钙_镁离子在活化HL_60细胞核酸内切酶中的作用不同

钙_镁离子在活化HL_60细胞核酸内切酶中的作用不同 ( ) C 辑中国科学 ( )SCI ENCE IN CHINA Series C 第 28 卷 第 3 期1998 年 6 月 钙 、镁离子在活化 HL260 细胞核酸 3 内切酶中的作用不同 3 3 方 敏张鸿卿薛绍白 ( ) 北京师范大学生物系 ,北京 100875 E GTA , ED TA 抑制游离 HL260 细胞核中核酸内切酶的活化. ED TA 对游 摘要 2 + 离 HL260 细胞核中核酸内切酶活性的抑制可被外加 Ca逆转 ,而 ED TA 对该酶活 2 + 性的抑制却不能被外加 Mg逆转. 用 CH EL EX 100 去除游离核孵育缓冲液中存在 2 + 2 + 2 + () 的 Ca,Mg后 ,外界 Ca1,10 mmol/ L 单独可诱导游离 HL260 细胞核中的核 2 + 酸内切酶活化 , 且强度一致 ; 而外加 Mg则不能诱导该酶活性. 只有在钙存在 2 + () 这说明 HL260 011,10 mmol/ L 的条件下 ,该酶活性才随 Mg浓度增高而增高. 2 + 2 + 细胞中核酸内切酶的活化必须有 Ca存在 ,在 Ca存在的条件下 ,其活性可被镁增 2 + 2 + 强 ,Ca和 Mg在核酸内切酶活化中的作用是不同的. HL260 细胞 钙离子 镁离子 D NA 自消化方法 核酸内切酶 细胞凋亡 人 关键词 () 细胞凋亡 apop to sis除去典型的形态学特征如细胞质膜 、核膜出泡 、染色质凝集外 ,导致 1 细胞核 DNA 寡聚核小体间降解的核酸内切酶的活化是其最重要的生物化学特征,因此核 酸内切酶活性的研究一直是细胞凋亡研究的焦点之一. 一般认为 ,胸腺细胞凋亡过程中活化 2 + 2 + 2 ,3 2 + 2 + 的核酸内切酶具有 Ca, Mg依赖性, 只有在 Ca, Mg同时存在的条件下才能被活 4 化. 但是在人早幼粒白血病 HL260 细胞中 ,导致细胞凋亡过程中 DNA 核小体间降解的核酸 5 ( 内切酶仍然存在很大争论. 本文采用游离核 DNA 自消化方法 DNA auto digestio n met h2 2 + 2 + ) o ds,研究 Ca, Mg对 HL260 细胞游离核中核酸内切酶的活化作用及其与细胞凋亡的关 系. 1 材料和方法 111 试剂 ( ) ( ) E GTA 、ED TA 、harringto nine H T、camp tot hecin CAM、氢离子载体 nigericin 、aurint ricar2 () bo xylic acid A TA、ZnCl、RNase A 购自 Sigma ,CH EL EX 100 购自 Bio2RAD CO . ,BA P TA2AM2 1997202220 收稿 ,1997208208 收修改稿 ( ) 3 国家自然科学基金资助项目批准号 :39730160 和 39670204和国家教委博士点基金资助项目 3 3 联系人 购自 Molecular Pro be ,其他试剂均购自 Sigma . 112 细胞培养 ( ) HL260 细胞由 J apanese Cancer Reso urce Bank To kyo , J apan惠赠 ,本室保存 , R PM I 1640 μ 中补加 10 %胎牛灭活血清 ,100 单位/ mL 青霉素 ,10 g/ mL 链霉素 ,2 mmol/ L L2谷胺酰胺 , 37 ?,5 %CO培养 ,所有实验均在细胞处于指数生长期时进行.2 113 游离细胞核的获得6 8 10,10细胞以冷 PB S 洗 3 次 ,悬浮在 50 mL 1 . 