低能离子束对微生物细胞的直接作用和间接作用研究

低能离子束对微生物细胞的直接作用和间接作用研究 低能离子束对微生物细胞的直接作用和间 接作用研究 )一 L,l/ 宋道军等;低能膏子柬对微生物细胞的直接作用和闻接作用研究 低能离子柬对微生物细胞的直接作用和间接作用研究. 一? n,1,r)宋道军罾余汛@余增亮 D1(中国科学院尊离孚再所i工程研究中心告肥230031) f,I 摘要以耐辐射微球菌(Deinococcusradiodurans)和E.coli为试材,用曼微扫描电镜 (SEM)和电子自旋共振(ESR)波谱仅研究了N离子注入对其细胞作用的情况.结果 表明,离子注入对生物细胞既存在着直接作用又存在着间接作用t注入离子的动量传递 产生了对细胞的直接作用,其能量沉积显示着对细胞的问接作用,而且随着注入剂量的 增大,两种擞生物细胞受到直接和问接作用损伤的程度也逐渐加剧. 关麓词离子注入,细胞,直接作用和间接作用.动量传递,能量沉积,自由基 ———一, ,..' 0}】言低%辣座5}和导车蓦射生牛蜉 在辐射生物学的研究中,常把7射线等电离辐射对生物体的作用分成直接作用和闻接作用,直 接作用就是指射线象"炮弹一样击中"靶材质,间接作用就是射线在其经过的径迹上,通过 射解作用所产生的各种自由基对生物体的作用.8O年代中期创立于我国的低能离 子柬生物学是辐 射生物学的又一个分支,但其作用机制却显着区别于7射线等电离辐射,注入离子对生物体的作 用是集能量沉积,动量传递,质量沉积和电荷的中和与交换于一体的联合作用[I],饲如.它作用于 生物体产生的是"马鞍型存活曲线,其对生物体的诱变作用表现出诱变率高,重复性好等特点. 纵观低能离子束生物学近十年来的研究,虽在育种应用中取得不少成果,但其基础研究仍根薄弱. 由于注入离子的能量较小((1O0keV).其作用是否也象7射线等的电离辐射那样具有直接作用和 间接作用的特点,研究人员对此还存在着不同的看法.余增亮等0的研究认为注入离子的动量传递 的结果能引起生物组织或细胞的表面溅射,导致细胞的形态变异,而卫增泉等[3]则认为能量等于或 低于110keV的重离子(?6),其在生物介质中的射程不足lp.m,因此,低能离子注入造成的细胞 损伤不是直接作用所致,而是由注入离子引起的某些次圾过程的间接作用,特别是特征x射线作 用的结果.那么,离子注入对生物体的作用情况到底是怎样的?目前尚无定论,为此,我们以徽 球菌(D.radiodurans)和大肠杆菌(E.coti)为试材,开展了这方面的研究. 1材料和方法 1.1萱|试一种和培井方法 擞球菌AS1.633购于中科院微生物研究所.该菌生长于1BY(胰蛋白胨lOg,葡萄糖1g,酵 母膏5g,蒸馏水lO00m1)培养基上,最佳生长温度32?,最适pH6.8,7.2{E.coliB生长于LB 培养基上(胰蛋白胨log,NaCI1og,酵母膏5g,蒸馏水1000m1),最佳生长温度37?, 最适pH7.0, 固体培养时加1.5的琼脂,两菌在播床发酵培养时200rpm下都能良好生长. 1.2用于SEM现囊的样品制鲁 取播瓶发酵培养18hr的活化菌种徽球菌(约含3×10CFU/m1)和14hr的E.coil(约含2× 0国塞自然科学基垒贤助项目(19605005). 1998年1月4日收稿. 高技术通讯1999.1 10CFU/m1),用无菌水洗3次,再经适当的稀释(10_')后取51均匀涂布于干净无菌的盖玻片 上,自然干燥后进行注入处理. 1.3用于ESR测定的样品棚鲁 取平皿培养3天的微球菌和2天的大肠杆菌,用蒸馏水稀释成较稀的糊状,均匀涂布于玻璃 片上,在超净台上自然干燥后用于N+离子注入. 1.4N离子注人处理 在本研究中心离子注入机上进行,注入能量为20keV,剂量为0(对照),2X1015ions/em,4 ×10ions/cm,6×10"ions/era,8×10"ions/cm,10×10ions/cm,注入靶室的真空度为1O-3 Pa,脉冲剂量为10ions/era.s,每次连续注入5s,间隔50~90s,以消除大剂量下热效应产生的 负作用,之后收集按上述2.处理的盖玻片用于SEM观察,按上述3.处理的干菌体5rag用于ESR 波谱测定. 1.5试剂和仪器 本研究所用试剂均为分析纯,ESR波谱仪,型号ER200D—SRC,德国BRURER公司产品,ESR 波谱测定在20+2?下进行,x波带,调频9.77Ghz,微波功率12.6roW,增益1.6×10{显微扫 描电镜为日本日立电器. 2结果与分辑 ?口?一 田1N离子注人对耐辐射徽璋一和大量杆一作用的王徽电?扫描黑片 (a)未注入对照(contro1)F(b)注入剂量20X10"ions/cm.F(c)注入剂量80~101*ions,cm}(d)注入量100XlOI410ns/emt (A)未注入对照(contro1),(B)注入剂量20X10"ions/cm}(c)注入荆量80~10~ions,cm2|(D)注入量100~10t4ions/cm2 大,细胞表面及深入到内部的刻蚀损伤逐渐增大}小剂量的注入虽未观察到明显的刻蚀损伤,但 一 48— 宋道军等.低能离子柬对微生物细臆的直接作用和闻接作用研究 可以预料I它能导致细胞表面产生许多的徽孔或洞并深入到细胞内部,扬剑波等叫利用离子注入的 捌蚀介导作用成功地将gus基因引入受体细胞,并实现了瞬间的表达的研究结果为我们的这一设 想提供了直接的证据f较大剂量下注入作用的结果导致细胞被严重捌蚀损伤(见图1),例如IOX 10.ions/cm.