基因差异表达分析法及其在营养代谢病研究中的应用前景

基因差异表达法及其在营养代谢病研究中的应用前景 基因差异表达分析法及其在营养代谢病研 究中的应用前景 动物医学进展.2006,27(9):97—101 ProgressinVeterinaryMedicine 基因差异表达分析法及其在 营养代谢病研究中的应用前景 孙秀娟,郝贵增,徐阊. (1.黑龙江农垦农业职业技术学院,黑龙江双鸭山155811I2.安阳工学院,河南林州 455000I 3.吉林大学畜牧兽医学院,吉林长春130062) 中图分类号:$856.5I$854文献标识码:B文章编号:1oo7—5038(2006)09—0097—05 摘要:基因差异表达分析是比较相关细胞 或组织在特定的生理或病理条件下特殊表型 基因的研究方法,应用于特定情况下的基因 差异表达谱及寻找特异表达基因等研究中. 根据基因差异表达分析方法的原理,主要分4 类,分别为限制性酶切片段差异显示技术,抑 制性消减杂交技术,基于数据库的基因表达 连续分析技术和DNA微阵列技术.文章综 述了这4类主要的基因差异表达分析方法的 原理,基本方法,应用特点及在营养代谢病研 究中的应用前景. 关键词:基因差异表达法;营养代谢病 随着人类基因组测序工作的完成,人类基因组 计划工作重点已经由结构基因组转向功能基因组的 研究.以功能基因组研究为主要内容的后基因组时 代(postgenomics)应运而生,即功能基因组(func— tionalgenomics)时代已经到来.作为功能基因组时 代主要研究内容的基因差异表达分析研究必将成为 分子生物学研究的热点之一[1].生物体表现为各种 各样的特征,主要是由于基因差异表达引起的,生物 体基因表达是按照一定的时间和空间顺序有序进行 的,这些是产生基因差异表达(differentialexpres— sion)的主要原因[2].基因差异表达主要表现为2种 形式,即是否出现新基因和表达量上的变化.基因 表达是生命活动的核心内容,通过基因差异表达的 比较研究,可以为特定生理或病理条件下生命活动 过程提供重要的信息,为疾病的预防,诊断,治疗提 供新的理论,方法和技术.基因差异表达分析的代 表性方法有限制性酶切片段差异显示技术(Restric— tionfragmentdifferentialdisplayPCR,RFDD- PCR),抑制性消减杂交技术(Suppressionsubtrac— tivehybridization,SSH),基因表达连续性分析技术 (Serialanalysisofgeneexpression,SAGE)和DNA 微阵列技术(DNAmicroarray)4类,这些技术也是 目前应用最为广泛,并被科研人员普遍接受的研究 技术.文章对这些基本原理,研究方法和优缺点进 行综述,为科研人员选择适合的技术提供理论上的 参考,最后对其在营养代谢病中的应用前景进行阐 述. 1限制性酶切片段差异显示技术 1.1RFDI).PCR基本原理 AnneG等.首先报道了RFDD-PCP技术,该 技术对差异显示PCR(DD-PCR)做了很大的改进, 因此被称为第二代差异显示技术.RF【)I)_PCR基 本原理:先由mRNA合成cDNA,然后由TaqI酶 酶切cDNA.TaqI酶酶切序列为5,-TCGA-3 3'-AGCT-5 酶切后cDNA结构为5'-CGANNN…NNNT-3 3'-TNNN…NNNACG5 AnneG等报道接头结构为: EP接头:5一ACTGGTCTCGTAGACTGCG— TACC-3 3ddCTGACGTACGGGC—PO.一5 标准接头:5一GCGATGAGTCCTGA(I-3 3'-TACTCAGGACTGGC5 然后将cDNA酶切片段和接头进行连接,结果 为: 5'-ACTGGTCTCGTAGACTGCGTAC— CCGAN…NTCGGTCAGGACTCAT一3 3,_出 收稿日期:2006—06—02 作者筒介:孙秀4~(1980--),女,黑龙江五常人,讲师,主要从事兽医内科学及反刍动 物营养代谢病研究.