花生胰蛋白酶抑制剂_PI_基因的克隆和原核表达

52 花生胰蛋白酶抑制剂（PI）基因的克隆和原核表达 刘培培 温韵洁 宾金华 （华南师范大学生命科学学院，广东省植物发育生物重点实验室，广东 广州 510631） 蛋白酶抑制剂（protease inhibitor，PI）是一类能够抑制蛋白质水解酶活性的多肽 或蛋白质，普遍存在于植物中。种子中含有丰富的 PI，报道最多的是豆科、茄科、禾本科 及十字花科等植物。 PI 的分子量一般比较小，它们能与蛋白酶活性部位或变构部位结合抑制酶的催化活性 或阻止酶原转化为有活性的酶，在调节蛋白酶活性和蛋白质代谢等方面起着重要的作用。 根据其作用的酶活性部位的不同，PI 分为丝氨酸蛋白酶抑制剂、半胱氨酸蛋白酶抑制剂（巯 基蛋白酶抑制剂）、金属羧肽酶蛋白酶抑制剂和天冬氨酸蛋白酶抑制剂。目前已发现的植物 来源的 PI 主要属于前 3种类型。其中，最主要的为丝氨酸蛋白酶抑制剂类型。 植物种子的 PI 至少具有三种最基本的生理功能：第一，作为抗营养因子成为植物的繁 殖策略之一，保护种子免受病原微生物、昆虫、鸟兽等猎食者的侵害或取食；同时也是进 行抗虫、抗病等遗传育种及基因工程研究的热点课题；并为人们治疗多种与蛋白质代谢有 关的疾病，展示了新的广泛前景；第二，作为自身蛋白酶活性的调节因子，在种子发育及 萌发过程中调节蛋白酶的活性，阻止对种子或幼苗不利的各种不良蛋白水解反应；第三， 作为贮藏蛋白为幼苗的生长提供氮源和碳骨架。 随着分子生物学、细胞生物学和生物工程研究技术的迅速发展，以及功能基因组学的 蛋白质组学等研究手段的建立，对植物中蛋白酶抑制剂的研究越来越深入。有关蛋白酶抑 制剂在植物抗病虫害中的作用，也引起了科学家广泛的兴趣。 本实验室段小华(2004)从花生种子中纯化分离出一种蛋白酶抑制剂,对胰蛋白酶具有 强抑制作用。对该蛋白进行 N 端序列表明,该蛋白酶抑制剂属于丝氨酸蛋白酶的 Bowman-Birk 家族的成员。该蛋白酶抑制剂具有体外抑制黄曲霉孢子萌发的菌丝生长的能 力，具有抗菌的有效成分。由于从段小华(2004)的实验结果看,从花生种子中纯化出胰蛋白 酶抑制剂的过程非常繁琐,而且得率很低,仅有 0.036％,因此有必要建立一个能大量获得纯 化的花生胰蛋白酶抑制剂的方法。 大肠杆菌表达系统是基因表达技术中发展最早、目前应用最广泛的表达系统,是分子生 物学产业化发展的重要工具。大肠杆菌的遗传背景清楚，容易培养，能大规模发酵，以及 可供选择利用的克隆和高效表达，使之成为人们克隆和表达外源基因的首选菌株。 以花生(Arrachis hypogaea L.)汕油 523 种子为材料，从发育中后期的花生种子中提 取总 RNA，经反转录获得 cDNA ,根据花生 PI 的 cDNA 序列特异性引物，通过 PCR 扩增获得 PI 全长 cDNA。PCR 产物和 pET32a 原核表达载体经双酶切、纯化后利用 T4 连接酶 进行连接并转入大肠杆菌(Rosetta gami B(DE3))中。转化子经抗性筛选、PCR 鉴定、双酶 切鉴定和测序证明花生 PI 基因原核表达载体 pET32a-PI 构建成功。经 IPTG 诱导后在大肠 杆菌中诱导出大量有抑制活性的目的蛋白。 国家自然科学基金（30671338、30971841）资助项目