5 mmol/ L MgCl溶液中 ,4 ?,振摇 30 2 ( min ,800 ×g 离心 10 min . 沉淀溶于 TP EE 中 0101 mmol/ L Tris2HCl ,p H7 . 5 , 0 . 15 mmol/ L ) Sper min , 0 . 5 mmol/ L 亚精胺 ,0125 mol/ L 蔗糖,匀浆器中匀浆 5 次 , 800 ×g 离心 10 min . 沉淀溶于 5 mL TP EE 中 ,轻轻铺在 20 mL 2 . 3 mol/ L 蔗糖溶液中 ,40 000 ×g 离心 45 min ,沉 淀溶于 5 mL TP EE 中 ,测酸性磷酸酶 、葡萄糖六磷酸酶 、琥珀酸脱氢酶活性 ,3 种酶活小于正 ( 常细胞匀浆的 5 %即可. 测活后 ,细胞核悬浮在游离核孵育缓冲液中 10 mmol/ L Tris2HCl , ) 10 mmol/ L NaPO, p H7 . 4. 3 4 114 Autodigest ion 6 7 2 + 2 + ( 10,10游离 HL260 细胞核 ,在孵育缓冲液 或加入不同浓度 Ca,Mg, E GTA 或 ED2 6 2 + 2 + ) h TA 或用无 Ca, Mg孵育缓冲液中 37 ?孵育 4 . 10 mL 孵育缓冲液中加入 1 g 2 + 2 + CH EL EX 100 ,搅拌过夜 ,10 000 ×g 离心 ,上清液为无 Ca,Mg孵育缓冲液. 115 D NA 提取 6 μ( 10细胞或游离核 ,加入 200 L 细胞裂解液 50 mmol/ L Tris2HCl ,10 mmol/ L ED TA ,重 ) 量体积分数为 015 % N2lauro gl sarco sine , 0 . 5 mg/ mL p roteinase K,50 ?, 1 h ;加入 RNase A , μ() 使终浓度至 015 mg/ mL ,50 ?,1 h ;加入 200L T E 缓冲液 ;以酚 :氯仿 :异戊醇 25?24?1抽提 3 次 ,加入 2 倍体积无水乙醇及 011 体积 3 mol/ L 醋酸钠 , - 80 ?过夜 , 14 000 ×g 离心 15 μmin ;沉淀溶解在 50 L T E 缓冲液中. 116 D NA f ragment 定量 ( HL260 细胞游离核经过孵育后 , 800 ×g 离心 20 min , 沉淀溶解在 3 mL lysis 缓冲液 5 ) mmol/ L Tris2HCl ,20 mmol/ L ED TA ,体积分数为 015 % Trito n X2100 ,p H 8 . 0中 ,27 000 ×g 离心 45 min ,沉淀以 3 mL T E 溶解 ,上清液及沉淀中 DNA 含量分别用二苯胺方法测得. DNA f ragmentatio n 以上清液中 DNA 量占总 DNA 含量的百分比示. 2 结果 211 游离 HL260 细胞核中的核酸内切酶活性 ( ) 高纯度 HL260 细胞核在游离核孵育缓冲液中孵育 4 h ,可检测到核酸内切酶活性 图 1, 2 + 2 + 如果不螯合游离核孵育缓冲液中的痕迹 Ca,游离 HL260 细胞核中核酸内切酶活性随 Mg 2 + () 浓度增高而增高 ,而 0,10 mmol/ L 外加 Ca都能诱导程度相近的核酸内切酶活性 图 1. 212 ED TA 及 EGTA 对 HL260 游离核中核酸内切酶活性的抑制 ( ) ED TA 和 E GTA 都能抑制游离 HL260 细胞核中核酸内切酶的活化 图 2 ,3 ,带 3. 