【DOC】肿瘤特异增殖型腺病毒穿梭质粒pAd-delE1b55kD的构建

【DOC】肿瘤特异增殖型腺病毒穿梭质粒pAd-delE1b55kD的构建 肿瘤特异增殖型腺病毒穿梭质粒 pAd-delE1b55kD的构建 一 314一重庆医科大学2O06年第31卷第3期(JoumalofChongqingMedicalUnivem~2o06?Vol?31No?3) 文章编号:0253—3626(2006)03-0314—04 肿瘤特异增殖型腺病毒穿梭质粒pAd—delElb55kD的构建 王春毅,傅仲学 (重庆医科大学附属第一医院普通外科,重庆400016) 【摘要】目的:构建一种对肿瘤细胞有特异靶向性的高效载体一肿瘤特异增殖型腺病毒的穿梭质粒pAd—delEIb55kD.方法: 利用二步法PCR等基因重组技术,将质粒pXcl编码EIB一55kD蛋白的基因区域缺失,并保留一个BglII酶切位点,以便插入 外源性基因;利用凝胶图像分析和基因测序验证所构建质粒的正确性.结果:质粒pXcl的基因序列中,编码EIB一55kD蛋白的 基因区中的2279,3326bp区域缺失,该区域上游的序列中第2024位碱基C点突变为T,第2252位碱基c点突变为T及第 2261位碱基G点突变为T,从而在该区域上游插入了终止密码子TGA,TAG和TAA.在终止密码子下游,保留了一个BstII酶 切位点.结论:成功构建了肿瘤特异增殖型腺病毒穿梭质粒载体 pAd—delEIb55kD,为肿瘤的基因治疗提供了一种对肿瘤细胞有 特异靶向性的高效载体的穿梭质粒. 【关键词】肿瘤;基因治疗;肿瘤特异增殖型腺病毒;穿梭质粒 【中国图书分类法分类号]R656.9;Q782【文献标识码】A【收稿日 期】2005—10—14 Constructionofreplication..competentadenovirus shuttleplasmidspAd..delE1b55kD WANGChunyi,etal (DepartmentofGeneralSurgery,theFirstAffiliatedHospital,ChongqingMedicalUniversity) 【AbstractlObjective:Toconstructareplication—competentadenovirusshut tleplasmidsnamedpAd—delElb55kD,whichCfllltransfect thecelloftumortargeted.Methods:deletetheEIB55regionofpXC1andretainasiteforBslIIbysuchtechniqueofgenerecombination asnestedPCR;verifythecorrectnessofpAd-delEIb55kDbygelimageanalysisandsequencingthegeneorder.Resu/ts:The2279-3326 regionofEIBinpXC1wasdeleted.The2024basicradicalCwasmutatedtoT,the2252basicradicalCtoTandthe2261basicradicalG toT.StopcodonTGA,TAGandTAAwereinserted,AsiteforBglI1wasretainedindownstreamofthestopcodon,Conclusion:The replication—competentadenovirusshuttleplasmidsnamedpad—delE1b5 5kDisconstructed,whichprovidedacarrierforthegenetherapy oftumortargeted. 【Keywords】tumor;,genetherapy;replication-competentadenovirus;shuttleplasmids 近年来,肿瘤的基因治疗在实验阶段取得了很 大的进展,但其临床应用仍然存在许多问题,其中, 缺乏能特异性转染肿瘤细胞的载体是其中一个重 要因素.在肿瘤细胞中,P53肿瘤抑制蛋白常为失活 或变异,而正常细胞的P53没有这种改变.利用这 一 点,美国ONYX药物公司研制了肿瘤特异型病毒 ONYX一015(又名d11520,CI1042),在已结束的II 期临床试验中,用ONYX一015联合常规化疗治疗头 颈部肿瘤,显示出良好的肿瘤靶向性和抗肿瘤能力 作者介绍:王春毅(1977一),男,住院医师,博士, 主要研究方向:胃肠道肿瘤的基因治疗. 基金项目:席为重庆市自然科学基金项目(编号:2005BB5225). (总有效率63%,为迄今最有效的肿瘤生物治疗的 临床之一)fl’4j.但是ONYX一015不能携带外源 性基因片断,不能用做肿瘤基因的载体.为此,我们 用两步法PCR敲除掉腺病毒穿梭质粒中编码的 E1B一55kD蛋白的序列,构建了肿瘤特异增殖性腺 病毒的穿梭质粒载体pAd—delE1b55kD. 1与方法 1.1材料 腺病毒穿梭质粒pXC1购自加拿大MicrobixBiosystems 公司.TaqDNA聚合酶及缓冲系统购自美国Promega公司. 脱氧核苷三磷酸(din’P)购自美国Gibco公司.