大鼠运动性肥大心脏心肌血管内皮生长因子及其基因表达的研究

大鼠运动性肥大心脏心肌血管内皮生长因子及其基因达的研究 3大鼠运动性肥大心脏心肌血管内皮生长因子及其基因表达的研究 21萍 李昭波 高云秋 杨李维根 唐朝枢 1 2 ( )北京医科大学第三医院运动医学研究所 ,心血管基础研究,三院眼科,北京 ( ) 摘要 目的和方法 :血管内皮生长因子 vascular endot helial growt h factor ,V E GF是新近确定的一种特异作用于血管 内皮细胞的活性肽 。最近发现正常心肌细胞可表达 V E GF ,高血压肥大心脏心肌 V E GF 及基因表达增强 ,但对运 动性心肌肥大时的变化尚不清楚 。本实验采用免疫组化和分子杂交方法 ,对游泳运动 10 周大鼠稳定期肥大心脏 ( ( ) 心肌 V E GF 及其基因表达进行研究 。结果 : Wistar Kyoto W KY大鼠 、自发性高血压大鼠 spo ntaneously hyperten2 ) sive rat s ,SHR和运动大鼠心肌细胞浆内均有特异性 V E GF 染色颗粒 ,但运动大鼠心肌细胞胞浆内染色颗粒增加最 明显 。Nort hern 分子杂交结果表明三组大鼠心肌均有 V E GF mRNA 表达 ,其中 SHR 表达最强 ,运动大鼠比 W KY 大鼠增强 ,但低于 SHR 。结论 :目前对这一结果的生理意义还不清楚 ,推测可能与心肌肥大时细胞间质血管增生有 关 。 关键词 血管内皮生长因子 心肌肥大 高血压 运动 V E GF 是 新 近 确 定 的 一 种 存 在 于 血 管 内 皮 细min ,每周 6 次 ,共 10 周 。游泳池直经 60 cm , 水深 1 胞 ,特异刺激血管内皮细胞增殖的活性肽。最近 60 cm ,水温 32,33 ?。另取 SHR 和 W KY 各 6 只 , 2 不进行游泳运动 ,同等条件下饲养 。发现正常心肌细胞有 V E GF 及其基因的表达,高 1 . 3 血压测定和心肌肥大计算 血压 肥 大 心 脏 心 肌 细 胞 V E GF 及 其 基 因 表 达 增 3 最后 一 次 游 泳 结 束 24 h 后 的 稳 定 期 , 称 体 重。提 示 V E GF 可 能 参 与 心 肌 肥 大 形 成 机 制 。 强 ) () ( B W, 戊巴比妥钠 35 mg/ kg腹腔注射麻醉 。经 我们前期研究表明高血压性肥大心脏心肌血管紧张 颈总动脉插管 ,用 RM26000 生理多导仪测颈总动脉 ( ) ( 素 ?Angiotensin ?,Ang ?,内皮素 Endot helin , 血压 。然后开胸取出心脏 ,4 ?预冷生理盐水冲洗 , ) ( ) E T和心钠素 at rial nat riuretic f acto r ,AN F等心源 () 沿室间隔剔除心房和右心室 ,称左心重 L V W。心 性活性肽的变化规律与运动性 肥 大 心 脏 的 变 化 不 4() 肌肥大程度以心系数 L V W/ B W表示 。 。但目前尚未见运动肥大心脏心 肌 V E GF 变同 1 . 4 免疫组化实验化的研 究 报 道 。本 实 验 采 用 免 疫 组 化 和 No rt her n 常规石蜡切片 。按试剂盒说明操作 。特异性一 分子杂交方法 , 通过对游泳运动大鼠和 SHR 心 肌 抗 V E GF 1?1 000 稀释 ,阴性对照用 PB S 代替 。湿 V E GF 及其基因表达的比较研究 ,为进一步认识运 盒 4 ?过夜 。生物素标记的二抗 1 ?200 稀释 , 37 ?动性心肌肥大形成的内分泌或旁分泌机制提供参考 孵育 30 min 。辣根酶标记的链霉卵白素 1 ?200 稀 资料 。 释 ,37 ?孵育 30 min 。新配制 DAB 显色 ,苏木素复 1 材料与方法 染 。用于图象分析的切片不复染 。 1 . 5 Northern 分子杂交1 . 1 材料 两只大鼠心脏合并一例 。异硫氰酸胍一步法提 体重 200,230 g 雄性 Wistar 大鼠 6 只购自北 取总 RNA 。1 %琼 脂 糖 凝 胶 行 甲 醛 变 性 电 泳 分 离 京医科大学实验动物中心 。体重 200,230 g 雄性 RNA ,虹吸印迹法转移 RNA 至尼 龙 膜 上 。80 ?干 SHR 和 W KY 大鼠各 6 只购 自 北 京 阜 外 心 血 管 医 β烤 2 h 后保存 。V E GF 和2actin cDNA 探针采用随 院动物科 。兔抗人 V E GF 多克隆抗体和 SP TM 试 32α机引物标记法标记2p2dC TP 同位素 。42 ?预杂交 ( ) ( 剂盒 Zymed 产品,V E GF cDNA 探针 美国国家卫 后 , 杂 交 24 h 。 - 70 ?放 射 自 显 影 4 , 7 d 。24 h ) β生研 究 院 Marvin O . Boluyt 教 授 馈 赠,2actin cD2 βV E GF 和2actin 用同一张膜杂交 。先杂交 V E GF , ( ) NA 探 针 购 自 华 美 公 司 , 随 机 引 物 标 记 试 剂 盒 32 (α(p ro mege 产品 , 2p2dC TP 自北京亚辉生物工程公 ) 司。其余试剂为 Sigma 产品和国产分析纯 。 ( )3 国家自然科学基金资助项目 No . 39500168 1 . 2 大鼠模型1997212206 收稿 1998205205 修回 Wistar 大鼠 6 只 ,每日游泳运动 1 次 ,每次 120 ( 用 50 %甲酰胺和 0 . 1 %SSP E 洗膜并经放射自显影g ,比 W KY 提 高 29 % , 但 比 SHR 低 20 % P < β) ( ) 确认无杂交信号后 ,再进行2actin 杂交 。0 . 01。W KY 大 鼠 血 压 12 . 3 ?1 . 1/ 10 . 4 ?0 . 5 ( ) 1 . 6 统计学处理KPa ,SHR 血 压 24 . 8 ?0 . 9/ 23 . 2 ?1 . 6 KPa , 比 ( W KY 大鼠收缩压增加 103 % ,舒张压增加 124 % P 免疫组化结果用组织切片表示 。杂交结果用放 ( ) ) 射自显影斑点图表示 ,并用 ISA S 2000 图象分析系 < 0 . 01。游泳大鼠血压值 12 . 5 ?0 . 7/ 0 . 9 ?0 . 5 ( ) 统对组化切片特异染色颗粒和分子杂交斑点进行半 k Pa ,与 W KY 大鼠比无明显差异 P > 0 . 05。 免疫 ( ) 定量分析 ,其结果用光密度平均值 OD表示 。免疫 组化结果 表 明 , W KY 大 鼠 心 肌 细 胞 胞 浆 () 组化切片每组分析 5 张 ,每张取 5 个视野的平均值 。 内有一定量 V E GF 特异褐黄染色颗粒 图 12A。运 ( ) 血压和心系数用平均值 ?标准差 x ?s 表示 ,采用 动大鼠和 SHR 心肌细胞胞浆 V E GF 特异褐黄染色 ? ( ) 颗粒明显比 W KY 大鼠增多 图 12B , C。图象分析 方差分析组间 q 检验行统计处理 。 结果表明 ,运动大鼠心肌细胞胞浆内特异染色颗粒 结果2 灰度 OD 值 为 1 . 26 , 比 SHR 心 肌 OD 值 1 . 01 高 ( () W KY 大鼠心系数值 2 . 21 ?0 . 18mg/ g 。SHR 25 % ,比 W KY 大 鼠 心 肌 OD 值 0 . 53 高 138 % 表 ) () 心系数 3 . 56 ?0 . 27mg/ g ,比 W KY 大鼠提高 61 % 1。 ( ( ) ) P < 0 . 01 。游泳大鼠心系数为 2 . 86 ?0 . 12mg/ () () () Fig. 1 Immuno histochemical staining of V E GF 1 :200in lef t vent ricular myocardium of W KY A, swimming rat s Band SHR ( ) ()C. PBS was substit uted for V E GF antibody in staining p rocedure as negative co nt rol D No rt her n 分子杂交结果表明 , W KY 大鼠心 肌心肌 mRNA 表达杂交斑点灰度 OD 值为 0 .W KY 有少量 V E GF mRNA 表达 , SHR 心肌 V E GF 表达 58 ,SHR 心肌 OD 值 0 . 97 ,比 W KY 提高 67 % 。游 明显增强 ,游泳运动大鼠心肌 V E GF 表达比 W KY 泳运 动 大 鼠 心 肌 OD 值 为 0 . 79 , 比 W KY 提 高 () () 增多 , 但比 SHR 降低 图 2。图象分析结果表明 , 36 % ,但比 SHR 降低 19 % 表 1。 Ta b. 1 OD value of V E GF level and it s mRNA exp ressio n in 其基因表达增强可能与其间质血管增生有密切的关 myocardium of t hree gro up s by scanni ng densito met ry 系 。 V E GF 文献 报 道 激 烈 运 动 可 明 显 引 起 心 肌 缺 血 缺Group V E GF level βmRNA/2actin mRNA 7氧 ,培养心肌细胞在缺氧条件下 ,V E GF 基因表达 W KY 0 . 