生物膜结构对白色念珠菌的耐药性的影响

生物膜结构对白色念珠菌的耐药性的影响 医学综述2oo7年6月第13卷第12期MedicalRecaoitulate.Jun2oo7,Vo1.13,No.12 『61PadubidriA,BrowneEJ.E{_fectofvascularendothelialgrowthfact (VEGF)onsurvivalofrandomextensionofaxialpatterskinflaps intherat【JI.AnnPlastSurg,1996,37(6):604—6n. 『7】李强,何清义.VEGF促进骨组织工程血管化的研究进J~[J1.第 三军医大学.2oo5,27(161:1704—1706. f81张从纪,周树夏,李慧增,等.颌面部爆炸伤愈合过程中血管相 关生长因子变化及作用的实验研究[J].中华创伤杂志, 2001,16(1):35—37. f91于大海,王代友.血管内皮生长因子基因转染恢复放疗后组织 血管生成的实验研究[J].中华口腔医学杂志,2004,39(6):515. 【10】易成刚,郭树忠,张琳西,等.血管内皮祖细胞移植提高裸鼠缺 血皮瓣存活率[J].中华整形外科杂志,2005,21(6):429. 『111郑振华,徐良,范西红,等.应用转血管内皮生长因子基因治疗 肢体缺血的研究Ul中国修复重建外科杂志,2004,18(2):142-145. 『121BaumgartnerI,PieezekA,MalTlOr0,et.Constitutiveexpres— sionofphVEGFIeafterintramuscularcenetransferpromotes collateralvesseldevelopmentinpatients【hCriticalLimbIs. chemialJ].Circulation,1998,97(21:1114—1123. 『131薛斌,贺光照,黄崇本.VEGF和bFGF联合应用促进缺血皮瓣 存活的研究[J].重庆医学,2003,32(51:565. ?41WeiP,LiF.Theeffectofvaseularendothelialcellgrowthfactor onsurvivalofskinflapinrats[J].ZhongguoXiuFuChongJiag WaiKeZaZhi,1997,l1(61:376—378. 『151LantieriLA,Martin—GarciaN,WechslerJ,eto1.Vascularendothe— lialgrowthfactorexpressioninexpandedtissue:apossiblemech— anismofangiogenesisintissueexpansionIJ1.P1astReconstra Surg,1998,101(2):392—398. 收稿日期:2006—12—10修回日期:2oo7.o4—14 生物膜结构对白色念珠菌的耐药性的影响 赵亮(综述),陈贻锴(审校) (福建医科大学医药生物工程中心,福州350004) 中图分类号:R379.4文献标识码:A文章编号:1006—2084[2007)12—0889—03 摘要:白色念珠菌生物膜是一种可黏附并生长于植入性生物医学材料具有高度耐 药 特性的膜样生物集落,可造成植入失败和持续的感染源,对患者产生不良的影响. 这种 耐药的机制十分复杂,迄今尚未完全查明,本文就其结构形态与耐药机制有关的研 究近 况作一综述. 关键词:白色念珠菌:生物膜;耐药 InnuenceofEfiectionofBiofnmArchitectureonResistanceofCandidaAlbicans zHA0Liang,CHENYi—kai.