原位杂交技术

原位杂交技术 原位杂交技术(In situ hybridization，ISH)是分子生物学、组织化学及细胞学相结合而产生的一门新兴技术，始于20世纪60年代。1969年美国耶鲁大学的Gall等(1969)首先用爪蟾核糖体基因探针与其卵母细胞杂交，将该基因进行定位，与此同时Buongiorno—Nardelli和Amaldi等(1970)相继利用同位素标记核酸探针进行了细胞或组织的基因定位，从而创造了原位杂交技术。自此以后，由于分子生物学技术的迅猛发展，特别是20世纪70年代末到80年代初，分子克隆、质粒和噬菌体DNA的构建成功，为原位杂交技术的发展奠定了深厚的技术基础。 目 录 1原位杂交的基本原理 2原位杂交技术分类 2.1 基因组原位杂交技术 2.2 荧光原位杂交技术 2.3 多彩色荧光原位杂交技术 2.4 原位PCR 1原位杂交的基本原理 原位杂交技术的基本原理是利用核酸分子单链之间有互补的碱基序列，将有放射性或非放射性的外源核酸(即探针)与组织、细胞或染色体上待测DNA或RNA互补配对，结合成专一的核酸杂交分子，经一定的检测手段将待测核酸在组织、细胞或染色体上的位置显示出来。为显示特定的核酸序列必须具备3个重要条件:组织、细胞或染色体的固定、具有能与特定片段互补的核苷酸序列(即探针)、有与探针结合的标记物(曾呈奎等2000)。 RNA原位核酸杂交又称RNA原位杂交组织化学或RNA原位杂交。该技术是指运用cRNA或寡核苷酸等探针检测细胞和组织内RNA表达的一种原位杂交技术。其基本原理是:在细胞或保持不变的条件下，用标记的已知的RNA核苷酸片段，按核酸杂交中碱基配对原则，与待测细胞或组织中相应的基因片段相结合(杂交)，所形成的杂交体 (Hybrids)经显色反应后在光学显微镜或电子显微镜下观察其细胞内相应的mRNA、rRNA和tRNA分子。RNA原位杂交技术 经不断改进，其应用的领域已远超出DNA原位杂交技术。尤其在基因和诊断方面能作定性、定位和定量分析，已 成为最有效的分子病理学技术，同时在分析低丰度和罕见的mRNA表达方面已展示了分子生物学的一重要方向。 2原位杂交技术分类 基因组原位杂交技术 基因组原位杂交(Genome in situ hybridization，GISH)技术是20世纪80年代末发展起来的一种原位杂交技术。它主要是利用物种之间DNA同源性的差异，用另一物种的基因组DNA以适当的浓度作封阻，在靶染色体上进行原位杂交。GISH技术最初应用于动物方面的研究(Pinkel et al.,1986)，在植物上最早应用于小麦杂种和栽培种的鉴定(余舜武等 2001;王文奎等 2000)。 荧光原位杂交技术 荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization，FISH)技术是在已有的放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性DNA分子原位杂交技术。它利用荧光标记的核酸片段为探针，与染色体上或DNA显微切片上的特异fl-N:~行杂交，通过荧光检测系统(荧光显微镜)检测信号DNA序列在染色体或DNA显微切片上的目的DNA序列，进而确定其杂交位点。FISH技术检测时间短，检测灵敏度高，无污染，已广泛应用于染色体的鉴定、基因定位和异常染色体检测等领域。FISH是原位杂交技术大家族中的一员，因其所用探针被荧光物质标记(间接或直接)而得名，该方法在80年代末 被发明，现已从实验室逐步进入临床 诊断领域。 基本原理是荧光标记的核酸探针在变性后与已变性的靶核酸在退火 温度下复性;通过荧光显微镜观察荧光信号可在不改变被分析对象(即维持其原位)的前提下对靶核酸进行分析。 DNA荧光标记探针是其中最常用的一类核酸探针。利用此探针可对组织、细胞或染色体中的DNA进行染色体及基因水平 的分析。荧光标记控针不对环境构成污染，灵敏度能得到保障，可进行多色观察分析，因而可同时使用多个探针，缩 短因单个探针分开使用导致的周期过程和技术障碍。 多彩色荧光原位杂交技术 多彩色荧光原位杂交(Multicolor fluorescence in situ hybridization，mFISH)是在荧光原位杂交技术的基础上发展起来的一种新技术，它用几种不同颜色的荧光素单独或混合标记的探针进行原位杂交，能同时检测多个靶位，各靶位在荧光显微镜下和照片上的颜色不同，呈现多种色彩，因而被称为多彩色荧光原位杂交。它克服了FISH技术的局限，能同时检测多个基因，在检测遗传物质的突变和染色体上基因定位等方面得到了广泛的应用(杨明杰等1998)。 原位PCR 原位PCR技术是常规的原位杂交技术与PCR技术的有机结合，即通过PCR技术对靶核酸序列在染色体上或组织细胞内进行原位扩增使其拷贝数增加，然后通过原位杂交技术进行检测，从而对靶核酸序列进行定性、定位和定量分析。原位PCR技术大大提高了原位杂交技术的灵敏度和专一性，可用于低拷贝甚至单拷贝的基因定位，为原位杂交技术的发展提供了更广阔的发展前景。 原位杂交技术因其高度的灵敏性和准确性而日益受到许多科研工作者的欢迎，并广泛应用到基因定位、性别鉴定和基因图谱的构建等研究领域。目前原位杂交技术在植物中的应用比较广泛，例如在棉花、麦类和树木等的遗传育种方面取得了显著的成就，在畜牧上原位杂交技术主要用于基因定位和基因图谱的构建以及转基因的检测和性别鉴定等方面。在水产方面，原位杂交技术则主要应用于基因定位(多见于对鱼类和贝类等水生物的研究)和病毒的检测(多见于虾类)。此外，原位杂交技术做为染色体高分辨显带技术的补充和发展，在水生物的细胞遗传学的研究领域将发挥更重要的作用。同其他的生物技术一样，原位杂交技术在其发展与应用的过程中会出现一些问，但随着原位杂交技术的不断改进与完善以及检测手段的改进，原位杂交技术的优越性越来越突出，其应用也会更加广泛。