*通讯作者 98动物医学进展2006年第27卷第9期(总第155期) 将连接好的片断进行PCR扩增反应,5端引物 用荧光Cy5或放射性同位素弛P标记,3端引物退火 结合在接头上,并向eDNA上延伸3个碱基NNN, 每个N代表A,T,G,C4种可能.因此,下游引物 共有64种,可分为64个表达窗.在差异表达分析 时,选择一个共同的上游引物和64种下游引物中的 一 种分别进行扩增,一共完成64个PCR反应,电泳 分离后进行基因差异表达分析. 1.2RFD【)-PCR基本方法 用5T:5V(V—A,G,C)合成eDNA第1条链, 然后用RNaseH和DNA聚合酶I合成eDNA第2 条链.纯化,并用琼脂糖凝胶电泳初步验证合成结 果.TaqI限制性酶切经验证后的双链eDNA,然后 用TtDNA连接酶连接接头并检测连接效率.应用 64个3端引物中的一个和共同的5端引物进行 PCR扩增,经琼脂糖凝胶电泳分离后,回收差异表 达条带,重新PCR扩增,经另一种方法验证后,测 序,结果与GenBank数据库比较[']. 1.3RFDD—PCR的优缺点 RFDD-PCR作为第2代差异显示技术,其优点 主要表现在:?能够完整分析整个基因组;?需要样 本量少,可同时比较多个样本;?降低假阳性率:应 用特异性接头,使PCR扩增具有高度的特异性和可 重复性,大大降低假阳性率;?重点扩增编码区. PCR反应不以poly(A)为下游引物,扩增序列不会 为靠近poly(A)的非编码序列,TaqI酶优先切割 翻译序列,因而可重点展示编码区;?灵敏性提高. 应用标记有荧光Cy3或放射性同位素P的引物进 行扩增,使得检测的灵敏度大大提高,同时检测更加 便利;?费用较低;?适用于原核和真核生物.但 是,RFDD-PCR仍然存在一些缺点,比如假阳性仍 然存在,以及差异片段较短等问[. 2抑制性消减杂交技术 2.1SSH基本原理 SSH技术是由DiatehenkoL等于1996年首 先建立的一种以PCR反应为基础的eDNA削减杂 交方法,称为抑制性削减杂交法.其原理是通过合 成两个不同的接头,接于经限制性内切酶消化后的 TestereDNA片段的5端,从而达到选择性扩增目 的eDNA片段的要求,同时SSH巧妙整合抑制原理 设计接头,使PCR引物识别接头序列扩增目的片段 的同时,非目的片段因接头产生链内互补"锅柄样" 结构而停止扩增,抑制非目的eDNA的扩增.其主 要是通过连接于DNA片段末端的长反向重复序列 设计,来实现选择性抑制非需要序列扩增的.又根 据杂交二级动力学原理,高丰度单链DNA退火时 产生同源杂交的速度快于低丰度单链DNA,使原存 在丰度差异的基因片段含量趋于一致,促进低丰度 的差异表达基因被检出[7]. 2.2SSH基本方法 SSH的操作方法如下:抽提Tester和Driver的 mRNA,反转录成eDNA,用内切酶酶切后,eDNA 形成小片段,将TestereDNA分成相等的2份,分别 连上接头1和接头2,然后与过量的Driver进行不 充分的杂交,杂交后有4种产物,即a为单链Tester eDNA,b为单链TestercDNA自身退火形成的双链 eDNA,e为单链TestercDNA和单链DrivercDNA 退火形成的杂交双链,d为DrivercDNA双链.根 据复性动力学原理,浓度高的单链分子复性速度快, 第1次杂交后各种单链分子在浓度上基本一致.由 于Tester和Driver中共同表达的基因大多数被中 和,形成杂交体,使得Tester中差异表达基因的eD— NA得到大量富集.第1次杂交后,混合两份Test— er产物,再加入变性后的Driver,进行第2次杂交. 第2次杂交进一步减少了Tester中非差异表达的 cDNA,同时进一步富集了差异表达的基因,同时产 生了含有两个不同接头的杂交分子e,能在PCR反 应中有效扩增.然后补平黏性末端,进行套式PCR 反应,即在接头上设计内外两对引物,先后进行扩 增.其中e型分子两端与引物特异性配对,进行有 效扩增;e分子一端有引物扩增效率极低;b分子形 成"平底锅"二级结构,无法进行有效扩增.