病毒TCID50滴度
PFU:plaque forming unit,空斑形成单位。感染性滴度的单位一般表示为PFU/ml。由于测定pfu往往重复性较差,因此近些年许多研究又开始采用TCID50方法来计算病毒的感染单位。因此建议也可使用TCID50法。
MOI :multiplicity of infection,感染复数。传统的MOI概念起源于噬菌体感染细菌的研究。其含义是感染时噬菌体与细菌的数量比值,也就是平均每个细菌感染噬菌体的数量。噬菌体的数量单位为pfu。一般认为MOI是一个比值,没有单位,其实其隐含的单位是pfu number/cell。后来MOI被普遍用于病毒感染细胞的研究中,含义是感染时病毒与细胞数量的比值。
然而,由于病毒的数量单位有不同的表示方式,从而使MOI产生了不同的含义。能产生细胞裂解效应的病毒例如单纯疱疹病毒等习惯上仍用pfu表示病毒数量,因此其MOI的含义与传统的概念相同。
传统意义上的MOI的测定,其原理是基于病毒感染细胞是一种随机事件,遵循Poisson分布规律,可计算出感染一定比例的培养细胞所需的感染复数(MOI)。其公式为:
P = 1- P(0) ,P(0) = e-m 或m = -InP(0)。
其中:
P 为被感染细胞的百分率
P(0)为未被感染细胞的百分率
m为MOI值
例如,如果要感染培养皿中99%的培养细胞,则:
m = -In(0.01)= 4.6 pfu/cell。 P(0) = 1% = 0.01
TCID50 Protocol:
1:制备96孔板单层细胞
2:将病毒做系列稀释,横向接种单层细胞板,每稀释度重复3孔 3:每日观察细胞病变,记录高于50和低于50,病变孔的病毒稀释度, 4:计算比距,获得TCID50
计算比距:
(高于50,的病变率,50,)/(高于50,病变率,小于50,病变率),比距; 比距与接近50%病变率的病毒的稀释度的指数相加,就获得了指数。 比如:比色计算或者显微镜观察病毒的TCID50在10的负7和8次方之间,那么,指数,8与比距相加,获得的新的指数,就是TCID50的指数,TCID50=10的-7.几次方
TCID50与 PFU换算:
PFUs,0.7×TCID50的滴度
病毒TCID滴度的计算: 50
组织培养半数感染量是病毒感染一半组织细胞时的病毒的稀释度,一般使用Reed-Muench方法计算,详细过程见表
稀释度 阳性数目阴性数目 阳性数 阴性数 比率 阳性数百
(1) (2) (3) (4) (5) 分比(6) 10,4 4 0 11 0 11/11 100 10,4.5 4 0 7 0 7/7 100 10,5 3 1 3 1 3/4 75 10,5.5 0 4 0 5 0/5 0
1(计算各病毒稀释度阳性孔数目(1)和阴性孔数目(2)
2(计算阳性和阴性孔的累积数
阳性孔累计数由下向上累积(3);阴性孔累积由上向下累积(4)
3(计算阳性孔的百分比:比率(5)=(3)/[(3)+(4)];
(6)=(5)×100
4(计算距离比
距离比例=(大于50%的阳性百分比-50)/(大于50%的阳性比-小于50%的阳性
百分比)=(75-50)/(75-0)=0.3
TCID的对数=大于50%的阳性百分比的最高稀释对数+距离比例x稀释系数的50
对数
=5+0.3×0.5=5.15
-5.15TCID=10/100微升 50
-3.15100TCID/100微升=10 50
-3.15-3.15+0.3-3.15100TCID/50微升=10/2=10=10=1:1631 50
5(稀释系数的对数
1:10稀释为1;半对数稀释为0.5;倍比稀释为0.3;1:5稀释为0.7