骨髓间充质干细胞对成年大鼠视网膜节细胞再生的影响

骨髓间充质干细胞对成年大鼠视网膜节细胞再生的影响 骨髓间充质干细胞对成年大鼠视网膜节细 胞再生的影响 CHINESEJOURNAlOFANATOMYVo1.28No.32005解剖学杂志2005年第28卷第3期 骨髓间充质干细胞对成年大鼠视网膜节细胞再生的影响 项平黄锦桃.李海标. (1蚌埠医学院附属医院中心,蚌埠233004;2中山大学中山医学院组织学与胚胎学教研室) 摘要目的:探讨骨髓间充质干细胞(MSCs)对受损成年大鼠视网膜节细胞(RGCs)轴突再生的影响.方法:切断大鼠视神经,缝 接自体坐骨神经(AG).动物分对照组,AG+MSCs组,AG+MSCs+tPNS(~-{5总皂苷)组.各组动物存活3,4周,用粒蓝逆行 标记再生的RGCs,荧光镜下观察视网膜平铺片中再生RGCs的数量变化.免疫组化检测MSCs在玻璃体内的分化.结果:动物 存活3,4周,再生的RGCs数目实验组与对照组有显着性差异.AG+MSC组和AG+MSCs+tPNS组,存活的细胞达Vimen— tin.NF和GFAP,Laminin无表达.结论:玻璃体植入MSCs可促进受损伤的视网膜节细胞轴突再生. 关键词骨髓间充质干细胞;视网膜节细胞;再生? Effectsofmesenchymalstemcellsonregenerationofretinalganglioncellsinadultrats XIANGPing,HUANGJin-Tao,LIHai—Biao (CentralLaboratory.AffiliatedHospitalofBengbuMedicalCollege,Bengbu233004,China ) AbstractObjective:ToinvestigatetheeffectsofmarrOwmesenchymalsterncells(MSCs)on axotomizedretinalganglioncells (RGCs)inadultsrats.Methods:Afteropticnerve(ON)transection,anautologoussciaticnerv e(attachedgraft,AG)wasre— movedandsuturedtOtheproximalstumpoftheON.Animalsweredividedinto3grOups:controlgroup(AG+PBS),AG+MSCs groups.AG+MSCs+tPNSgroups(MSCswasinjectedintovitreousbody,atthesametime,tPNSwasinjectedintoabdominal cavity).AnimalsineachgroupwereallowedtOsurvivefor3— 4weeks.RegeneratedRGCswerelabeledretrOgradelybygranulal blue.andthechangesofregeneratedRGCsineachretinawereobservedunderfluorescentmicroscope.MSCsinvitreousbody Wereobservedbyimmunohistochemistry.Results:ThemeannumberofregeneratedRGCsinAG+MSCsgroupsandAG+MSCs +tPNSgroupsat3and4weeksweresignificantlyhigherthanthatincontrolgroup.TheMSCsinjectedinvitreousbodyex— pressedvimentin.NFandGFAP.intheAG+MSCsgroupandAG+MSCs+tPNSgroup,butdidnotexpressedlaminin.Con— clusion:MSCscanpromotetheregenerationofRGCsafteraxotomy. Keywoldsmarrowmesenchymalstemcells;retinalganglioncells;regeneration 骨髓间充质干细胞(marrowmesenchymalstem cells,MSCs)除可向中胚层来源的细胞分化外,还可 跨胚层向内胚层和神经外胚层的神经元及神经胶质 细胞分化?1].