内切酶xbaI 重庆医科大学2006年第31卷第3期(JournalofChongqingMedicalUniversity2Oo6.Vo1.31No.3)一315一 和BII以及100bpDNALadderMarker,T4DNA连接酶均 购自宝生物工程(大连)有限公司.LambdaDNA/EcoR I+HindIIIMarker购自上海生工.DNA胶回收试剂盒购自 Omega公司.感受态细菌DH50【由本保有. 设计引物两对,均由上海生工合成: 1)上游P1:5一ACGCCCGACATCACCTGTGTCTAG A— GAATGCAATAG-3 下游P2:5一CGCTCAGATGGGTrTCrI’I’CACTCC A1rrTATCCTTYA一3 2)上游P3:5-TAAAGGATAAATGGAGTGAAG AAACCCATCTGAGCG一3 下游P4:5一GA!ATACACTTAAGCCACC TATACAACA1rrC一3 (下划线处为酶切位点,加粗碱基为引入的突变碱基) 1.2方法 (1)第一次PCR及阳性条带回收:以P1及P2为引物, pXC1为进行PCR扩增.反应条件:94?3min--~94% 30s__+55?30s__+72?60s,30Cycles---~72oC5min.将反应产 物进行1%琼脂糖凝胶电泳,凝胶图像分析仪上观察结果,以 出现约725bp条带为阳性条带,回收阳性条带,命名为 PCR1.通过第一次PCR,将pXC1基因序列中第2024位碱基 c点突变为T,从而引入了终止密码子TGA. (2)第二次PCR及阳性条带回收:以P3及P4为引物, pXC1为模板进行PCR扩增,反应条件同第一次PCR.将反 应产物进行1%琼脂糖凝胶电泳,凝胶图像分析仪上观察结 果,以出现约270bp条带为阳性条带,回收阳性条带,命名为 PCR2.通过第一次PCR,将pXC1基因序列中第2252位碱基 c点突变为T,第2261位碱基G点突变为T,从而在该区域 插入了终止密码子TAG和TAA,并引入了BglII的酶切位 点. (3)第三次PCR及阳性条带回收:将上述两次PCR产物 混合,作为第三次PCR模板,引物采用P1和P4.PCR反应 体系和反应条件同上.反应产物为959bp.割胶回收,回收的 产物命名为PCR3.通过第三次PCR,得到了pXC1基因序列 中的1319—2268区域序列,其上游有一个XbaI酶切位点, 下游有一个BglII酶切位点,便于下一步的酶切和连接.在编 码E1B一55kD蛋白的基因序列起始位置引入了三个终止密 码子,使E1B一55kD蛋白不能有效翻译,并使插入的外源性 基因的表达不受其上游序列的影响. (4)将PCR3用XbaI+BglII酶切(共用Tbuffer+BSA), 直接过柱回收,命名为PCR3/XbaI+BglII;将对质粒pxc1 进行XbaI+BglII酶切,1%琼脂糖凝胶电泳,凝胶图像分析仪 上观察,出现约1989+7916bp左右的条带为正确.割胶回收 7916bp的片段,回收的产物命名为pxC1/XbaI+BglII. (5)连接,提取及鉴定质粒:将PCR3/XbaI+BI与 pXC1/XbaI+BglII进行连接,16%放置过夜.取其中10l, 转化感受态细菌DH5Ot,铺板(氨苄抗性)培养过夜.将培养 板上长出的菌落挑取4个克隆,入5mlLB振荡培养过夜 (10h),扩增质粒,手工提取质粒,编号E1-4.将提取的E1-4 号质粒用XbaI+BglII双酶切,1%琼脂糖凝胶电泳,凝胶图像 分析仪上观察,出现约933+7916bp左右的条带为正确.以 P3为引物测序500bp,以证实编码E1B一55kD蛋白的基因区 中的22793326bp区域缺失,并在编码E1B一55kD蛋白的 基因序列起始位置引入了三个终止密码子,构建成oAa— delE1b55kD(技术路线如图1). 第一次PCR, 引入终止密码 子rGA 第二次PCR, 引入终止密码 子TGA和 TAA以及BgI ?酶切位点 2结果 第三次PCR,得到了 pXC1基因序列中的 1319—2268区域序 列,其上下游有Xba I及B11酶切位 点,含三个终止子 pXC1 J,连接 pAd-delE1B55kD 图1技术路线图 酶切 2.1第一次PCR及阳性条带回收 凝胶图像分析仪上观察结果,出现约725bp阳 性条带(图2). 1.阴性对照 2.100bpDNAladderMarker 3-4.pXC1PCR1/PI+P2 图2第一次PCR后的阳性条带 2.2第二次PCR及阳性条带回收 凝胶图像分析仪上观察结果,出现约270bp阳 性条带(图3). 2.3第三次PCR及阳性条带回收 凝胶图像分析仪上观察结果,出现约959bp阳 性条带(图4). 2.4将对质粒pXC1进行xbaI+Bg卫II酶切,1%琼 脂糖凝胶电泳,凝胶图像分析仪上观察,出现约 316一重庆医科大学2fHI6年第3t卷第j期 (JournalofChongqingMediCalUniversity2qltt~Vol31N.3 —11m)l1_l?,,1…lIl.”kl?1 2-3I,Xn::In1121’3+1 4… 图3第二次?后的阳性条带 l2I.1{ 3II刈 4l【1(‘I), .