国内肝癌转移动物模型研究概况

第 20 卷第 5 期 2012 年 5 月 Vol.20 No.5 May,2012 中国医学工程 China Medical Engineering 184· · 国内肝癌转移动物模型研究概况 徐 冰 1，姚 明 2 （1. 河南省疾病预防控制中心，河南 郑州 450016；2. 上海市肿瘤研究所，上海 200032） 摘要：肝癌转移动物模型为肝癌转移机制研究和实验性治疗研究提供了实验技术平台。随着免疫缺陷动物的应用，肝癌转 移动物模型的研究也获得了新的发展空间。本文从建立模型的影响因素、观测方法、建立方法等方面对目前国内有关肝癌 转移动物模型的研究现状进行简要阐述。 关键词：肝癌；转移；疾病模型；动物 中图分类号：R 735.7 文献标识码：B 我国是肝细胞癌 (Hepatocellular carcinoma，HCC，简称肝 癌 )）的高发国家，肝癌的死亡率在癌症死亡率中己名列第 二 [1]，而发生转移是肝癌患者治疗失败和死亡的主要原因。 肝癌转移动物模型为肝癌转移机制研究和试验性治疗研究 提供了试验技术平台，因此肝癌转移动物模型的研究在我国 具有重要意义。近年来，随着免疫缺陷动物在我国的应用， 肝癌转移动物模型的研究也获得了进一步的发展空间。本文 从建立模型的影响因素、观测方法、建立方法等方面对目前 国内有关肝癌转移动物模型的研究现状进行综述。 1 建立肝癌转移动物模型的影响因素 1.1 瘤源 就目前应用的肝癌转移动物模型来看，瘤源大多包括以自发 性或诱发性动物肿瘤为来源建立的移植性肿瘤、已建立的人 癌细胞株、临床手术标本三部分。以自发性或诱发性动物肿 瘤来源，由于瘤源是鼠源性，与人体肿瘤差异较大，所以其 应用价值受到限制。已经建立的人癌细胞株，虽然易于保存 和应用，但由于体外环境和体内环境的差异及传代时消化酶 破坏等因素的影响，其转移性在动物体内的表达结果不甚理 想，也限制了进一步应用。临床手术标本由于材料来自人体， 一般所采用的组织块移植法保留了人体肿瘤完整的组织学 特征，故成为近年来新建肝癌转移模型的主要瘤源。如复旦 大学肝癌研究所 [2] 利用人肝癌标本建立的裸小鼠人肝癌高 转移模型 LCI-D20，该模型自发转移率达 100%，同时具淋 巴道和血道转移的特点；后又在此基础上建立高转移细胞系 MHCC97[3]。郑建明等 [4] 建立的模型局部侵袭率为 100％， 自发远处转移率为 57.8％。郜永顺等 [5] 用新鲜人肝癌组织 建立的裸鼠模型，出现了肝内、肺和骨转移。但是利用手术 标本移植往往要重复多次，或移植数例方可成功，移植裸鼠 体内时要新鲜，无坏死，无包膜，这是移植成功的关键。 1.2 移植部位 肿瘤移植按移植的部位可分为异位移植和原位移植。部位不 同可影响移植瘤的生物学特性。如皮下异位移植虽能维持 来源肿瘤的组织结构和生理生化特性，但由于其外被包膜， 多呈局限性生长，少见或未见转移。原位移植理论起源于 PEGET 的“种子与土壤”学说，即只有种子（瘤细胞）与 土壤（相应的微环境）相互作用才能产生转移瘤。原位移植 可获得在人体内相同或相近的微环境，该环境能提供多种促 进肿瘤生长的因子，故移植成功率高。而且移植部位供血丰 富，移植的肿瘤组织容易浸润和扩散，更能客观模拟人体肿 瘤浸润和转移的过程。这克服皮下移植瘤在侵袭和转移表达 上的缺陷。目前建立肝癌转移动物模型大多采用原位移植的 方法 [2,4,5]。 1.3 免疫状态 裸鼠虽然缺乏功能性 T 细胞，存在免疫功能缺陷，但体内 尚有较高的 NK 细胞活力、B 细胞活性和非依赖性 T 细胞免 疫活性，这可能在抵抗移植肿瘤中起作用。不同鼠龄 NK 细 胞活性不同，如移植在年幼或新生裸鼠体内的肿瘤更易生长 和形成转移。不少学者报道，在幼年裸鼠（3 周龄）体内表 现为明显侵袭和高度自发性或试验性转移的肿瘤，在成年鼠 （6-8 周龄）体内，往往呈局限性生长或低转移。