然后进 行第2轮PCR,可极大地提高扩增的特异性,最后得 到的绝大多数为e型分子,其中大多数为目的片段. 然后将PCR产物转化细菌,构建差异表达文库,接 着对其验证. 2.3SSH的优缺点 SSH的优点主要体现在:?SSH法采用两次杂 交,两次PCR,大大降低了假阳性率;?高敏感性. 该技术有均等化高,中,低丰度基因和富集低丰度 mRNA的作用,使得低丰度基因被检出率大大提高; ?避免了以往削减杂交中烦琐的分离单,双链DNA 的步骤;?操作简单化.因此,SSH技术更适用于 分离,鉴定与疾病,发育,组织特异性相关的差异表 达基因.但是,该技术同样存在许多缺点:?该方法 孙秀娟等:基因差异表达分析法及其在营养代谢病研究中的应用前景99 需要较纯的mRNA且需要量较大,可达2Og,这对 于一些研究是很难达到的,如活组织采样的样本及 胚胎干细胞样本等;?被酶切的cDNA,其长度变的 较短,可能影响结果的判定;?更多的依赖PCR技 术;?SSH要求Tester与Driver具有高度相似性, 否则筛选,鉴定工作高度冗杂;?SSH仍然存在 5O左右的假阳性,结果需要Northern杂交分析 验证. 3基因表达连续分析技术 3.1SAGE基本原理 1995年,VelculescuVE等[8建立了基因表达 的连续分析技术.SAGE技术主要包括两个核心部 分:首先,获得带两个不同接头(A或B)的长度为9 个,14个核甘酸的序列标签,这些标签能特异地代 表特定mRNA转录物.然后将带不同接头的两个 标签序列进行连接,作为PCR.其次,在一个 克隆里可以将上述经PCR扩增并用锚定酶酶切的 双标签序列串联起来并进行测序,然后将测序结果 在特定数据库中进行检索鉴定.这些成串的转录 本,因SAGE标记物是短的而且大小上一致,扩增 的错误会减少到最小,故作为一个高度敏感系统, SAGE技术可以用于低丰度序列的确定.另外,一 个9个核苷酸组成的标签代表4.=262144种组合, 从原理上讲,获得的长度为9个,14个核甘酸的标 签序列即可以来代表所有人的转录本]. 3.2SAGE基本方法 SAGE基本方法如下:在一个组织或细胞系中 提取mRNA,利用生物素化的引物poly(T)将mR— NA反转录为双链cDNA,cDNA用锚定酶如普通的 N/a111酶切消化,产生3黏性末端.消化产物被分 成两组并分别与接头A和B相连接.接头的3端 含有典型的?型非对称性限制性内切酶即标签酶识 别位点(如Bsmf1).Bsmfl切割识别位点下游 14bp的DNA,将单一的SAGE标记物从结合在磁 珠上的cDNA中释放出来.SAGE标记物由5Obp 组成(36bp的接头加上14bp的标记物)并含5突 出端,用Klenow片段将其补平.这两种接头群体 经平端连接而形成双标签物约100bp,通过PCR加 以扩增.然后用引物A和引物B作PCR扩增连接 好的双标签序列片段.引物A和B分别包含在接 头A和B中.双标签物经锚定酶N/a111酶切,从接 头上释放出约28bp的单一标记物,并且通过黏性 末端连接形成多联体.连接好的双标签序列一般含 有大约3O份,5O份双标签序列,将连接好的双标 签序列克隆到测序载体中并测序.最后利用SAGE 软件包对序列数据进行归档.统计用上述方法得到 的来自不同转录本的SAGE标签数目,估计相应转 录本的表达丰度口. 3.3SAGE的优缺点 SAGE作为一种基因表达连续分析技术具有如 下优点:?可对大量基因产物进行即时和定量分析, 在基因表达连续性分析中具有更大的优势;?可以 用来研究大部分基因组序列尚未鉴定的生物个体的 基因表达谱;?实验结果可以直接与发表在SAGE map表达数据库中的不同来源的已存在文库相比 较;?假阳性率较低,精确度较高,较小的差异表达 基因也不易丢失;?具有成本低,效率高的特点[g]. 虽然SAGE法存在诸多优点,但是,也有一些不足, 主要体现在:?需要大量的测序工作;?建立SAGE 库所需要的mRNA量较大;?如何进一步分析 SAGE法获得的未知标签.由于SAGE标签只有 9bp~14bp,如果因为PCR或测序错误引起碱基 变异,将影响结果的分析. 