软电离方式,电离的分子或离子不易裂 解,不受溶液中盐的影响,与上述方法相比,更简便更快速,对非衍生化糖和糖肽灵敏度更高。 应川此方法可测低聚糖分子量、化学合成、修饰结构和序列分析,在糖类分子分析中常与飞行时 司检测器联用?.进行离子检测,减少了操作步骤和样品消耗量。但其缺点 是此方法只能分析分子量几万以下的片段,且分辨率较低。 等从罗望子中纯化木葡 聚糖,通过局部酸水解和酶法降解得到聚合度的低聚糖,利用?等技术,明确了 它们的结构特性,而用来作为明确木葡聚糖酶促反应产物的标准品。 核磁共振波谱腿 糖类分子结构分析中,通常用谱、谱和谱进行分析。一般分析过程是:先用碳氢 化学位移相关谱. 矛异核化学位移相关谱,确定各质子活泼氢除外的化学 位移值,以及在谱图中的准确位置,并辨别和质子。然后根据氢氢化学位移相关谱. .矛核间双共振相关谱等,归属糖分子中各个位置的质子,最后再凭碳氢化学位移 相关谱或异核多键相关谱,确定糖基的结合位点和连接顺序。此外,核磁共振法还可测 得糖链中残基数量、组成、异头碳构型和取代基团的位置等一级结构信息。 等【州从甜叶菊的根和叶中提取低聚果糖,运用、.和.技术,确 定其结构基本由?.一呋喃果糖基连接组成,末端连接.吡喃葡萄糖基和.呋喃果糖基单元。 红外和拉曼光谱分析 红外光谱技术不仅可以提供糖分子结构中可能存在特定基团和异头碳构型或信息,还可 以识别吡喃环和呋喃环。与拉曼光谱相比,分析结果更具规律性,但拉曼光谱具有更强的特征吸 收峰,常根据实际情况两方法互补使用。朱明等【】采用和分析对比了自制麦芽四糖 产品和日本市售麦芽四糖产品,结果显示,其特征吸收波长及重要化学位移基本一致,且产品均 为【.,糖苷键连接的直链麦芽低聚糖,由此证明虽然所用生产用酶制剂及工艺有所不同,但自 制产品和日本产品中麦芽四糖的分子结构完全相同。 ...生物学方法 生物学方法主要是酶解分析:指通过对低聚糖的顺序降解来获得其一级结构的部分信息,以 确定分子构成中的每个单糖的异头构型。可以与放射性标记联用,得到特定糖终端的放射性片段, 目前已投入使用的糖序定仪便是基于此原理。由于许多糖苷酶的难获得性和糖结构的复杂性, 枣的糖分构成分析及低聚糖研究 当前酶解分析法一般只适用于.连接的糖链分析,而不适用于一连接的糖链分析。 ..低聚糖的活性 功能性低聚糖具有低热量、难消化、吸湿性大、粘度低、有甜味、不被胃和肠道消化吸收等 特点,以及具有防.:龋齿、调整肠道功能,有利于人体肠内双歧杆菌的增加,调整肠道功能,促 进钙吸收等功能。因此,功能性低聚糖作为功能性食品配料被广泛应用于各类食品。 一般认为,益生元是指不易被消化的食品成分,通过选择性的刺激一种或几种细菌的生长与 活性而对寄主产生有益的影响,从而改善寄主健康的物质,主要为低聚糖类。 一定意义上肠道双歧杆菌的多少已经成为衡量健康好坏的重要指标之一,双 歧杆菌的生理作 川主要表现为:可为人体提供部分族维生素,抑制致癌物质的产生,促进蛋白质的新陈代身, 降低血液中的古醇生成,减轻肝脏负担等卜。研究报道【】低聚糖对双歧杆菌、乳酸菌有明显 的增殖效果,从而抑制肠道内腐败菌的生长,改善肠道微生态环境,是良好的双歧因子。 