由于 2 + 2 + 2 + ED TA 对 Ca,Mg几乎无选择性 ,而 E GTA 虽然对 Ca具有较高的选择性 ,但也能螯合一 2 + 2 + 2 + 定浓度的 Mg,因此这不足以说明 HL260 细胞核中的核酸内切酶对 Ca,Mg的依赖性. 221 : 钙 、镁离子在活化 HL260 细胞核酸内切酶中的作用不同 方 敏等 第 3 期 2 + 2 + 图 1 Ca,Mg对游离 HL260 细胞核中核酸内切酶活力的影响( ) 游离核在孵育缓冲液或加入不同浓度 CaCl 和 MgCl中孵育 4 h 后 ,提取 DNA , 电泳或进行 DNA f ragmentatio n 2 22 + ( ) 定量 ,阴性对照为游离 HL260 细胞核 4 ?孵育 4 h ,阳性对照为游离 HL260 细胞核 37 ?孵育 4 h . ACa对游离 HL260 细胞核中核酸内切酶活力的影响. 1 为阴性对照 ,2 为阳性对照 ,3,10 为 CaCl浓度 ,依次是 011 ,015 ,110 , 2 2 + λ() () 2 ,5 ,10 ,20 ,50 mmol/ L . M 为 DNA 标记 , DNA , Hind ?酶切. a相应的 DNA f ragmentatio n . BMg对游离 2 + ( ) ( ) HL260 细胞核中核酸内切酶活力的影响 ,Mg浓度设定同A. b相应的 DNA 碎片 图 2 2 mmol/ L E GTA 对游离 HL260 细胞核中核酸内切酶的抑制不能被 MgCl恢复 2 ( ) () 方法同图 1 . ADNA 电泳图 , a相应的 DNA f ragmentatio n . 1 为阴性对照 ,2 为阳性对照 ,3,11 为游离核孵育缓 冲液中含 2 mmol/ L E GTA ,同时加入不同浓度 MgCl,依次为 010 ,0 . 1 ,0 . 5 ,1 ,2 ,5 ,10 ,20 ,50 mmol/ L . M 为 DNA 2 λ标记 , DNA , Hind ?酶切 图 3 不同浓度 ED TA 对游离 HL260 细胞核中核酸内切酶的抑制可被 CaCl恢复 2 ( ) () ( ) () ( ) () 方法同图 1 . A2 mmol/ L ED TA , B3 mmol/ L ED TA , C5 mmol/ L ED TA. a、b、c相应的 DNA 碎片程度 定量. 1 为阴性对照 ,2 为阳性对照 ,3,11 为游离核孵育缓冲液中含 ED TA ,同时加入不同浓度 CaCl,依次为 010 , 2 λ011 ,015 ,1 ,2 ,5 ,10 20 50 mmol/ L . M 为 DNA 标记 , DNA , Hind ?酶切 2 + 但由于 E GTA 对游离 HL260 细胞核中核酸内切酶活性的抑制不能被任何浓度的 Mg恢复 , 而 2 ,3 ,5 mmol/ L ED TA 对游离 HL260 细胞核中核酸内切酶活性的抑制却分别可被 5 ,10 ,10 , 2 + () 20 ,20 ,50 mmol/ L CaCl恢复 图 2 ,3,说明 Mg单独不能活化游离 HL260 细胞核中的核酸 2 2 + 内切酶 ,而 Ca单独可活化游离 HL260 细胞核中的核酸内切酶. 从图 3 还可看出 , ED TA 浓 2 + 度越高 ,逆转 ED TA 抑制所需的外界 Ca浓度也就越高 ,两者具有很好的对应关系.2 + 2 + 213 Ca, Mg与游离 HL260 细胞核中核酸内切酶活性的关系 2 + 2 + 为了精确研究 Ca和 Mg对游离 HL260 细胞核中核酸内切酶活性的影响 ,我们用 2 价 2 + 2 + - 9 ) ( 阳离子螯合树脂 CH EL EX 100 螯合游离核孵育缓冲液中的 Ca和 Mg< 10 mol/ L 后 , 2 + 2 + 加入已知浓度的 Ca和 Mg,诱导游离 HL260 细胞核中的核酸内切酶活化. 