《BiomedicalEngineeringCentre,FujianMedicalUniversity, Fuzhou35o0o4.China1 Abstract:Candidaalbicansbiofilmsaremembrance—likestructuredcommunities.which canattachetoaswellasgrowonthesurfacesofindwellingbiomaterialswithhighlevels ofdrugresistance.TheyCaBnegativelyimpactthehostbycausingthefailureoftheimplan— tationaswellasservingasasourceofcontinuinginfection.TheresistancemechnasimiS verycomplicatedandhavenotbeencompletelyclarifieduptonow.Thisarticlereviewsthe recentstudyofstructuremorphologyandresistancemechnasimofcandidaalbicansbiofilm. Ke-vwords:Candidaalbicans;Biofilm;Resistance 近年来,随着植入性生物医学材料的应用推广,如静脉留 置管,输尿管,人造心瓣膜等,相关的念珠菌生物膜感染引起 了人们的关注.生物膜的生长形式与其在液体培养基中单个 细胞悬浮生长的形式完全不同.白色念珠菌生物膜是白色念 珠菌黏附于其他固体的支持物(多见于上述的生物医学材料) 表面呈膜样生长的一种微生物集落,外表面被其自身分泌的 一 层富含多糖的细胞外基质所覆盖.生物膜状态生长的白色 念珠菌具有高度耐药的特性.其最小抑菌浓度(minimalin. hibitoryconcentration,MIC)值要比在液体基质悬浮生长的同 类细胞高出千倍甚至数千倍,使得临床上白色念珠菌生物膜 感染单靠药物治疗效果很差,也是这种感染具有很高的致死 率的主要原因.目前,已对白色念珠菌生物膜的耐药性进行 许多研究,本文对其耐药性的研究近况作一综述. 1白色念珠菌的生物膜形态学以及生长动力学的特点 目前,习惯把白色念珠菌生物膜的形成过程分为早期(0 1lh),中期(12—30h)和成熟期(31—72h).在用96孔微量培养 板制成的体外念珠菌生物膜模型中,用倒置显微镜可以观察 到培养2h,在培养孔的底面形成由酵母细胞组成的微菌落; 2—4h,可见酵母细胞出芽并开始形成菌丝;8h,微菌落互相融 合,形成酵母细胞及菌丝密集排列的网状结构;24—48h,酵母 细胞沿着菌丝形成团块样聚集,形成多层的膜状结构【l1.Kuhn 等四将激光共聚焦扫描显微镜与荧光染色方法相结合,观察 到成熟的白色念珠菌生物膜在附着于生物材料的基底层是 l一2个细胞厚度的具有代谢活性的芽孢层.位于其上的是厚 度为450—5501~m相互交织的大量具有代谢活 性的菌丝形态的细胞以及生物膜外表面的多 糖基质层,各层间有大小不等的间隙及孔道相 贯通.生物膜这种多相细胞间相互交织的三维 空间网状结构为细胞提供了一个便于营养物 质流入和代谢产物排出以及细胞间信号交流的 生存小环境. 生物膜中白色念珠菌的生长速率远比悬 浮状态生长的白色念珠菌低,但是生物膜中白 色念珠菌的活性随培养时间延长而增加.当生 长趋于成熟时,代谢的活性相对稳定,但仍保 持在一个高水平,这表明即使是在成熟的生物膜中,细胞的数 量也有增加,处于一个动态平衡中1'21. 2白色念珠菌生物膜的耐药机制' 白色念珠菌生物膜对现在临床常用的抗真菌药物高度耐 药.目前,对其耐药机制的研究主要集中在以下4方面:?细 胞外多糖基质阻碍药物渗入;?细胞的低生长率;?细胞膜的 脂质成分改变;?耐药相关基因的表达.现有的研究资料表 明,这4个因素都能够影响生物膜的耐药性,但仅凭其中的一 个因素又不足以引起如此高水平的耐药,目前认为生物膜的 耐药是多因素共同作用的结果,还有尚未明确的因素. 2.1白色念珠菌生物膜的多糖基质对耐药性的影响细胞外 多糖基质也可以在白色念珠菌生物膜的外表面形成具有高度 迂曲孔道的水凝胶样的结构,可抑制或延迟某些分子直径较 大的物质的渗入131.可是,在进一步的试验中.Ramage等将完 整的白色念珠菌生物膜的细胞重悬,破坏其空间结构.来测定 重悬细胞(失去了绝大部分的细胞外基质)对氟康唑的耐药 性,将结果与同一菌株来源的结构完整的生物膜的耐药结果 比较,却发现二者都对氟康唑高度耐药(MIC>1024p~g/L).