低聚糖在结肠内被发酵产生短链脂肪酸 ,,如乙酸、丙酸、.酸 等,降低肠道的值;提高机体免疫力,降低有毒发酵产物如胺、酚的浓度,预防结直肠癌; 防治便秘,清除毒素;防龋齿功能,被新型低聚糖龋齿的链球菌利,不被口腔中的酶液分解, 冈而能防龋齿;对心血管疾病有一定治疗作用,研究发现饲喂患高血脂症小鼠低聚糖,一段时间 后明显降低了脂肪水平并具有一定抗氧化活性;其他,增加某些必需矿质元素的吸收,防.二肥胖, 低聚糖还有防.同醇蓄积,抗肿瘤,预防糖尿病等作用】。 .枣中糖分构成及低聚糖的研究进展 ..枣中糖分构成研究进展 枣果的突出特点是含糖量高,糖类物质主要有葡萄糖、果糖和蔗糖,前人已对糖分含量组成 做了一定研究。 彭艳芳等研究冬枣和金丝小枣不同发育期果中游离单糖,结果表明枣果中各发育阶段均 以果糖比例最大。李守勇等比较了个产地的冬枣枣果,发现产地问冬枣总糖含量存在差异。 毕平等研究发现,枣幼树期果实发育时间短,含糖量低,随着树龄的增长,果实含糖量逐渐 提高,年生树可充分体现品种品质特性;枣树不同枝龄果实含糖量不同,以~龄枝果实含糖 量最高。束鹿婆枣月日果实白熟期至月日,糖积累速率最大,而金丝小枣在白熟期糖 积累缓慢,之后积累速率加快。魏天军等对灵武长枣的研究表明,可溶性固形物、总糖和蔗 糖含量均与果实发育成熟度呈正相关。但不同品种、不同发育时期枣果实及不同器官中糖分含量 组成的系统变化规律至今未见报道。 ..枣低聚糖研究进展 枣果中的活性糖成分主要包括多糖和低聚糖,而现阶段国内对于枣多糖的生物学活性研究相 河北农业大学硕士学位毕业论文 对较多,对枣低聚糖的研究还较少,处于起步阶段。 低聚糖的提取常采用水提的方法,主要步骤分为可溶性固形物的提取和乙醇过夜沉淀。首先 是可溶性固形物的提取,对枣果可溶性固形物充分提取,采用醇沉的方式沉淀多糖,离心或过滤 后得低聚糖和单糖的混合物。山西大学原超【】以山西木枣为试材,研究了提取时间、提取温度 和液固比对枣果可溶性固形物及总糖得率的影响,并对各因素进行了正交试验优化,结果表明: 在。条件下,液固:,提取 得率最高;在此基础上,醇沉去除多糖后便得到待纯化的低 聚糖, 等加入无水乙醇至体积分数%沉淀过夜除多糖得到大豆酱油渣中低聚糖【, 等加入倍体积%乙醇过夜除茶多糖‘,蒋梅峰‘,吉爽爽均采用此方法。 林勤保?】,蒋梅峰曾采用水浸法提取火枣低聚糖,用%醇进行蛋白质和多糖的脱除, 柱层析进行分离纯化,得到两个级分,经测定低聚糖的平均分子量为 通过. 。红外光谱分析结果表明,该低聚糖为一种吡喃型低聚糖。吉爽爽?】应刚膜分离,将得到 的低聚糖粗提液中分子量? 组分进行离子色谱分析。结果表明:低聚糖主要包含个 均一性组分,其聚合度大约为?。近来,林勤保?,原超】等人研究出一种从大枣中分离纯 化制备多种低聚糖的方法,该技术以食用大枣或残次火枣为原料,经过水浸 提法提取,依次用滤 布、万的超滤膜、. 的纳滤膜进行分级,强碱性阴离子交换树脂脱色、一 纤维素柱和葡聚糖凝胶柱纯化的步骤制备得到四种低聚糖。但四种低聚糖的结构均不明确。 在枣低聚糖活性方面,王向红等 分离得到的金丝小枣低聚糖通过双歧杆菌的体外增殖试 验研究。