53 0 . 58 8 增强。提示运动肥大心脏心肌 V E GF 及 其 基 因 SHR 1 . 01 0 . 97 表达增强可能与运动期间心肌局部缺血缺氧有关 。 Swimming 1 . 26 0 . 79 最近 Breen 报道大鼠游泳运动后骨骼肌细胞 V E GF 基因表达增强与运动时骨骼肌缺氧刺激有关的结果 9 也支持以上观点。 4 参考文献 1 . Berse G , Albrecht U , Sterrer S et al . Exp ressio n of vascu2 lar endot helial growt h factor during embryo nic angiogenesis and endot helial cell differentiatio n. Develop ment , 1990 ,85 : 507 2 . Berse G , Brown L F , Dvorak HF et al . Vascular per2 ( ) meabilit y factor vascular endot helial growt h factorgene is exp ressed differentially in normal tissues , macrop hages , and Fig. 2 Autoradiograp hs of V E GF mRNA hybridized blot of t umors. M olec B iol Cel l , 1992 ,3 :211 ( ) ( ) lef t vent ricular myocardium of W KY C, SHR Hand 3 . 李夏 ,李昭波 ,高云秋等 . 血管内皮生长因子及其基因在自 μ( ) g swimming rat s Sby Nort hern blot analysis wit h 20 发性高血 压 大 鼠 心 肌 中 的 表 达. 中 国 病 理 生 理 学 杂 志 , total RNA hybridized before V E GF p robe analysis. The ()修回 βblot was finally hybridized to 2actin for normalizing dif2 4 . 李维根 ,高云秋 ,张继峰等 . 血管紧张素 ?在运动性心肌肥ference in RNA co ncent ratio n. () 大中的作用 . 中国运动医学杂志 ,1994 ,13 3:13 5 . Kassab GS , Imoto K , White FC et al . Coro nary arterial 3 讨论 t ree remodeling in right vent ricular hypert rop hy. A m J 本实验结果表明运动性和高血压性肥大心脏心 Physiol , 1993 ,265 : H366 肌 V E GF 及其基因表达均比正常心脏增强 。但 运 6 . Carroll SM , Magnet AD , Knoepfer PS et al . Vascular en2 动肥 大 心 脏 V E GF 表 达 比 高 血 压 肥 大 心 脏 多 , 而 V ( ) dot helial growt h factor V E GFis increased during collateral E GF 基因表达确低于高血压肥大心脏 。说明两种 心() develop ment in t he ischemic heart abst ract . Ci rcul at ion , 1993 ,88 : I2239 肌肥大 V E GF 及其基因表达特征并不完全相同 。 7 . White FC , Sanders M , Peterso n T et al . Ischemic myocar2 由于目前尚未在心肌细胞膜上发现有 V E GF 受体 2 dial injury af ter exercise st ress in t he p ressure2overloaded 存在,故对心肌中 V E GF 表达的生理意义还不清 heart . A m J Pat hol , 1979 ,97 :473 楚 。研究表明在心肌肥大的发展过程 ,为维持恒定 8 . Shwei ki D , Itin A , Soffer D et al . Vascular endot helial 5 的氧灌流 , 间 质 血 管 常 伴 随 心 肌 肥 大 而 增 生, 最 growt h factor induced by hypo xia may mediate hypo xia2initi2 近发现心肌 V E GF 表达增强常与冠状动脉阻塞后 ated angiogenesis. N at u re , 1992 ,359 :843 6 侧支循环的建立相伴随。由于 V E GF 被 认 为 是 9 . Breen EC , Jo hnso n EC , Wagner H et al . Angiotenic 目前作用最强的特异刺激血管 内 皮 增 生 的 生 长 因growt h factor mRNA respo nses in muscle to a single bout of 1,由此可推论运动肥大心脏心肌细胞 V E GF 及子 () exercise. J A p pl Physiol , 1996 ,81 1:355 EXP RESSIO N OF VASCUL AR ENDOTHEL IAL GROWTH FACTO R AND ITS GENE IN MYOCARD IUM OF EXERCISE2IND UCED HY PERTROP HIED HEART 2 1 Li Zhao bo , Gao Yunqiu , Yang Ping, Li Weigen , Tang Zhao shu 1 2( Instit ute of Spo rt s Medicine , Instit ute of Cardiovascular Research ,Depart ment of )Op ht halmology 3rd Ho spital , Beijing Medical U niversit y , Beijing 100083 ABSTRACT ( ) Aim and Methods : Vascular endot helial growt h factor V E GF, a growt h and permeability factor specific for endot helial cell , has been identified in myocardium of t he normal adult heart and increased in myocardium of hypertensive hypert rop hic heart , but t he change of V E GF in myocardium of exercise2induced hypert rop hic heart is unclear . We t herefor st udied t he exp ressio n of V E GF and ( ) it s gene in myocardium of rat s subjected to 102week swimming p rogram and spo ntaneously hypertensive rat s SHRby immuno histo2 chemist ry assay and Nort hern bolt . All t he result s were analyzed by scanning densito met ry. Results : Co mpared wit h co nt rol Wistar ( ) Kyoto W KYrat s , t he lef t vent ricle weight / body weight of swimming rat s and SHR were increased by 29 % and 61 % respectively ( ) P < 0 . 01. The int racellular V E GF immunoractivity was p resent in myocardium of W KY rat s , SHR and swimming rat s , but t he immunoractivity of swimming rat s was t he st ro ngest in t he t hree group s. The result s of Nort hern bolt showed t hat t he exp ressio n of V E GF mRNA of swimming rat s was increased by 36 % t han t hat of W KY and decreased by 19 % t han t hat of SHR by scanning den2 sito met ry. Conclusion : Alt hough lit tle is known about t he role of exp ressio n up