而 将这些白色念珠菌再种回固体培养基待其生长后测试悬浮生 长状态的细胞的耐药性,发现它们又恢复了对氟康唑的敏感 性.Mohammed等[51还利用在振荡的生长条件下,白色念珠菌 生物膜细胞外多糖基质的产量要明显高于静置的生长条件这 一 特点,对这2种条件下生长成熟的生物膜作了药敏试验,对 比结果发现振荡状态下生成的生物膜的耐药性要明显高得 ? 890?医学综述2007年6月第13卷第12期 MedicalRecapitulate,Jun2007,Vo1.13,No.12 多.用滤纸片测定法测试念珠菌生物膜对氟康唑的渗透效果. 发现药物完全能够渗人生物膜的全层.并且渗入的药物浓度 即使在很大程度上超过MIC,也不能完全杀死生物膜的白色 念珠菌细胞[61.这些说明,白色念珠菌生物膜的细胞外多糖基 质对药物的渗透阻碍作用与药物的种类有关,对两性霉素B 的耐药有一定的作用.而在对氟康唑的耐药上作用不大,而去 除了细胞外的多糖基质也不能大幅降低白色念珠菌生物膜对 两性霉素B的耐药程度.也说明一定还有其他的因素引起生 物膜的高度耐药. 2.2生物膜细胞的低生长率对耐药性的影响由于大多数 的抗菌素对快速生长期的细菌更具杀伤力,杀伤效果可以说 与生长速度成正比.细菌生物膜上的细菌生长速率是很低的, 所以它们摄人药物的速度和量也低.药物作用效果也不佳.同 样,生长速率较低的白色念珠菌生物膜的耐药性也可能由这 一 原因引起. Baillie等171用醋酸纤维素膜灌流系统.通过调节培养基的 灌流速度来控制白色念珠菌生物膜的生长速率.在测定了不 同生长速率条件下的完整的生物膜,重悬后悬浮的生物膜细 胞,以及一开始就悬浮生长的白色念珠菌对两性霉素B的耐 药情况后,发现前二者在不同的生长速率下都有很强的耐药 性.而游离的白色念珠菌只在很低的生长速率下具有同前二 者相同的耐药性.Chandra等嗍用共焦激光扫描电子显微镜结 合荧光染料方法检测到,白色念珠菌生物膜耐药性伴随着生 物膜的发育成熟过程中代谢活性增加.呈进行性增加.最终高 度耐药.考虑到悬浮生长的白色念珠菌在整体的生长速率上 远大于生物膜.而低生长率的悬浮的白色念珠菌有很高的耐 药性,说明低生长速率的确对生物膜的耐药有影响.但是不同 生长速率的生物膜都有很强的耐药性,而随代谢活性的增加, 耐药程度也进行性地增加到最高值.也提示白色念珠菌生物 膜的耐药性一定还有其他因素的作用. 2.3白色念珠菌生物膜细胞质膜的脂质成分对耐药性的影 响Kohli等[91发现,悬浮生长的白色念珠菌随着耐药程度的 提高,细胞膜的麦角固醇含量有所降低.质膜的流动性也随之 递减.Mukheqee等【分析了白色念珠菌生物膜早,中,晚期的 细胞膜固醇成分,与悬浮状态比较后发现.早中期二者的麦角 固醇的水平相似,晚期前者麦角固醇的水平要比后者低的多. 就生物膜而言,后二期麦角固醇含量比早期分别下降了41% 和50%.由于中期和晚期恰是耐药性大幅升高的时期,故细 胞膜麦角固醇改变很可能会影响耐药程度.Khot等【l11发现.生 物膜底部芽孢层的细胞的耐药性要比上层的菌丝相和酵母相 的细胞高出10倍以上,在对生物膜芽孢层细胞的麦角固醇合 成相关酶的基因进行逆转录,聚合酶链反应的定量分析时也 发现,它们与高耐药性存在相关.这种变化是否影响到细胞膜 对药物的渗透性及与药物的结合能力,是否会介导一些未知 的与耐药有关的基因的表达,还有待研究. 2.4白色念珠菌生物膜特异的耐药基因的表达人们起初 把注意力集中在ATP结合转运蛋白家族和易化扩散载体超 家族上.它们是镶嵌在细胞膜上的蛋白.允许细胞摄人必需的 营养物质,分泌代谢产物和排出有害物(包括抗真菌药物),便 于和环境之间进行物质交换.减少药物在细胞内的累积.使细 胞呈现耐药性.ATP结合转运蛋白家族中的念珠菌耐药基因 1(Candidadrugresistance1,CDR1),CDR2与易化扩散载体超 家族中的多药耐药基因1(multidrugresistance1,MDR1)已被 证明与悬浮状态生长的白色念珠菌耐药性密切相关.Andes 等【21对比了在白色念珠菌生物膜生长24h的细胞与同一时点 浮游生长状态细胞中的CDR1,CDR2与MDR1的基因表达, 发现CDR1与CDR2在生物膜细胞中的表达有增加.