4DNA微阵列技术 4.1DNAmicroarray基本原理 基因芯片又称DNA芯片,按片基的不同可分 为无机片基(如半导体硅片,玻璃片)和有机合成物 片基(如硝纤膜,尼龙膜).基因片段的固定方式有 原位合成和合成后点样两种.基质为玻璃者称为微 阵列(DNAmicoarray),基质为硅晶片原位合成者 称寡核苷酸阵列(olignudeotidearray).其基本原 理是,将大量探针分子固定于支持物上,然后与标记 的样品cDNA杂交,杂交信号阳性的探针分子就是 在组织或细胞中表达的基因,若同时将两组或多组 有表达差异的组织或细胞cDNA分别与芯片杂交, 芯片上信号分子的分布和强度就会有所不同,根据 信号分布和强度就可以判断基因差异表达的情 况[11-12]. 4.2DNAmicroarray基本方法 DNAmicroarray操作的基本方法如下:提取待 测样品中的mRNA后,通过反转录反应获得标记荧 光的cDNA,将获得的cDNA与微阵列上的DNA探 针进行杂交,反应3Omin到2Oh后,将玻片上未被 结合的片段洗去,再对玻片进行激光共聚焦扫描,测 1OO动物医学进展2006年第27卷第9期(总第155期) 定微阵列上各点的荧光强度,从而推算出待测样品 中各种基因的表达水平.若要比较两个不同的细胞 系或两个不同来源组织中的基因表达差异,则要先 从细胞系或组织中提取mRNA,通过反转录反应标 记上不同颜色的荧光,等量混合后,与包含上千个基 因的DNA微阵列进行杂交反应,对玻片进行激光 共聚焦扫描.比较两种荧光在各点阵上的强度,就 可以推算出各基因在不同细胞系或组织中的相对表 达水平.每小块微阵列芯片可容纳一万多个DNA 点,因此,它的分析效率是非常高的[1引. 4.3DNAmicroarray的优缺点 DNAmicroarray是非PCR技术基础的新方 法,具有如下优点:?高度并行性.利用DNA芯片 技术获得大量并行数据并进行分析.并行性使实验 速度加快,同时芯片上代表基因的可比性加强. DNA芯片的一次反应几乎能够分析整个人的基因. ?微量化.芯片技术减少了实验消耗,最小化了反 应体积,但增加了样品浓度,加速了反应动力学. ?多样性.芯片技术能够在一次反应中分析多个样 本.新的标记和检测方法的采用,如多色荧光标记, 使一块芯片能比较多个样本.这样就使得比较分析 非常精确而避免了芯片间的变异造成的误差I?自 动化.先进的制造技术使得芯片的制造自动化,计 算机的引入使得数据的采集和分析自动化.这也是 DNAmicroarray的最突出特点.但是,该技术同时 存在一些缺点:?价格昂贵,使用该方法的成本与其 他方法相比要高的多;?需要大量的RNA,每次需 5Omg,200mg总RNA,对于低拷贝数的mRNA 需要量更大,所以分析少量的临床标本存在困难I ?需要完善的基因数据信息,无法获得未知基因,需 要一系列克隆或已知基因的寡核苷酸,对于未完成 测序工作的生物样本不适用该方法I?与其他方法 相比,灵敏度较低,定量特性较差[1'.. 基因差异表达分析的方法众多,以上介绍的是 目前常用的4种基因差异表达分析方法,它们都存 在各自的优势和缺点.在实际工作中可根据研究对 象,实验要求,实验目的和实验室条件进行选择,在 实验前要进行充分考虑,选择适宜的方法. 5基因差异表达在营养代谢病研究中的应 用前景 随着人类基因组测序工作的完成及其他生物基 因组测序工作的迅速发展,功能基因组研究必将成 为后基因组时代的主要研究内容,而基因差异表达 研究作为功能基因组研究的重要组成部分也必将成 为自然科学研究的热点之一.目前,基因差异表达 研究已经广泛应用到诸多领域,如创伤再生[1引,卵 母细胞特异基因发现?],转录调控信号转导"],生 理病理引,肿瘤发生?],疾病诊断治疗列等,克隆 筛选出许多重要的相关基因,为了解生命活动奠定 基础. 营养代谢病主要是由于营养物质(糖,脂,蛋白 质,维生素,微量元素等)代谢紊乱引起的一类疾病. 在该类疾病的发生发展过程中,涉及营养物质代谢 的相关酶,辅酶,蛋白基因的表达必定会发生改变. 