regulatio n of V E GF and it s gene in myocardium , it seems reaso nable to vascular p roliferatio n of swimming2induced hypert rop hic heart . KEY WORDS V E GF ; cardiac hypert rop hy ; hypertensio n ; exercise 衰老过程中大鼠脑 M 型胆碱能受体的变化及 NGF 的影响 1程晓红 易寄东 1 ( )解放军北京医学高等专科学校生理教研室 ,北京 100071 ; 军事医学科学院基础医学研究所 ) ( 现有的资料表明 ,大鼠脑中胆碱能神经系统的随龄性变化较为肯定的是突触前 ChA T 胆碱乙酰基转移酶活性明显下 ) (降 , HACU 高亲和力胆碱摄取明显减少 。而突触后胆碱能受体的变化因动物种属的不同 ,受体亚型的区分和研究方法的局 ) (限性 ,所得结果差异很大 。大量研究资料表明 ,外源性 N GF 神经生长因子对老龄动物脑胆碱能系统功能有显著作用 ,如 24 月龄大鼠持续两周脑室注射 N GF ,ChA T 和 HACU 均有显著增高 ,但 N GF 对胆碱能受体的影响尚未见报道 。本研究采用放 射配基结合实验和侧脑室注射方法 ,观察了大鼠脑 M 胆碱能受体在衰老过程中的变化及 N GF 对此变化的影响 ,以探讨衰老 的机制和 N GF 的作用环节 。 1 材料与方法 () 1实验动物分组 雄性 Wistar 大鼠 ,由军事医学科学院实验动物中心提供 ,常规饲养 。青年组 : 3 月龄 ; 成年组 : 12 月 ) (龄 ;衰老组 :20 月龄和 25 月龄 。N GF 注射及 ACSF 人工脊液对照组为 12 月龄 ,25 月龄大鼠 。 () ( ) 2放射配基结合实验 断头处死动物 ,冰冷条件下迅速分离脑组织 ,以 10 倍体积的 50 mmol/ L PBS磷酸盐缓冲液为 () () 介质 ,行内切式匀浆 ,匀浆液离心 1 000 r/ min ,10 min取上清液再次离心 1 6000 r/ min 20 min,所得沉淀加 PBS 混匀备用 。 3 μ) ( 将 100 l 大鼠脑组织细胞膜制剂与终浓度分别为 1 、2 、4 、6 、8 、10 nmol/ L 的H2QNB 氚标二苯乙醇酸奎宁酯混匀 ,非特异管 μ加入 1 mmol/ L 阿托品 ,各管反应终体积为 250l ,反应在 37 ?水浴中进行 20 min ,然后用 49 # 滤纸膜片减压抽滤 ,滤膜 80 ? ) (烤干 ,置 5 ml 0 . 5 %的甲苯 PPO 2152二苯甲恶唑闪烁液中 ,用 L KB21212 液闪计数仪检测其放射性 。对所测得的数据进行 ) ) (( Scatchard 分析 ,求得 Bmax 结合容量及 Kd 解离常数。 () 3侧 脑 室 微 量 注 射 采 用 常 规 的 脑 室 埋 Ta b11 Bmax and Kd of M2recep tors in rat brain of different group s ( 管技术 ,分别注射 N GF Renin2f ree 2 . 5 s , Sigma ()( )Group n Bmax f mol/ mg p ro Kd nmol/ L ) 公司产品 , 溶于人工脊 液 中 , 1 mg/ ml和 ACSF 3 mo nt hs 10 1186 . 58 ?140 . 471 . 90 ?0 . 54 () ( mmol/ L 无 水 葡 萄 糖 10 , 蔗 糖 0128 , 硫 酸 镁 3312 mo nt hs 12 707 . 60 ?109 . 26 1 . 11 ?0 . 51 112 ,氯化钙 112 ,氯化钾 5 ,氯化 钠 80 , Tris 15 .??20 mo nt hs 11 586 . 00 ?159 . 42 0 . 88 ?0 . 37 ) μ 6,每次 10 l ,每周 3 次 ,共 2 周 。33 25 mo nt hs 8 0 . 78 ?0 . 42373 . 95 ?138 . 66 2 结果3 P < 0 . 01 co mpared wit h 3 mo nt hs ; () 四各组大鼠脑组织中 M 受体的变化 1? P < 0 . 01 co mpared wit h 12 mo nt hs ; 组大鼠脑组织中 M 受体的 Bmax 随年龄增长依 3 P < 0 . 01 co mpared wit h 20 mo nt hs 次减小 ,各组间均有显著差异 ,而 Kd 值随年龄 ()() 增长减少 表 1,说明受体亲和力有所增大 。 下转第 140 页