在此情况下 ,2 + 2 + 外源 Mg也不能诱导游离 HL260 细胞核中的核酸内切酶 ,而外源 Ca则可诱导游离 HL260 ( ) 细胞核中的核酸内切酶活化 图 4 . 游离 HL260 细胞核中核酸内切酶的活化至少需要 1 2 + 2 + 2 + mmol/ L Ca,1,10 mmol/ L Ca诱导程度相同的核酸内切酶活性 , Ca浓度与核酸内切酶 2 + 2 + () 活性之间并没有线性关系 图 4. Mg虽不能诱导核酸内切酶活化 ,但在 1 mmol/ L Ca存 2 + () 在时 ,Mg0 . 1,10 mmol/ L 可增强游离 HL260 细胞核中的核酸内切活性 ,而 > 20 mmol/ L 2 + (() ) Mg也抑制该酶活性 图 5 A. 由于不经特殊处理的缓冲液中一般含有毫摩尔级自由钙 , 因此这与图 1 可很好地吻合. 2 + 2 + 2 + 2 + 图 4 CHEL EX 100 去除孵育缓冲液中 Ca和 Mg后 ,外加 Ca,Mg对游离 HL260 细胞核中核 ()酸内切酶活性的影响 阴性对照 ,阳性对照 ,同图 1 2 + 2 + 2 + ( ) A无 Ca,Mg孵育缓冲液中 ,外加 Ca对核酸内切酶活性的影响. 1 为阴性对照 ,2 为阳性对照 ,3 ,11 为无 2 + 2 + Ca,Mg游离核孵育缓冲液中外加不同浓度 CaCl,依次为 010 ,0 . 1 ,0 . 5 ,1 ,2 ,5 ,10 ,20 ,50 mmol/ L . M 为 DNA 2 2 + 2 + 2 + λ() () 标记 , DNA , Hind ?酶切. a相应的 DNA 碎片 ; B无 Ca, Mg孵育缓冲液中 ,外加 Mg对核酸内切酶活性 ( ) ( ) 的影响. 1 为阴性对照. 2 为阳性对照. 3,11 为 MgCl浓度设定同A. M 为 DNA 标记. b相应的 DNA 碎片 2 2 + 2 + Mg还可降低游离 HL260 细胞核中核酸内切酶对 Ca的依赖性. 在 015,10 mmol/ L 2 + 2 + Mg存在时 ,015 mmol/ L Ca就可诱导游离 HL260 细胞核中核酸内切酶活化 ; 在 5 或 10 2 + 2 + mmol/ L Mg存在时 ,011 mmol/ L Ca就可诱导游离 HL260 细胞核中的核酸内切酶活化 ,且 2 + (( ) ) () 该酶活性也随 Mg增高而增高 图 5 B、C. 214 HL260 细胞凋亡过程中活化核酸内切酶与游离 HL260 细胞核中核酸内切酶活性比较 抗肿瘤药物诱导 HL260 细胞程序死亡过程中活化的核酸内切酶可被胞内钙螯合剂 BA P2 TA2AM 抑制 ,而游离 HL260 细胞核中的核酸内切酶也可被钙螯合剂 E GTA 抑制 ;而且两者都 223 : 钙 、镁离子在活化 HL260 细胞核酸内切酶中的作用不同 方 敏等 第 3 期 2 + 2 + 图 5 Mg可降低游离 HL260 细胞核中核酸内切酶对 Ca的依赖2 + 2 + ( ) () ( ) 无 Ca,Mg游离核孵育缓冲液中分别加入 1 mmol/ L A,015 mmol/ L B,0 . 1 mmol/ L CCaCl ,再加入不同浓 2 ( ( ) () ( ) ) ( () ( ) () ) 度 MgCl,37 ?孵育 4 h ,提取 DNA 电泳A、B、C或 DNA 碎片定量a、b、c,阴性对照、阳性对照同图 2 1 . 1 为阴性对照 ,2 为阳性对照 ,3,11 为 MgCl,浓度依次是 010 ,0 . 1 ,0 . 