结果显示:低聚糖对动物双歧杆菌体外生长有促进作用,当低聚糖添加浓度为.%时, 促进生长效果最为明显。王中华等研究了大枣低聚糖对蛋雏鸡生氏性能和免疫功能的影响, 结果显示,试验组蛋雏鸡日均采食量及日均增重量均有所提高,其脾脏指数、法氏囊指数、胸腺 指数等都有显著提高,其中日粮中添加量为 /效果较理想,表明饲料中添加大枣低聚糖 可提高蛋雏鸡的生产性能和免疫机能;又用大枣低聚糖饲喂断奶仔猪,结果表明大枣低聚糖同样 可提高断奶仔猪生产性能和免疫功能,且饲料中添加.%的大枣低聚糖效果较理捌?。 综上,枣糖类成分的研究已取得了一些进展,主要集中在个别糖分的含量分析和多糖的提取 分离等方面,对不同品种、不同发育时期枣果实及不同器官中糖分含量组成的系统变化规律的研 究尚未见报道;低聚糖作为一类重要糖分,具有良好的益生元作用?,部分低聚糖被报道有美 白保湿【】、降低氧化损伤【 、提高免疫力【?等功效,在其他植物中已得到研究验证,但对枣低 聚糖的研究还不够深入,枣低聚糖的种类、结构、活性、不同制备方法以及时空分布规律等问题, 亟待研究。 .研究目的和意义 本试验将测定不同品种、不同发育时期枣果实及枣不同器官的糖分含量,明确枣的糖分构成: 利用柱层析法和膜分离技术获得金丝小枣全红果中天然低聚糖,采用酸水解和酶法对枣可溶多糖 进行降解,制备低聚糖;并通过微生物试验测定枣天然低聚糖及枣多糖降解得到的低聚糖的益生 性能。旨在为枣的营养研究增加新的内容,为提高枣的综合利用价值、开发枣功能食品提供理论 依据。 枣的糖分构成分析及低聚糖研究 材料与方法 .试验材料 ..试材 试验用金丝小枣制干品种、冬枣鲜食品种和赞皇大枣制干和蜜枣加工品种三 个 主栽品种的全部试材均于年采自河北沧县红枣良种繁育基地资源圃,其管理水平与栽培条 件基本一致。 金丝小枣枣花和不同发育期果实,选择三行每行株势及树龄较一致的树跟踪采样, 对每行的株树进行混合采样,采样时注意树体每个方向均匀采样,每行为一个重复;冬枣采集 脆熟期枣果,赞皇大枣采集全红期枣果,均选择株生长水平一致的树分别采样,树体每个方向 均匀采样,每株树为一个重复。 将采集得到的所有枣果进行挑选,去除残次果,去核后切成均一薄片,在?条件下电热鼓 风干燥至恒重,粉碎机粉碎后过目筛,置于塑封袋中,在干燥器中储存。 枣花保存于.?备用。 ..主要试剂 色谱纯甲醇、乙腈,均购于上海星可生化有限公司。 购于北京瑞达恒辉试剂有限公司。,美国? 。 葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖标准品,色谱纯。 其他试剂均为国产分析纯,超纯水实验室自制。 ..主要仪器设备 高效液相色谱仪为 型,包括在线脱气机,四元泵,自动进样器,柱温箱,示差 检测器,色谱二作站;色谱柱: .× .。 超滤杯:上海摩速科学器材有限公司。 一超声波清洗机:上海声彦超声波仪器有限公司。 分析天平万分之一:上海天平仪器厂。 ?循环水式多用真空泵:保定高新区阳光科教仪器厂。 .型旋转蒸发仪:上海振捷实验设备有限公司。 超纯水仪:德国公司。 一数字酸度计:杭州东星仪器设备厂。 型微型高速万能试样粉碎机:河北黄骅齐家务科学仪器厂。