的N注入下,徽球菌和大脑杆菌细胞被严重捌蚀损伤,打得残缺不全,尤其是大脑 杆菌细胞的表面多处严重受损,这一直观的结果基本上否定了低能离子注入对细胞的损伤不存在 直接作用的论断,充分证实了动置传递对细胞所致的剡蚀作甩不仅伤及细胞的壁和膜,而且较大 剂量下离子注入的直接作用能象手术刀一样通过捌蚀形成徽孔或洞,并象"炮弹 一样撵入到细 胞内部.击中细胞质和遗传物质DNA.当然,由于生物细胞的壁或膜结构组成和密 度分布的不 匀性,也导致了离子注入直接作用的不均匀性,图中也清楚地表明了这一点. 2.2鼻子洼人对荫球?和 大弱杆?的间接作用研究 教球菌和大脑杆菌经不同剂 量的N离子注入24hr后,测定 的ESR渡谱(如图2所示).从图 中可知,与未注入的对照相比,两 者摹产生了很强的自由基ESR 渡萱单一峰.这表明在注入后的 较长时间内两种不同辐射敏感性 的截生物细胞内均存在着大量的 长寿膏自由基,这可能是注入造 成的I由基链式反应而产生的 OH,,H,它们能与生物大分 .…一 /, —— 一 — , 5 ——一一 ,———一4 3 ————,一,2 ——一一一一1 … 一\一 一一一—— 4 一—— \,3 一——一 ,一....2 ..一 一… , 1 田2注人量?子婚耐It蠢球?和大肠杆?自由基ESRt膏一主 子发生加或反应,抽氢反应或电1-剂量为ol2剂量lo×lo衄/血(48h)l.-剂量20×.雎,鼬I 获产生!'!~lNl?40?~10s'ions/~,?一札曲.".羟基t氯)一6(5)嗜睫自由基,'剂量..."/ 8一羟基孽嚎呤,棱糖自由基,尿嗜淀自由基,DNA,脂过氧自由基LO0,脂氧自由基LO,脂自 由基L等[5],这充分证明了离子注入对生物体的作用具有象射线等一样的间接作用. 3讨论 本研靛明.低能离子注入能象7射线等电离辐射一样对生物体产生直接作用和间接作用,其 直接作用主要是注入离子的动量传递于细胞的表面产生的鼹射作用和沉积于细胞内部产生的刻蚀 损伤,而问接作用主要是注入离子的能量沉积于细胞内部产生的自由基所导致的作用I本文在引 言中己述及离子注入对生物体的作用除了能量沉积和动量传递外,还有质量沉积和电荷的中和与 交换作用,巴有研究表明质量沉积作用能诱导注入的生物分子或细胞内生成新产物t但这种诱导 机制,它对生物体的作用是属于直接作用还是间接作用,目前尚不清楚I除此之外,注入离子的 电荷作用还教有人作撵入仔细的研究,这也是今后低能离子束生物学要加强的基础研究工作. ?考文棘. [1]余增亮荨.安t农业大学,1094,21(3)22l 一 , 一一 高技术通讯1999.1. 77/ [3]卫增泉等. [喜丁橱剖渡等. [5]沈志民等. [6]邵春林等. 生物物理,1996,12(3)316 科学通报.1994,39(16)I1530 生物化学与生物物理,1990,z2(1),39 棱技术,1996,19(6)j321 StudyontheDirectandIndirectActionofN+Ion ImplantationonD.radioduransandE.coli SongDaojun,YuXun,YuZenglmng (CentreofIonBeamBioengineering,InstituteofPlasmaPhys~s,AcdemmSinica,Hefei230 031) Abstract ThedirectandindirectactionofNionimplantationonD.radioduransandE.coliwasinVes— tigatedbySEMandESRspectrum.TheresultsshowedthatNionimplantationexerteddirect andindirectactiononthetwok/ndsofmicroorganismsandthemomentumtransferandenet~g y depos 1eve1 thedirectandindirectactiononcells,respectively.The ionwasgraduallyincreasedwiththeincreaseoftheim- tion,Cell,Directandindirectaction,Momentumtransfer,Energy - D GaN—based蓝光LED的研制"通过验收 由北京大学承担的863计自j嘎目"GaN. based苴光LED的研.I(课题蝙号:863-307- 05—01(05))已于去年10月通过863307 主题专家组的评审验收.验收专家组认为: (1)该课题组对GaN-based苴光LED材 料的生长和特性进行了深入细致的研究.攻克 1MoCVD生长中的气相剥反应,高的n一型 背景或流干娘度,p一型掺杂,InCaN有源区连 长调整,Rm刘蚀和欧姆接麓等技术难点.采用 (2)谖课题组设计研.I了具有独立知识产 权的GaN—hasedDH苴光LED蛄曲,避免了透 明电极国外专利保护,在较高P一型熏漉干浓度 的基础上,获得了较好的P一型欧姆按麓,改进 jLED的电流分布特性.分别1l4善P—n蛄和 DHGaN-based苴光LED.p-n蛄羹光LED的 I作电压为5V,I作电流为10mA.曼射连长 为450nmDHGaN-based苴光LED的蔓射嵌 长为480rim,FWHM为5Ohm: