牛双芽巴贝斯虫rap1基因的克隆与序列分析

牛双芽巴贝斯虫rap1基因的克隆与序列分析 牛双芽巴贝斯虫rap-1基因的克隆与序列分析 摘要:对牛双芽巴贝斯虫(,,,,,,, ,,,,,,,,)潜在药物靶标r,,,,的基因进行克隆与序列分析。以兰州株牛双芽巴贝斯虫基因组为模板，经,;,扩增获得了,,,,,基因，将该基因克隆到,,,,,, ,,,, ,,;,,,上，对重组质粒进行,;,扩增，对目的基因进行酶切鉴定及序列测定分析。结果表明，,,,,,基因长度为,,, ,,，同源性分析结果显示，克隆序列与,,,,,,,收录的巴西株牛双芽巴贝斯虫的核苷酸序列同源性为,,(,,,，说明兰州株牛双芽巴贝斯虫的,,,,,与,,,,,,,公布的参考基因具有高度同源性，,,,,,基因具有很高的保守性。 关键词:牛双芽巴贝斯虫(,,,,,,, ,,,,,,,,);,,,,,基因;克隆;序列分析 ;,,,,,, ,,, ,,？,,,;, ,,,,,,,, ,, ,,,,, ,,,, ,, ,,,,,,, ,,,,,,,, ,,, ,,,,，,，,,,,, ,,,,,,，,,,, ,,,,,,,,，,, ,,,,, (,(;,,,,,, ,, ,,,,,,,,,, ,,,,;,,,， ,,,,, ,,,,;,,,,,,, ,,,,,,,,,,， ,,,,,,, ,,,,,,， ;,,,,; ,( , ,,,,,, ,,,,,,,,, ,, ,,,,,, ,;,,,;, , ,,,,,,,,,, ,,,,,,;,,,,;,， ;,,,,,, ,;,,,,, ,, ,,,,;,,,,,,, ,;,,,;,,,,,, ,,,,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,, ,,,, ,,,,,,,,,,， ,,,,,,,, ,, ,,,,;,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,, ,, ,,, ,,,,,, ,,,, ,,,,,;, ,, ,,,,, ,,,,,,;,， ,,,,,,, ,,,,,,， ;,,,,) ,,,,,,;,: ,,, ,,,,, ,,,,， , ,,,,,,,,, ,,,,,, ,,, ,,,, ,;,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,, ,,,,, ,,,,,,; ,,, ,, ,,,,,,, ,,,,,,,,,, ,, ,,,,,,,,， ,,, ;,,,,, ,,,, ,,,,,, ,,,, ,,;,,,( ,,, ,,;,,,,,,, ,,,,,,, ,,, ,,,,,, ,, ,;,， ,,,,,, ,,,,,,,,, ,,, ,,,, ,,？,,,;,,,( ,,,,,,, ,,,,,, ,,,, ,,, ,,,,,, ,, ,. ,,,,,,,, ,,,,, ,,,, ,,, ,,, ,,( ,,, ,,,,,,,,; ,,,,,,,, ,,,,,,,, ,,,, ,,, ,,,,,,,, ,,,,,,, ;,,,,, ,,？,,,;, ,,, ,,,,,,,;, ,,？,,,;, ,, ,,,,,,, ,,, ,, ,,,, ,, ,,(,,,， ,,,,;,,,,, ,,,, ,,,,, ,,,, ,,, ,,,,,, ;,,,,,,,,,,,( ,,, ,,,,,: ,,,,,,, ,,,,,,,,; ,,,,,; ;,,,,; ,,？,,,;, ,,,,,sis 牛双芽巴贝斯虫(,,,,,,, ,,,,,,,,)在分类学上属梨形虫目巴贝斯虫科巴贝斯虫属，该类寄生虫寄生于牛的红细胞，引起牛的血液原虫病——牛双芽巴贝斯虫病,,,。牛双芽巴贝斯虫病又称红尿热，一年内可暴发数次，临床主要表现为红细胞数量明显减少、贫血、黄疸、可视黏膜出血和血红蛋白尿等，可引起宿主死亡,,,，该病是世界公认的危害养牛业的主要寄生虫病之一。牛双芽巴贝斯虫入侵红细胞的过程是感染发病的重要环节，对红细胞的入侵是由位于牛双芽巴贝斯虫细胞膜表面的顶体复合器以及棒状体上的相关蛋白质介导的,,,，位于棒状体的蛋白质家族被称为r,,,,(,,,,,,,,,,,,;,,,,, ,,,,,,,,,),,,,,，研究该类蛋白质的生物学特性及其功能对以r,,,,为靶标的药物筛选和牛双芽巴贝斯虫病的防治具有重要意义。目前国内基本没有针对r,,,,的相关研究和报道。 试验对兰州株牛双芽巴贝斯虫株的,,,,,基因进行,;,扩 增与序列测定，旨在分析比较该基因在不同虫株中的差异，为该基因的表达和生物学功能的进一步研究奠定基础。 , 材料与方法 ,(, 材料 ,(,(, 质粒与菌株 质粒,,,,,, ,,,, ,,;,,,和大肠杆菌感受态细胞,,,,,均购自,,,,,,,公司。 ,(,(, 主要试剂 血液,,,提取试剂盒、,,,凝胶回收试剂盒、,;,, ,限制性内切酶、,,,,,, ,,,,,,、,,,,,, ,,,,,,、,,,,等均为,,,,,,公司产品;,,,,,购自,,,,,,,,公司;质粒提取试剂盒购自,,,,,公司;,,,,,, ,,,, ,;, ,,,,,,购自,,,,,,,公司。 ,(, 方法 ,(,(, ,;,模板的制备 采集兰州地区经镜检和,;,法确诊为被牛双芽巴贝斯虫感染的阳性的血液，加入柠檬酸钠抗凝剂。用血液,,,提取试剂盒提取兰州株牛双芽巴贝斯虫全基因组，操作方法参考试剂盒说明书。 ,(,(, 引物设计与合成 根据,,,,,,,中巴西株牛双芽巴贝斯虫基因,,,,,序列(登录号:,,(,,,,,,,,(,)设计引物，引物由宝生物工程(大连)有限公司合成。 上游引物:,′,,,;,;,,,,;,,,,;;, ;,,,,,,′;下游引物:,′,,,,,,;,,;,,,,,,,,; ,,,;,,′。 ,(,(, 目的基因的,;,扩增及电泳鉴定 ,;,反应体系:,,,模板, μ,，上、下游引物各,(, μ,，,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,, ,(,, μ,，,×,,,;,,,, ,,,,,, ,,(, μ,，用灭菌水补充至,, μ,。,;,反应条件:,, ?预变性,,,,;,, ?变性,, ,，,, ?退火,, ,，,, ?延伸, ,,,，,,个循环;,, ?延伸,, ,,,。用,,琼脂糖凝胶电泳检测,;,产物。 ,(,(, ,;,产物回收与纯化 ,;,产物经,,琼脂糖凝胶电泳后，将目的条带切下，参照,;,产物纯化回收试剂盒说明回收目的,,,，于,,, ?保存。 ,(,(, ,,,,,基因的克隆 连接体系:,,,,,, ,,,, ,,;,,, ,μ,，,,,,, ,;,纯化回收产物, μ,，,×,,,,, ,,,,,,,, ,,,,,, , μ,，,, ,,, ,,,,,, , μ,，共计,, μ,。在,, ?条件下连接过夜，连接产物命名为,,,,,,,,,,,,。连接产物的纯化按照,,,,,, ,,,, ,,;,,, 试剂盒提供的操作方法进行。 将, μ,连接产物,,,,,,,,,,,,加入到,, μ,感受态细胞,,,,,中，冰浴,, ,,,后，在,, ?水浴中热激,, ,，再冰浴, ,,,，加入预热好的,,培养液,,, μ,，于,, ?、,,, ,,,,,振荡培养, ,，离心，弃上清液，留下,,, μ,菌液均匀涂在含,,,、,,,,和,,,a,的,,平板上，,, ?条件下培养过夜。 ,(,(, 阳性转化子的,;,法和酶切法鉴定 挑取白色菌落置于含,,,的,,液体培养基中。振荡培养过夜，按照质粒提取试剂盒操作从阳性转化菌中提取,,,,,,,,,,,,质粒，并对所提质粒进行,;,鉴定，反应条件及,;,产物检测方法同,(,(,。用,;,, ,对,,,,,,,,,,,,质粒进行酶切鉴定。