但有人将 肝癌 C5F 细胞接种到 4 周龄 BALB/cA 雄性裸鼠皮下，裸鼠 衰竭时处死未发生肺转移，而接种到 7 周龄雌性裸鼠的则有 大体肺转移形成，认为年龄在此模型中不是影响转移灶形成 的主要因素 [6]。如果利用 T、NK 细胞，T、B 细胞以及 T、 B、NK 细胞联合免疫缺陷小鼠可以提高肿瘤移植的成功和 转移率。如徐冰等 [7] 利用 NOD-SCID 小鼠建立的人肝癌模 型比用裸小鼠建立的模型更容易发生体内的转移。有人将 Walker-256癌肉瘤接种于肝脏内建立大鼠肝硬化肝癌模型， 并行脾切除术，认为脾脏在肿瘤免疫中有一定抑制肿瘤生长 及转移的作用，荷瘤早期切除脾脏可能加速肿瘤的生长、转 移 [8]。 1.4 其它 人体肿瘤在动物体内传代时间过长，可能会发生染色体变 异。陶文照等 [9] 通过观察和连续传代 20 年的肝癌裸鼠 皮下移植及原位模型的病理变化特征，发现肿瘤局部侵袭及 转移的恶性生物学行为未发生改变，但肿瘤细胞分化更差， 部分肿瘤细胞染色体变为裸鼠染色体，这可能与裸鼠内环境 影响和瘤细胞的多潜能分化有关。 有研究者发现，肝门阻断所导致的缺血再灌注损伤能加速裸 鼠肝肿瘤细胞的生长，促进癌旁组织中与转移复发相关基因 (VEGF、MMP-9) 的表达，这为肝癌切除术后的复发与转移 提供依据 [10]。 在移植模型操作上，要提高肝癌模型的稳定性，保证瘤株活 性和提高操作技术是试验的关键。移植用瘤块必须选用皮下 瘤周边呈鱼肉样、质地偏硬的肿瘤组织；从制备瘤块到关腹 的各个环节都应严格无菌操作，积极防止感染；保证种瘤器 械专用，防止因腹壁或邻近脏器、腹腔肿瘤种植影响动物自 然生存期 [11]。 2 肝癌转移动物模型的观测方法 观察肝癌模型的转移情况，大多要把动物处死或开腹。近年 来计算机 X 射线断层扫描（CT）、磁共振成像（MRI）、 正电子发射断层摄影术（PET）等影像学技术在肿瘤动物模 型上的应用，可以避免这种缺陷。如兔VX2肝癌大动物模型， 有人采用螺旋 CT(SCT) 扫描检测，对瘤灶的变化和远处转移 情况进行动态观测，病灶能清晰显示，是对模型进行无创评 估、快捷、并容易重复实施的检测手段 [12]；杜文华等 [13] 用 二维超声检查发现该模型病灶回声特点缺乏特异性，经内部 彩色多普勒（CDFI）和能量多普勒（PDI）声学造影后，兔 肝内转移癌病灶周边及内部点状或条状血管数目增多，尤以 PDI 变化最为明显。认为能量多普勒超声造影成像对肝脏转 移性癌的血管特征等的诊断，比常规的二维超声和 CDFI 具 综 述· · 收稿日期：2012-03-09 第 20 卷第 5 期 2012 年 5 月 Vol.20 No.5 May,2012 中国医学工程 China Medical Engineering 185· · 有更高的敏感性。孙宝昌等 [14] 用筛选的稳定表达荧光素酶 的肝癌细胞 (BEL-7405) 单细胞克隆裸鼠皮下接种，利用活 体成像系统观察了肿瘤的生长过程，肿瘤发光可随着观察 时间的延长而增强，为活体内监测肿瘤生长甚至转移提供方 法。 肝癌早期癌细胞即可进入血循环，血行微转移是肝癌发生 转移的一个重要步骤，因此有关肝癌模型血行微转移的研 究近年来也有报道。有人通过用巢式 PCR 检测大鼠诱发性 肝癌中的 GPC-3 mRNA 和 AFP mRNA，发现外周血 GPC-3 mRNA 的阳性率与肝癌微转移的发生有明显的相关性，且高 于 AFP mRNA 的阳性率，为肝癌微转移研究提供新的诊断 指标 [15]。血行性转移与血液中的肿瘤细胞负荷量密切相关， 及早发现并定量血中的肝癌细胞数对肝癌转移模型研究具 有积极意义。