5 ,1 ,2 ,5 ,10 ,20 ,50 mmol/ L MgCl,M 为 2 2 DNA 标记 2 + ( ) 可被 Zn抑制 ,具有相同的 p H 值范围 ,都不能被广谱核酸酶抑制剂 A TA 抑制 表 1. 说明 抗肿瘤药物诱导的 HL260 细胞凋亡过程中活化的核酸内切酶就是游离 HL260 细胞核中由 2 + Ca活化的核酸内切酶. 表 1 游离 HL260 细胞核中的核酸内切酶活性与抗癌药物诱导的 HL260 细胞凋亡过程中出现 )a的核酸内切酶活性比较 游离 HL260 细胞核 HL260 细胞凋亡 2 + + + Ca螯合剂 1 mol/ L ZnCl + + 2 A TA - - )b 7 最适 p H 值7 ) a使用游离核 DNA 自消化方法检测游离 HL260 细胞核中的核酸内切酶活性. 见材料和方法. 游离核孵育缓冲液中2 + 加入 Ca螯合剂 E GTA 2 mmol/ L , ZnCl , 0 . 002 , 0 . 02 , 0 . 2 , 2 mmol/ L A TA 或调节 p H 值. 细胞凋亡过程中的核酸内切酶 2 2 + μμ( ) ( ) 活性检测方法如下 : HL260 细胞经 H T 或 CAM 012 g/ mL 处理 , 同时加胞内 Ca螯合剂 BA P TA2AM 10 mol/ mL , ZnCl,1 mol/ L , A TA 2 mmol/ L , 提取 DNA 电泳. + 表示抑制 , - 表示无影响 2 ) b胞内 p H 值设定方法见文献7 3 讨论 2 + 2 + 胸腺细胞程序死亡过程中核 DNA 的核小体间断裂是 Ca2Mg依赖的核酸内切酶活化 3 2 8 9 I导致的. 属于这类钙 、镁依赖的核酸内切酶主要有 N uc18 ,cyclop hilin及 DNase 等. 2 + 2 + 2 + 2 + 在无细胞体系中 ,该酶的活化至少需要毫摩尔级 Ca和 Mg同时存在 ,缺 Ca或 Mg都不 2 + 能诱导该酶活化. 它可被 Zn、广谱核酸酶抑制剂 A TA 抑制 ,p H 7 . 0,8 . 0 时活力最佳. 因 4 此一般认为这个问题在胸腺细胞中已经得到解决. 在 HL260 细胞中 ,导致细胞凋亡过程中核 DNA 核小体间断裂的核酸内切酶 ,特别是胞内2 + Ca与 HL260 细胞核酸内切酶活化的关系却很不清楚. HL260 细胞凋亡过程中核酸内切酶 活化不被胞外钙离子螯合剂 E GTA , CH EL EX 100 抑制 ,但却被胞内钙离子螯合剂 BA P TA2 5 2 + 2 + AM 所抑制. 在 HL260 细胞凋亡过程中又测不到 Ca的升高 ,因此只能推测胞内 Ca在HL260 细胞核酸内切酶的活化中起某种作用. 本文结果表明 HL260 细胞中核酸内切酶的活 化需要预先存在一定浓度的钙离子 ,但其活性并不依赖于钙 ,很好地解释了这个问题. 据报道 HL260 细胞中至少可能存在以下几种核酸内切酶 , 即镁离子依赖的核酸内切 62 + 2 + 10 1112 酶?? 、Ca2Mg不依赖的核酸内切酶、DNase及 DNase. 但是他们的实验体 2 + () 系存在以下几个问题 : 1没有去除游离核孵育缓冲液中的痕量 Ca,而我们的结果表明如果2 + 2 + () 游离核孵育缓冲液中存在 Ca0 . 1,10 mmol/ L ,则该核酸内切酶活性就随 Mg浓度而增 () 加 ; 2没有将游离 HL260 细胞核中活化的核酸内切酶活性与 HL260 细胞凋亡过程中活化的 ( ) 核酸内切酶进行比较 ,而细胞中又可能存在多种核酸内切酶 ; 3使用 T E 缓冲液作为游离核 的孵育缓冲液 ,而 T E 中含有 ED TA . 