目前多数研究希望MSCs能被特异性 地诱导分化为神经元,以期替代丢失的特定神经元. MSCs是否能促进受损视网膜节细胞(retinalgangli— oncells,RGCs)的轴突再生,尚未见报道.本实验把 MSCs移植到RGCs再生模型大鼠的玻璃体内,探讨 MSCs对受损大鼠RGCs轴突再生的影响,为研究中 枢神经再生机制和临床治疗提供实验基础资料. 1和方法 1.1实验动物健康SD青年大鼠(2,3个月龄), 体质量6O,8Og,细胞培养用;健康成年SD大鼠, 200~250g,再生RGCs模型用.由中山大学北校区实验 国家重点基础研究规划("973"计划)课题(G1999054301-2),安徽 省教育厅自然科学基金(2005~287) ---—— 252---—— 动物中心提供. 1.2主要试剂L—DMEM(GibcoBRL公司),Ho— echst33342,胰蛋白酶,SABC-Cy3荧光试剂盒(Sigma 公司).胎牛血清(杭州四季青生物材料研究所).三 七总皂苷(totalpanaxnotoginsengsaponins,tPNS) 粉剂购于广西梧州制药集团,粒蓝(granularblue, GB)购自德国Merck公司,波形蛋白(vimentin)和层 粘连蛋白(1aminin)购自SantaCruz公司,胶质纤维 酸性蛋白(glialfibrillaryacidicprotein,GFAP)购自 Maxim公司,神经丝蛋白(neurofilament,NF)购自 Neomaker公司. 1.3动物分组成年健康SD动物随机分3组:(1) AG+PBS组:在切断视神经(ON)近端缝接一段自体 坐骨神经+玻璃体注射0.1mol/LPBS2L.(2)AG +MSCs组:在切断ON近端缝接1段自体坐骨神经 +玻璃体注射2L1x10/LMSCs(约20000个细 胞).(3)AG+MSCs+tPNS组:在切断ON近端缝 接一段自体坐骨神经+玻璃体注射2I1×10/L MSCs,并腹腔注射tPNS(术前1d开始每天腹腔注 射150mg/kgtPNS).以上各组动物分别存活3,4 周,每个时间点5只动物. 1.4动物模型4%水合氯醛(100mg/kg)麻醉动 物,手术显微镜下,眶内分离ON,距球后约1.0mm 切断ON,其近残端缝接一段约2.0cm自体坐骨神 经,坐骨神经另一端包埋,固定于颅顶肌肉.眼球复 位,局部滴环丙沙星眼药水,以3-0丝线缝合头皮. 在温暖的环境中待清醒后放入笼中继续饲养. 1.5MSCs分离培养参照文献[3]. 1.6移植细胞标记MSCs移植前,细胞中加含Ho— echst33342(1mg/100m1)的L-DMEM完全培养液, 37~C,5%)2培养6h,0.125胰酶消化离心,收集细 胞,用0.1mol/LPBS调整细胞密度为1×1O/L. 1.7细胞移植实验组:用玻璃微管经SD大鼠角 巩膜缘将2L的细胞缓慢注射入玻璃体内.对照组: 同样方法玻璃体内注入PBS. 1.8再生RGCs标记及数据分析取材前3d,距移 植端约1.5cm处切断坐骨神经,粘有3%GB的明胶 海绵填塞,逆行标记.3d后,麻醉动物摘出眼球,置 4%多聚甲醛(O.1mol/I磷酸缓冲液pH7.3)中剥离 视网膜,4?固定1h,0.1mol/L磷酸缓冲液漂洗,视 网膜平铺片参照文献[4].荧光显微镜下用400nm 波长观察并计数整个视网膜的节细胞数,数据用统计 学t检验分析. 1.9MSCs在玻璃体内的存活和分化动物存活4 周后,取出眼球,4%多聚甲醛(0.1mol/L磷酸缓冲 液pH7.3)4~C过夜固定,换3O%蔗糖浸泡标本沉淀. 矢状位制作10ffm冰冻切片,5正常羊血清孵育半 小时,加入第一抗体(分别为GFAP,NF,Vimentin, Laminin)在4?中过夜,加入第二抗体(兔抗鼠,1: 200),室温1h,加入抗生物素蛋白结合的Cy31:100 孵育1h,或用DAB显色,甘油缓冲液封片;在荧光显 微镜下,选取合适的滤光片观察.随机数数张切片内 MSCs的总数及NF和GFAP阳性细胞数,计算NF 和GFAP阳性细胞数占总数的比例. 2结果 2.1MSCs对再生RGCS数目的影响动物存活3, 4周AG+MSCs组视网膜再生的RGCs数目分别为 2218?1l4,1908?135,明显多于对照组(717?121, 628?130,P<0.05).AG+MSCs+tPNS再生的 RGCs数目分别为1235?122,1195?109也明显多 于对照组(P%0.05),但比单独玻璃体注射MSCs或 者单独腹腔注射tPNS再生RGCs[8数目明显少.见 图1和图2. 2.2MSCs在玻璃体内的存活和分化 2.2.1移植细胞的存活情况眼球组织冰冻切片显 示:AG+MSCs组和AG+MSCs+tPNS组,动物存 活4周,玻璃体内均有Hoechst33342标记的细胞,但 未发现迁移至视网膜内(图3,5). 2.2.2免疫组化结果AG+MSCs组和AG+ MSCs+tPNS组,存活的细胞(Hoechst33342?标记的 细胞)表达Vimentin,NF和GFAP,Laminin无表达. 两组结果一致,NF和GFAP表达率分别为(6? 3.4)%和(10?3.1),AG+MSCs+tPNS组NF的 表达率未见增高(图3,5). 3讨论 本实验结果表明未见植入玻璃体内的MSCs迁 移至视网膜内,在玻璃体内的MSCs只有少量可分化 为神经元样和星形胶质样细胞,但大部分未见明显分 化,对Vimentin和Laminin仍呈植入前相似的免疫 组化反应,说明MSCs不能穿过玻璃体膜迁移至视网 膜内替代受损的RGCs.MSCs植入玻璃体内3周和 4周具有明显促进RGCs再生的作用.玻璃体移植 MSCs并腹腔注射tPNS也可促进RGCs的再生,但 其作用没有单独玻璃体植入MSCs明显,作用也没有 单独腹腔注射tPNS明显_5].MSCs植入玻璃体内可 促进RGCs再生的作用,未见报道. 在玻璃体内的少量的MSCs分别表达NF和 GFAP.NF是神经元的特异性标志物而GFAP是星 形胶质细胞的标志物,表明植入玻璃体内少量MSCs 分别可向神经元样和星形胶质样细胞分化.其分化 机制不清楚.已有的研究表明MSCs在特定的微环 境中可向神经元和神经胶质细胞分化.注射到脑 内_6]12d后,可在脑内检测到MSCs分化为星形胶质 细胞和神经元表现型.至于为何MSCs在玻璃体内 向神经元样和星形胶质样细胞分化,有待进一步 研究. 由于玻璃体与视网膜之间有玻璃体膜相隔,我们 实验结果表明移植的细胞仍在玻璃体内,未见穿过玻 璃体膜迁移至视网膜内,排除了MSCs直接作用 RGCs来促进其再生的可能.有研究认为MSCs能 分泌某些神经营养因子如BDNF和NGF[].此外 MSCs分化的神经元样和星形胶质样细胞可能也分 泌生长因子,研究表明星形胶质细胞也产生许多生长 因子,包括神经营养素家族所有成员如NGF,BDNF, NT一3,CNTF,bFGF,enkephalin,somatostatin和胶 质细胞源性的神经营养因子(GDNF)等_g.这些 因子能提高中枢神经元的增殖,存活和分化.近年苏 国辉研究组的研究表明CNTF可大幅度提高RG 的再生. ....—— 253....—— ii』物『m?,f-r,I【t^)V-MflllIIr?一1P%SI"I.H【}L1】『舢.Jm. j?.『-J,l-I'【『lfA,l,(r?I_,J,】I{l,fl【({.1们ffllqn.1…, 薛I11-ul-12f^J?I)^l(1{】""驰墒体MVim…J引… }I物rrl圳H1{{I!c^)】(,c?}埔fl,M,讣I;FMItrIj胞c)【 物fI刊Hl川r{1^JIv?l…h瞳件MXF圳?,圳】 I岬?m'"【bL4edl1,_??"b/unwI?,……l…I,^.t'Rs+II.,,Mff4':AI+M Fig[~egt.[itd'"lLllgr~muln[hhin1w,?,J?''^:,『^',Ms.Af,+M( FVim'11tin…Tl?l?I1?…riLl…ms【…inl'一14t|【_?_w)H…{1^】删jfj^H川FlJ 『'I(j'.…【cmil1…jt1lM…nll…Isl~'II,Ilk1l…gr?1lJfJ?rnw"JI…Il{.{{(『,)Lv_1?TuJclJ, 【\l……I『IMiTilr[1lir(.?ln{…mv."口】[??Ihch1_ll,lAIf'vIcI{】1i! 破墒怍侈J1l(MS(坪怛』t:时J】NS_l_l川促世 mrL的j..fI1tt~lsHJ没仃啦础帔璃怍枘人MS( . 我?门I前j小清楚』罔.-J能'0tPNS政变 r机体一呲球1々状眦影响rMS(促进,c'JI_ 仃足.j1.剐选币nJ有待进步研究 彗考 YLIhnaJ-】Jkmah~gir1rR…,【n?I…c? 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