因此,研究该类疾病的基因差异表达情况,对阐明营 养代谢病的发病机理,寻找特异性基因诊断方法及 治疗药物具有重要意义.营养代谢病基因差异表达 方面的研究在今后的一段时间里将成为该类疾病研 究的重要内容,将为该类疾病的研究提供大量的实 验数据及方向.基因差异表达技术在营养代谢病研 究中必将得到广泛应用和拥有美好前景. 参考文献: E1]周廷凯,周建林,聂东宋.筛选差异表达基因方法的新进展[刀. 生物技术通讯,2004,15I620-622. [2]LiengP,ArthurBP.Differentialdisplayofeukaryoticme.q- sengerRNAbymean8ofthepolymerasechainreaction[J]. Science,1992,257l967. [3]AnneG,PeterW,SusanneK,eta1.Restrictionfragmentdil- ferentialdisplayofpediocin-resistantImonocytogenes 412mutants8hOW8consistentoverexpressionofaputative glucoside-specificPTSsystem[J].Microbiology,2000,146l 1381. [43胡岳山,李杰芬,壬创.限制性爵切片段差异显示及其应用 [刀.生物技术通讯,2004,1564-65. [53李超伦,粱景平.差异表达分析法在细菌致病相关基因研究中 的应用[刀.徽生物学免疫学进展,2005,33(5)48—51. [53DiatchenkoL,LanYF,CampbenAP,etaLSuppressionsub— tractivehybridizationlamethodforgeneratingdifferentialreg- ulationortissue-speci~ccDNAprobeandfibraries[J].Proc NatlAcadSdUSA,1996,93(12)l6025—6030. [73周安宇,张宏,壬海燕.基因差异表达研究方法的进展及其在 肾脏科学研究中的应用[J].国外医学一泌尿系统分册,2002, 22(4)l242-246. [83VdculesCUVE.ZhengL.Vogel8tdnB.et8LS@~ial8analysis geneexpression[J].Science,1995,270l484-488. [93谢超,刘荷中,裴葺涛.基因表达连续分析技术及应用研究的 进展[J].国外医学一分子生物学分册,2002,24(6)369—373. [1O3孙立军,陈忠平,黄强.基因差异表达的高通量分析及其在 肿瘤研究中的应用[刀.癌症,2002,21(5)l571—575. 动物医学进展.2006,27(9):101—104 ProgressinVeterinaryMedicine 一 种有效的免疫学检测技术ELISPOT 熊仲良,邓小红.,曾政 (1.重庆市动物卫生监督总站,重庆401147;2.重庆工商大学药物化学与化学生物学 研究中心,重庆400067) 中圈分英号:S854.43文献标识码:B文覃嗣号:1007—5038(2006)09—0101—04 摘要:20世纪80年代中期,国外的科研工和抗体分泌量很少,且半衰期短,因此往往不能有效 作者根据ELISA技术的基本原理,建立了体的检测出来,ELISPOT(enzyme-linkedimmunos一 外检测特异性抗体分泌细胞和CK分泌细胞pot,ELISPOT)~20世纪80年代中期出现, 的固相酶联免疫斑点技术(ELISPOT).因其并逐渐发展和完善起来的一种能够从单细胞水体外 具有较高的,i-~-j异7性,稳定性和敏感性,已广泛检特异性抗体分泌细胞和细胞因子分泌细胞的免 应于免各领域.文章翟介每了'EusPoT . 技术发展和应用,并分析了其优1ELISPOT技术的发展史 缺点,操作注意事项及可行性.