而 MDR1只有短暂的上调.Mukherjee等【lq进一步对比了同系来 源氟康唑敏感株在悬浮生长状态,生物膜生长状态,以及它的 不同的CDR1,CDR2和MDR1剔除突变株在生物膜形成的早 期(6h),中期(12h)与成熟期(48h)三个阶段的药敏结果,发现 在早期野生株生物膜的MIC>256mg/L.CDR1与CDR2单一 基因剔除的突变株的MIC为256mg/L,CDR1,CDR2双基因 剔除的突变株的MIC为64mg/L,而CDR1,CDR2,MDR1三个 基因都剔除的突变株的MIC只剩16mg/L,到中期和成熟期 时.所有的突变株和野生株均对氟康唑高度耐药(MIC> 1024mg/L);同时对比了生物膜在3个时期中这3个基因的 mRNA的表达水平及表达产物的功能活性,结果证实在中期 和成熟期它们均有表达和外排药物的活性.且均强于早期.这 与耐药水平的变化不一致,提示这3个基因很可能只在早期 的生物膜的耐药中起作用. 3白色念珠菌生物膜感染的新药和新材料的研发 生物膜中白色念珠菌高度耐药的特性使生物膜感染的治 疗相当棘手,必须移除生物膜定植的植人物.药物治疗才有 效.但大部分的情况下,植人物的移除更换,患者必须承担很 大的经济负担,甚至有极大的生命危险,很不现实.因此很多 学者开始探寻治疗的新途径. 在药物方面,现已开发出了脂质体形式的两性霉素B,它 在磷脂中的分散能力可能使它更容易穿越带电荷的细胞外多 糖基质.在动物白念珠菌生物膜感染模型中.对比了非治疗 组,氟康唑和两性霉素B脂质体治疗组的生物膜.发现氟康 唑治疗无效.两性霉素B的脂质体能够明显抑制体内导管上 的生物膜的形成【l31.Burrows等【41开发的非兼性阳离子抗微生 物肽,在体外实验中.微摩尔的剂量就能杀灭对氟康唑敏感和 耐药的白色念珠菌.以及菌株在塑料制品表面形成的生物膜. 并具有对体外培养的哺乳动物细胞低毒性的优点.早期. Ramage等【51发现白色念珠菌的细胞间的一个信号分子法呢 醇,当其积累到一定量时能阻止白色念珠菌从酵母相向菌丝 相的转换,抑制生物膜形成.近来,用基因芯片技术对法呢醇 处理的白色念珠菌的基因表达的变化分析,则发现它能够从 基因水平上抑制菌丝的形成.甚至还能够使CDR1和CDR2 的负调控因子氟康唑耐药基因1的表达上调.说明法呢醇能 ,Mukherjee等M发现 够从多个方面抑制生物膜的形成【161.另外 10%的乙醇可以明显抑制生物膜的形成.20%的乙醇则可以 完全抑制生物膜的形成. 在生物医学材料的改良方面.对常用的植人性医学生物 物材料进行研究,发现白色念珠菌在表面用6%的聚氧化乙 烯修饰的聚醚氨基甲酸乙酯上,比同类未修饰的材料以及其 他种类的材料更难形成生物膜【】81.Hazan等【91还发现.用低能 的表面声波能够很好地阻止4种不同的细菌和念珠菌属的菌 株在植人性医学生物材料上附着和形成生物膜.并且在活体 动物实验上也取得了很好的效果.提示从常用的医学生物材料 的改良和特殊处理上也有防治白色念珠菌生物膜感染的前景. 总之,白色念珠菌生物膜的高度耐药的特点使临床相关 医学综述2007年6月第l3卷第l2期MedicalRecapitulate,Jun2007,y!.3. 感染的治疗困难重重.其耐药的机制尚未完全弄清楚,这方面 的研究还有待深入.而在治疗白色念珠菌生物膜感染的新药和 新材料的研发上.还需要通过更多的体内外和临床试验来证实. 参考文献: 【1]孙秋宁,方凯.念珠菌生物膜的结构,影响因素及其对抗真菌 药的敏感性『J].中国医学科学院,2002,24?:385—388. 『21KuhnDM,ChandraJ,MukherjeePK,eta1.Comparisonof biofilmsformedbyCandidaalbicansandCandidaparapsilosison bioprostheticsurfaces[J].InfectImmun,2002,70(2):878—888. 『31ThurnheerT,GmtirR,ShapiroS,et.Masstransportofmacro— moleculeswithinaninvitromodelofsupragingivalplaque[J]. 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(鹤壁职业技术学院,河南鹤壁458030) 文献标识码:A文章编号:1006—2084(2007)12—0891—03 摘要:小肽(二肽和三肽)可以被肠道完整地吸收.小肽在肠道的吸收载体是肽载体 I型,与游 离氨基酸相比,小肽具有转运速度快,耗能低,不易饱和等独特的吸收特点,使其成 为目前研究的一 个热点.开发小肽,研制新药,关键是分离小肽.目前分离小肽的方法主要有毛细管 电泳,高效液相 色谱法,柱层析法,毛细管电泳一电喷雾一质谱联用,纸电泳法等. 关键词:小肽;分离方法;吸收机制;载体;影响因素 TheResearehProgressofSmalIPeptideSeparationMethodandItsIntestinaITractAbsorptio n zHURen—shu,JINa-lu,L1Bing-xian.(HebiVocationandTec矗nC0Zfe,b458030,Chin0) Abstract:Smallpeptide(SP)(dipeptideortripeptide)canbeabsorbedbytheintestinaltract,of whichtheabsorptioncarrierispepT1.Comparedwithaminoacid.thesinallpeptidehavespeci ficab. sorptioncharacteristicsofrapidconveyingspeed,lowenergyconsuminganduneasysaturati on, whichmakesitbecomeahotspotinstudyingatpresentThekeyindevelopingsmallpeptidean dex— ploringnewdrugistoisolatesmallpeptide.Uptonow,themainmethodsinisolatingSPare:Ca pillary Electrophoresismethod(CE),HighPerformanceLiquidChromatograph(HPLC)method,C olumnChromatog raphy(CC),CE—ESI—MScombination,FilterPaperElectrophoresisMethodandsoon. Keywords:Smallpeptide;Separationmethods;Absorptionmechanism;Carrier;Influencin gfactors 何从大量的肽"海洋"中检测到有生 物活性的肽成分.进而分离出这些 肽成分并大量制备它们.将其研制 成新药或其他肽制品以造福人类. 是筛选活性肽的核心问题.分离小 肽的方法不像分离蛋白质,DNA等 生物大分子的方法那么成熟,稳定. 本文旨在就目前对二肽,三肽等寡 肽的分离检测方法及其在肠道的吸 收进行综述. 1小肽分离方法 传统的消化模式认为,蛋白质必须在胃肠道水解成氨基1.1毛细管电泳孑L宇等l 引采用高效毛细管区带电泳法对糖 酸,才能被吸收进入血液,转运到机体的各个组织参与代谢. 发挥其营养作用.自从1953年科学家首先观察到肠道能完 整地吸收转运双甘肽以来,对小肽的研究又有了一系列的新 进展:1960年证明了小肽可以被完整吸收:1984年在小肠黏 膜上发现了小肽载体;1994年克隆了小肽的I型载体:1996 年克隆了小肽的?型载体?.至此.小肽能被肠道完整吸收 的观点被人们完全接受.与游离氨基酸相比,小肽吸收具有 转运速度快,耗能低,不易饱和等特点ll1. 小肽独特的吸收特点,使其成为目前研究的热点.但是如 尿病肾病变患者血液内红细胞中参与氧化应激的氧化型谷 胱甘肽和还原型谷胱甘肽进行了测定.对影响分离的条件等 进行了优化.可在3min内同时对红细胞中的氧化型谷胱甘 肽和还原型谷胱甘肽定量分析.方法具有良好的重现性,较 高的灵敏度和较宽的线性范围,完全可用于临床上对患者体 内氧化应激状况的检测. 明永飞等I4]采用新合成的荧光试剂咔唑.9.乙基氯甲酸酯 作为柱前衍生剂.在胶束电动色谱的模式下考察并优化了小 肽类衍生物分离的关键条件.实现了甘氨酸2,甘氨酸3,甘