酶切体系:,,,,,,,,,,,, , μ,，,,×, ,,,,,, , μ,，,;,, , , μ,，灭菌水,, μ,，总体积为,, μ,。反应结束后用1%琼脂糖凝胶电泳检测酶切情况。 ,(,(, 阳性克隆产物序列测定与比较分析 ,;,法和酶切法鉴定正确的阳性克隆质粒由宝生物工程(大连)有限公司进行序列测定。将所测得的序列用,,,,,软件分析核苷酸序列与,,,,,,,中序列的同源性。 , 结果与分析 ,(, 目的基因的,;,扩增结果 ,;,扩增兰州株牛双芽巴贝斯虫,,,,,，该基因长度为,,, ,,，,;,反应结束后取反应产物, μ,在,,琼脂糖凝胶(含,(, μ,,,,溴化乙锭)中电泳，出现预期大小的目的条带，结果见图,。 ,(, 重组质粒的酶切鉴定结果 用,;,, ,对重组质粒进行酶切后，取, μ,进行,,琼脂糖凝胶电泳，观察酶切结果，电泳显示在, ,,, ,,附近和,,, ,,附近都出现了明显的条带，说明,;,, ,已将,,,,,,,,,,,,切成两段:,,,,,, ,,,, ,,;,,,和,,,,,，表明成功地克隆了,,,,,基因(图,)。 ,(, ,,,,,序列的测定与比较分析 克隆的,,,,,基因序列经宝生物工程(大连)有限公司测定，结果表明，将r,,,,基因与pgem-t easy vector相连，插入的片段长度为846 ,,。兰州株牛双芽巴贝斯虫的,,,,,与巴西株牛双芽巴贝斯虫的相应序列(,,,,,,,登录号:,,( ,,,,,,,,(,)相比具有很高的同源性，同源性为,,(,,,。 , 结论与讨论 本研究成功地克隆了兰州株牛双芽巴贝斯虫的,,,,,基因，该基因全长,,, ,,，与巴西株牛双芽巴贝斯虫的相应序列的同源性高达,,(,,,。 近几年，科学家在研究牛双芽巴贝斯虫侵袭红细胞时发现，位于虫体被膜上的表面蛋白质与宿主细胞结合之后才能完成虫体入侵红细胞这一过程,,,。 已有资料表明，牛双芽巴贝斯虫顶端复杂的细胞器可以直接导致宿主细胞的入侵以及虫体液泡,,,的形成和维持。棒状体在虫体入侵宿主细胞的同时被排出，对于巴贝斯虫属而言，棒状体的排出发生在红细胞入侵和虫体液泡形成的同时，并且在此过程中，棒状体很快溶解并消失。 牛双芽巴贝斯虫的r,,,,在牛体内可引发免疫防御反应，r,,,,在羧基端和氨基端分别有两个二态形的序列区域，氨基端,型(,,,,)存在于表面暴露的,细胞抗原决定簇中，羧基端,型(;,,,)存在于;,,，,细胞抗原决定簇中,,,。 ,,,,,,等,,,在试验中采用墨西哥株,,,,,双芽巴贝斯虫体,,,,发现每一个基因都包含一个二态形的序列，在氨基端和羧基端分别编码氨基酸序列。 由此可见，r,,,,对牛双芽巴贝斯虫来讲是一种非常重要的表面蛋白质，通过这种蛋白质的活动，牛双芽巴贝斯虫干扰宿主细胞 的功能，一方面，牛双芽巴贝斯虫获得生存的机会，另一方面使宿主红细胞崩解，虫体进入下一阶段的生活史。 研究,,,,,基因及其编码的蛋白质已成为治疗和预防牛双芽巴贝斯虫病的一个焦点，中国尚未开展这方面的工作，本研究成功克隆了兰州株牛双芽巴贝斯虫的,,,,,基因，通过多次测序该基因存在突变，将其与,,,,,,,中巴西株牛双芽巴贝斯虫的,,,,,基因序列进行同源性比较，结果显示序列之间同源性高达,,(,,,，证明,,,,,基因是高度保守的，仅有两个碱基的突变。由核苷酸序列推导蛋白质序列发现此碱基突变为无义突变，其编码的蛋白质结构并未发生改变。 牛双芽巴贝斯虫,,,,,基因的克隆为该基因的表达及生物学功能研究奠定了基础。作为药物靶点,11，12,的r,,,,的结构功能和远期的药物结合特性研究对研制治疗牛双芽巴贝斯虫病的主动靶向制剂具有重要意义。 参考文献: ,,, 赵 刚，张继才(牛双芽巴贝斯虫病,,,(云南畜牧兽医，,,,,(,):,,,,,( ,,, 周金林，沈 杰，王 权，等(牛双芽巴贝斯虫病的防制研究,,,( 中国兽医寄生虫病，,,,,，,(,):,,,,( ,,, ,,,,,,, , ,( ,,,,,,, ,,,,,,,,,, ,, ,,,;,,,,,,,, ,,,,,,,,, ,,,( ,,,,,,,,, ,,,,,，,,,,，,(,):,,,,,( ,,, ,;,,,,,, , ,， ,,,,,,,, , ,， ,,,,,, , ,，,, ,,( ,,,,;,,,, ;,,,,;,,,,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,,;,,, ,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,, ,,,,,,,, ,,,,,,,,, ,,,,,;,,,,,,,,,,,,( ,,, ,,,;,,, ,,,,,,,,,，,,,,，,,(,):,,,,,,,( ,,, ,;,,,,,, , ,，,,,,,,,, , ,，,,,,, , ;，,, ,,( ,,,,,,,,,, ,,,,,, ,,,,,,,, ,,,,,,,, ,,,, ,,,,,,,, ,,,,,,, ,, ,,, ,,,,,;, ,, ,,,, ,,,,,,, ,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,( ,,, ,,,,,,, ,, ,,,,,,,,,,，,,,,，,,,(,):,,,,,,,,,( ,,, ,,;,,,, , ,， ,;,,,,,, , ,， ,,,,,, ; ,，,, ,,( ,,,,,,, ,,,,,,,,:,,,,,,,,, ,,, ;,,,,;,,,,,,,,,, ,, ,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,( ,,, ,,,,,,,,,，,,,,，,,(,):,,,,,, ,( ,,, ,,,;,,,, , ,，,,,,,,,,, , ,( ,,,,,,, ,,,,,,,, ,,,,,,,,:,,,,,,;,,,, ,,,, ,,, ,,, ;,,, ,,,,,,,,,,,( ;,,,,;,, ,,,,,,, ,, ,,;,,,,,,,,,,,,,,,,，1988，,(,):,,,,,,,( ,,, ,,,,,,,,,,, , ,( ,,,,,,, ,,,,,,,,,, ,, ,,, ,,,;,,,,,,,:,,,,, ,,,, ,, ,,,, ;,,, ,,,,,,,, ,,, ,,,,,;,,,,,,, ,,,,,,,,,,,( ,,,,,,,,, ,,,,,，,,(,):,,,,,,,( ,,, ,,,,,, ,，,,,,,, ; ,，,;,,,,,, , ,，,, ,,( ,,,,,,; ,,,,,,,,, ,, ,,, ,,,,,,,,; ,,,,,,, ,, ,,,,, ,,,,, ,,, ,,,,, ,,;, ,, ,,,,,,, ,,,,,,,,,,,( ,,,,;,,,, ,,, ,,,;,,,,;,, ,,,,,,,,,,,,，,,,,，,,(,):,,,,,,,( ,,,, ,,,,,, , ,，,;,,,,,, , ,，,, ,, , ,，,, ,,( ,,,,,,,,,，,,？,,,;, ,,, ,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,, ,, ,,, ,,, ,,,, ,,,,,, ,, ,,,,,,, ,,,,,,,,,,,( ,,, ,,,;,,, ,,,,,,,,,，,,,,，,,(,,,):,,,,,,,( ,,,, 任百祥，周晓光( ,,,靶向药物作用机制及发展趋势,,,( 医药导报，,,,,，,,(,):,,,,,,,( ,,,, 张志荣( 靶向分子治疗基础与靶向药物设计,,,( 北京:科学出版社，,,,,( ,,,,,(