{|lr1.1?.Irk-I 图4第三次J{后的阳性条带 1I-,I1,1l+1{11 2J},,,l?:II?I+H…{IIII?fkl_I 图5J{用XI『f尘病南:复制垫?然而.在般大彩数情况F.正隋.纲 胞感染1]I吼摩厉许没行,髓凋,崾强是 牛J腮桶『仃着能抑制1’53激衍的篮lI,即 ?R55M)蛋n,此野牛隙病毒能在1E常胞内 增吼’雌辆缺夫Il}55k1)l.f.正崩?胞巾 的1’53即澈.幢fill胞很?捅r,隙病:能再 增殖.从ir;if,E15染终i1:而50以f的嘘胞_1], P53Lt突娈成火II.旆雌感染后,t’53能做赦活. 1此缺乏川I;55k1)篮I.…伽病毒f.tj能复哎增 值,健墒-订川,嫱1胞内大f}艇制.最终导致肿瘤 fill胞溶噼r_.蚌释放新的痫嵩感其它肿瘤鲫 咆 ]=lit,置fq(IYx曲物公?:I,Ifj-JIIf『瘤特异 牖病?,x一015.这是一f-tj_匝过点突变千u缺 戈突变导致】1B55k1)置l}的2与5刨随合的腺 } ?B _三 \ 粒 0质 号 【} ? 一, 图 重庆医科大学2006年第31卷第3期 (JournalofChongqingMedicalUniversity2006.Vo1.31No.3l一317一 病毒.其联合常规化疗治疗30例难治性头颈部肿 瘤病人,19例病人肿瘤缩小一半以上,其中8例完 全缓解.然而,单独使用ONYX一015,对肿瘤的疗 效仍较差[51,且不能在该病毒的基因序列中插人外 源治疗基因. 如在肿瘤治疗方面以这种缺乏E1B55kD蛋白 的肿瘤增殖型腺病毒为载体,则可具有以下优点:1. 使外源性目的基因选择性地在肿瘤细胞内高效复 制,可使治疗剂量大大减少;2.病毒在肿瘤细胞内复 制,最终溶解肿瘤细胞;3.由于病毒只选择性地在肿 瘤细胞中复制,减少了对正常细胞的细胞毒反应和 对宿主的免疫反应.因此,可使外源基因特异性转 染进人肿瘤细胞,可结合病毒治疗和基因治疗两者 的优势,增强抗肿瘤效果. 在本研究中,我们通过基因重组将编码E1B一 55kD蛋白的基因区中的2279—3326bp区域缺失, 并通过二步法PCR将pXC1基因序列中第2024位 碱基C点突变为T,第2252位碱基C点突变为T 及第2261位碱基G点突变为T,从而在该区域插 人了终止密码子TGA,TAG和TAA,使E1B一55kD 蛋白不能有效翻译,并使插人的外源性基因的表达 不受其上游序列的影I]l~[61.在终止密码子下游,保留 了一个SglII酶切位点,以便插人外源性基因.这 样,我们构建了肿瘤特异增殖型腺病毒穿梭质粒载 体pAd—delE1b55kD,通过与骨架质粒共转染293 细胞包装成毒,能携带外源性治疗基因特异性感染 肿瘤细胞(大多数肿瘤细胞的P53基因突变或缺 失),并使外源性基因在肿瘤细胞中高效表达,为肿 瘤的基因治疗提供了一种对肿瘤细胞有特异靶向 性的高效载体. (通讯作者傅仲学Tel:(023)89012302 E—MAIL:fzx990521@sina.corn) 参考文献 【1】BischofJR,KirnDH,WilliamsA,eta1.Anadenovirusmu- tantthatreplicatesselectivelyinp53-defieienthumantumorcells [J].Science,1996;274:373—376. 【2】HeiseCC,WilliamsAM,XueS,eta1.Intravenousadminis- trationofONYX一015,aselectivelyreplicatingadenovirus,in- ducesantitumoralefficacy[J].CancerRes,1999;59(11):2623-2628. 【3】GoodrumFD,OrnellesDA.TheearlyregionIB55-kilodal- tononcoproteinofadenovirusrelievesgrowthrestrictionsimposed onviralreplicationbythecellcycle[J].JVirol,1997;71:548—561. [4]FhuriFR,NemunaitisJ,GanlyLeta1.Acontrolledtrialofintra— tumralONYX一015,aselectively—replicatingadenovirus,ineombi- nationwithcisplatinand5-fluorouraeilinpatientswithrecurrent headandneckcancer[J].NatureMedicine,2000;6:879—885. 【5】NemunaitisJ,GanlyI,KhuriF,eta1.SelectiveReplication andOncolysisinp53MutantTumorswithONYX—O15.anE1B一 55kDGene—deletedAdenovirus.inPatientswithAdvaneedHcad andNeckCancer:APhaseIITrial[J].CancerRes,2000;60:6359— 6366. 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