河北农业大学硕 士学位毕业论文 型紫外检测器:上海美谱达仪器有限公司。 型数显恒温水浴锅:金坛市富华仪器有限公司。 鼓风干燥箱:保定市高新区阳光科教仪器厂。 ? 型超净台,恒温振荡器。 .试验方法 ..各糖分的含量测定 ...游离单糖及蔗糖的含量测定采用高效液相色谱法 标准溶液的准备 储备液的配制:精确称取适量的葡萄糖、果糖、蔗糖标准品,分别用 超纯水 溶解。 单标液的配制:分别吸取一定量的葡萄糖、果糖、蔗糖储备液,分别于支 容 量瓶中, 用超纯水定容。 混标液的配制:分别吸取一定量葡萄糖、果糖、蔗糖储备液,于 的容量瓶中,用超纯 水定容。 所有的标准溶液均于 避光保存,且每天配制,不可使用隔夜溶液。 样品溶液的准备 精密称取枣粉. 】蒸馏水。水浴 ,枣花鲜样. 加蕾英砂充分研磨后,分别用 提取 ,提取两次,过滤,合并两次滤液,定容至 ,取 加入倍体积的%乙醇, 条件下静置过夜,过滤去除多糖沉淀,将上清液用旋转蒸发仪。浓缩至干,然 后用 超 纯水完全溶解,过.“水膜备用。 色谱条件 色谱柱: .× , ; 流动相:乙腈.水:;流速: /;柱温:?;光学元件温度:?。 样品测定 取样品测定液和标准品溶液在上述色谱条件下进样,进样体积均为此。 ...多糖的含量测定采用硫酸一苯酚法 标准曲线制备:精密称取干燥至恒重的葡萄糖对照品. 容量瓶中,蒸馏 ,置于 水定容,配成 /的储备液。分别精密吸取储备液.、.、.、.、.、.、.、 . 置于具塞试管中,加水至 ,另取 蒸馏水作空白对照,然后各加. 的% 苯酚溶液,. 浓硫酸,静置 ,摇匀后室温下静置 ,于 波长比色,测定 吸光度。以吸光度对葡萄糖含量进行回归,得回归方程。 换算因子测定:精密称取干燥至恒重的枣多糖. 容量瓶中,加入少量蒸 ,置于 馏水溶解,并稀释至刻度,精密量取此液. ,按照标准曲线制备的方法测定吸 光度,从回 归方程中求出多糖供试液中葡萄糖的浓度,按下式计算换算因素: /× 中:卜换算因子;~多糖重量;一多糖供试液中葡萄糖浓度;一稀释倍数 枣的糖分构成分析及低聚糖研究 枣多糖的提取:精密称取枣粉. ,枣花鲜样. 加石英砂充分研磨后,分别用 ,提取两次,过滤,合并两次滤液,定容至 ,取 加入 蒸馏水。水浴提取 容量瓶中,待 倍体积的%乙醇,。条件下静置过夜,过滤后,沉淀用热水洗涤定容至 用。 枣多糖的含量测定:精密吸取样品溶液 于试管中,按照标准曲线制备方法测定吸光度, 由同归方程计算供试液中葡萄糖含量,按下式计算样品中多糖的含量:多糖含量%/ 公式中:一样品溶液中葡萄糖的含量/;一样品溶液的稀释倍数;换算因子; 一样鼎质量肚 ...总糖的含量测定采用蒽酮法 葡萄糖标准溶液的配制:取 的容量瓶定容。分 葡萄糖。烘干至恒重丁 至 别取溶液、、、、、、 的容量瓶中,成、、、、、、 /的标准液。 精密量取葡萄糖对照品溶液及样品提取液各 置棕色具塞试管中,分 .%葸酮一硫酸 溶液 ,摇匀,置沸水浴中加热 ,取出,置冰水浴中 ,取出放?,于 进 行比色。测定吸光度。以吸光度对葡萄糖含量进行回归,得同归方程。 枣总糖的提取制备:依照上述...中枣还原糖的样品溶液制备方法。 