因此他们报道的核酸内切酶是否是细胞凋亡过程中活 化的核酸内切酶是值得怀疑的. 本文改进了游离核 DNA 自消化方法 ,发现游离 HL260 细胞核中核酸内切酶的活化必须 2 + 2 + 存在一定浓度的 Ca,但其活性高低与 Ca浓度并没有线性关系. 在钙离子存在的前提下 , 2 + 游离 HL260 细胞核中核酸内切酶活性随 Mg浓度升高而增加. 看来 ,游离 HL260 细胞核中 2 + 2 + 2 + 核酸内切酶依赖于 Mg是有条件的 ,即必须存在一定浓度的 Ca. 而在无 Mg时 , 游离 2 + HL260 细胞核中核酸内切酶的活化至少需要 1 mmol/ L 的 Ca. 这一特性与以往报道的任何 2 + 2 + 核酸内切酶不同. 另外 ,高浓度 Ca和 Mg均可抑制游离 HL260 细胞核中核酸内切酶的自 2 + 2 + 6 2 + 活化 ,这可能是由于高浓度 Ca和 Mg对酶活的抑制或影响了染色质的构象. 但 Ca, 2 + 13 Mg对 DNA 自消化的双向调节机制还有待进一步研究. 2 + 我们的结果还表明 ,5 或 10 mmol/ L Mg存在时 ,游离 HL260 细胞核中核酸内切酶的活 2 + 2 + 化至少需 011 mmol/ L Ca. 虽然有报道表明胞内自由 Mg浓度可达 10 mmol/ L 左右 ,但活 2 + HL260 细胞在静息状态时胞质及核自由钙都是很低的. HL260 细胞凋亡过程中胞内总 Ca5 2 + 并没有变化,因此 , HL260 细胞凋亡过程中胞内 Ca从胞内钙库向核的移位可能是非常重 142 + 要的 . HL260 细胞凋亡过程中核钙或核某些特定区域的 Ca是否能达到 011 mmol/ L ,或 2 + 15 者胞内是否还有其他因子可进一步降低核酸内切酶对 Ca的依赖性以诱导核酸内切酶的 活化. 尚待进一步研究. 致谢 感谢加拿大国立医院生殖生物学研究所 Benjamin K. TSAN G 教授帮助和建议. 参考文献 1 Wyllie A H , Kerr J F R , Currie A R. Cell deat h : t he significance of apopto sis. Int Rev Cytol , 1980 , 68 : 251,3062 + 2 + Ribeiro J M , Carso n D A. Ca/ Mg2dependent endo nuclease f ro m human spleen : p urificatio n , p roperties , and role in 2 apopto sis. Biochemist ry , 1993 , 32 : 9 129,9 136 Peit sch M C , Polzar B , Atep han H , et al . Characterizatio n of t he endogeno us deo xyribo2nuclease involved in nuclear DNA 3 () degradatio n during apopto sis p rogrammed cell deat h. EMBO J , 1993 , 12 : 371,377 Zhivotovsky B , Wade D , Nicotera P , et al . Role of nuclease in apopto sis. Int Arch Allergy Immunol , 1994 , 105 : 333,338 4 Yo shida A , Ueda T , Takauji R , et al . 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