(1)溶血空斑技术(hem.IyticpIaquef.rlIling 关键词:酶联免疫斑点技术;免疫学;发展和c11asay,HPF).1963年Jm等人创立的用于检 应用测单个抗体形成细胞的免疫学技术,可以从单细胞 在研究机体免疫免疫应答机制的时候,常常需水平研究抗体的产生,但不够灵敏,并且红细胞的特 要通过体外检测各种细胞因子和抗体,但细胞因子性决定了其应用的局限性. 收稿日期:2006-07—11 作者简介:熊仲良(1962一),男,四川泸州人,高级兽医师,主要从事重大动物疫病诊断工作. 料料料 [11]SchenaM,ShalonD,DavisRW,etakQuantitativemonito— ringofgeneexpressionpatternswithacomplimentaryDNA microarray[J].Science,1995,270l467—470. [123LockhartDJ,DongH,ByrneMC,etaLExpressionmoni— totingofhybridlzationtomghdensityoligoneucleotidearray [刀.NatBiotech,1996,14l1675—1680. [133周芳,杜迎翔,周国华.基因表达量测定方法研究进展[刀. 药物生物技术,2004,11(4).267-270 [143周安宇,张宏,王海燕.基因差异表达研究方法的进展及其 在肾脏科学研究中的应用[刀.国外医学一泌尿系统分册, 2002,22(40)l242—246. [153God(redM,XlnmlnL,DavidJ,eta1.Isolationofwound healing/regenerationgenesusingrestrictivefragmentdiff entialdisplay-PCRinMRL/MPJandC57BL/6mice[J].BiG— chemicalandBiophysicalResearchCommunications,2005, 330(1)l117—122. [163KarineT,ChristianV,SergeMG,eta1.Identificationand characterizationofanovelbovineoocyte-spedficsecretedpro- teingene[J].Gene,2006,375(21)l44—53. 砷H*e靠砷H*e [173OiovannaT,RodolIoB.MilenaR,etakAcetyl-bcarnitine up-regulatesexpressionofvoltage-dependentanionchannelin theratbrain[J].NeurochemistryInternational,2006,48(8)l 673-678. [183lolitaJ,UtheT,ThomasJ,eta1.Analysisofporcinediffer- entialgeneexpressionfonowingchallengewithSalmonella ente~ica$ernva~Choleraesuisusingsuppressionsubtractive hybridization[J],VeterinaryMicrobiology,2006,114(1—2)l 6O-71. [193JaeYL,SangHL,HeungML,etaLAnalysisofgeneex— pressionprofilesofnormalhumannasalmuco~aandnasalpol- YPtissuesbySAGE[J].JournalofAllergyandClinicalIm— munology,InPress,Availableonline30May2006. [2O]NadiaET,MonikaP,KatrinH,eta1.Rapiddetectionand spedesidentificationofMycobacteriumspp.usingreal-time PCRandDNA-Microarray[J].JournalofMicrobiological Methods,2006,66(1)l116—124.