枣总糖的含量测定:将制得的样品溶液稀释倍后,精密稀释液溶液 于试管中,按照 标准曲线制备方法测定吸光度,由回归方程计算样品中总糖的含量。 ...低聚糖的含量测定 上述...中制备待用的样品溶液,取其中. 用蒸馏水定容至 ,取 于试管 中,按照...标准曲线制备方法测定吸光度,由回归方程计算出此时样品中总 糖的含量。 则以此样品溶液中总糖的量减去...中得到的单糖和蔗糖的含量,即为枣低 聚糖除蔗糖的 含量。 ...还原糖的含量测定采用法 .一二硝基水杨酸溶液的制备:取..二硝基水杨酸. / 浓度为 ,溶于 的氢氧化钠溶液中,再取. 酒石酸钾钠,溶于 蒸馏水,上述两种溶液混合后再加入 亚硫酸钠和结晶苯酚各. ,搅拌溶解后用蒸馏水定容到 ,暗处保存备用。 标准曲线的绘制:取支 具塞试管,分入、.、.、.、. 的 / 葡萄糖标准品,补水至 ,再加入. 试剂,塞好试管,沸水浴 ,以空白为参 比,于 波长处比色,测定吸光度。以吸光度对葡萄糖含量进行回归,得回归 方程。 样品溶液制备:精密称取枣粉. ,枣花鲜样. 加石英砂充分研磨后,分别加入 蒸馏水,。水浴提取 ,提取两次,稍冷去后过滤,合并滤液,将滤液定容至 ,待用。 枣还原糖的含量测定:精密吸取样品溶液. 于试管中,按照标准曲线制备方法测定吸 光度,由回归方程计算样品中还原糖的含量。 河北农业大学硕士学位毕业论文 ..低聚糖的分离纯化 ...低聚糖的提取方法 以沧州良种繁育基地金丝小枣为试材。采取全红期枣果,去核切片,鼓风干燥 至恒重后 粉碎,过目筛储存于干燥器中备用。精密称取枣粉. , ,用 蒸馏水。水浴提取 提取两次,过滤合并两次滤液,?浓缩至 ,加入倍体积的%乙醇,?条件下静置 过夜,过滤去除多糖沉淀,将上清液用旋转蒸发仪。浓缩定容至 ,备用,待分 离纯化。 ...低聚糖的分离纯化 柱除杂质。取上述提取备用的枣低聚糖溶液 上样,用纯水 先通过 洗脱,洗脱过程中用硫酸.苯酚法监测洗脱液中糖的含量以葡萄糖计,至洗脱液中无糖分,收 集到中性低聚糖。氨基酸、色素等其他带电荷的小分子物质将吸附丁层析柱上而不能被纯水洗脱 ’卜.来。 将收集到的洗脱液经旋转蒸发仪减压浓缩至 ,过装填有. 一的层析柱,纯水 洗脱,由于. 有分子筛的作用,不同分子量的糖分流出时间不同,大分子物质将被首 先洗脱,从而达到分离。洗脱过程中收集流分,每管 ,对收集到的组分进行硫酸.苯酚和高 效液相色谱检测,合并单一组分。冷冻干燥后等待进一步研究测定。 ...膜分离 依照上述...所述方法,获得低聚糖的粗提液。由于粗提液中含有大量单糖和小分子杂质, 而低聚糖聚合度在以上的分子量大于 ,所以本试验选用孔径 的纳滤膜对粗提液 进行截留,单糖二糖及小分子杂质将透过纳滤膜,从而截留得到枣低聚糖粗溶液。 膜的性能及对糖溶液的处理效率与温度、溶液浓度、压力等因素有关。组装好超滤杯之后, 用氮气对其加压,在室温条件下,调整氮气不同压力,考察压力对溶液处理速 率的影响,选择压 力水平为.、.、. 膜最大承受压力. ;稀释待处理样品溶液的浓度,考察 不同浓度对溶液处理效率的影响,选择稀释度为.%、.%、.%。 取一定稀释浓度的样品溶液,重复三次过双层慢速滤纸,以除去溶液中