而以往检测外周血甲胎蛋白信使核糖核酸（AFP mRNA）的方法多为定性法，难以及时反映肿瘤发生转移的 发展阶段，吴晓凤等 [16] 以裸鼠肝原位移植肿瘤模型为对象， 用 TaqMan 实时定量逆转录 - 聚合酶链反应（RT-PCR）技 术检测外周血 AFP mRNA 水平与原发性肝癌根治性切除术 后复发转移关系，认为外周血 AFP mRNA 可作为反映肝癌 复发转移的敏感指标。 3 肝癌转移动物模型的建立方法 目前，肝癌转移模型存在转移率较低、周期长、范围局限等 缺点。李琦等 [17] 采用细胞浆肝内注射制作大鼠移植性肝癌 模型，从制作腹水瘤开始到肝肿瘤生长至 0.6cm 仅需 2 周时 间，而瘤块移植常需3-4周；该模型动物自然生成时间为3-4 周，晚期有肿瘤转移腹水形成。金昌德等 [18] 在 HHCC 细胞 内转染可增强转移能力的 β Ｇ基因，采用裸鼠脾种植法复 制肝癌转移模型，可出现广泛转移，在肝、肾、肠系膜淋巴 结肉眼可见转移灶，但 β Ｇ基因转染 HHCC 细胞后其生物 学特性有所改变，这与临床原始癌症相比其特征有一定差异。 建立肝癌高转移模型，目前的方法有体内筛选和体外筛选 两种方法。体内筛选即是将肝癌细胞悬液或组织块等移植 于有利于肝癌表型表达的体内部位，使发生转移，然后将 其转移灶再移植于动物体内，如此反复数次便可能建立肝 癌的高转移模型。一般多采用原位 - 转移灶循环筛选方法， 师长宏等 [19] 通过肝脏原位接种肿瘤细胞，取其淋巴结转移 灶反复肝内接种建立了人肝癌细胞系 HCC-9724 淋巴结转移 模型，50 天肠系膜淋巴结转移率达 100%。体外筛选法的理 论基础是肿瘤细胞的异质理论，即肿瘤本质上是由多克隆 异质性细胞组成，转移的发生主要取决于具有高转移能力 的克隆株细胞存在于肿瘤细胞群体之中，利用细胞克隆技 术可以筛选不同亚群的肿瘤细胞。复旦大学肝癌研究所 [20- 21] 用有限稀释法，从高转移潜能人肝细胞癌细胞系 MHCC97 中筛选出两个不同转移潜能的克隆细胞株，发现两个克 隆株（MHCC97H、MHCC97L）的生物学性状不同，其中 MHCC97H 的肺转移率为 100％。此后，用高转移性人肝癌 克隆细胞株 MHCC97H 接种裸鼠，进行 3 次肺转移筛选，取 肺转移瘤建成皮下接种后自发性肺转移的细胞系 HCCLM3， 经皮下和原位接种均出现了自发性高转移。 4 模型评价 对转移模型转移程度的分级，高进 [22] 认为转移率在 70% 以 上为高转移，转移率在 30%-70% 为中转移，30% 以下为低 转移，0% 为不转移，经过多年应用可作为重要参考。 同时认为，肿瘤转移程度应有确切定量概念，肺内转移程度 的大体观察可按肺组织表面结节大小和数目分为三级，组 织学分级可按肺内形成结节状转移灶和呈粟粒状或呈肺炎 样实变区分为不同等级。 顾伟等 [11] 初步拟定了能模拟人类原发性肝癌发生发展的大 鼠肝癌模型的分期标准，用组织块肝内种植法复制大鼠移 植性肝癌模型，在不同时期分别观察模型，认为大鼠移植 性肝癌模型第 5-11 天相当于人类早期肝癌，第 18 天后相 当于临床晚期肝癌，这对选择指导原发性肝癌治疗策略具 有意义。 综上所述，国内肝癌转移动物模型的研究近年来已经取得了 一定的进展，从最初的异位移植发展到原位移植，由细胞移 植倾向于组织块移植，由试验性转移模型向自发性转移模型 发展。免疫缺陷动物的使用也由单一免疫缺陷动物发展为联 合免疫缺陷动物，模型的观察方法上由于诊断技术的发展也 变得丰富，静态、定性的观察方法正向动态和定量方法上发 展。同时，随着研究的深入，有关模型微转移观察的研究也 将成为以后的亮点。然而对于转移模型如何获得高转移率、 如何维持表达的稳定性仍将是肝癌及其它肿瘤转移动物模 型需要解决的问题。 参 考 文 献 [1] Tang ZY.Hepa toce l lu l a r ca rc inoma [ J ] . 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