维生素C葡萄糖苷的研究现状及发展前景

第6卷第4期 2008年7月 生 物 加 工 过 程 Chinese Journal of Bioprocess Engineering July 2008 · 1 · 维生素 C葡萄糖苷的研究现状及发展 王 冰 ，邱建华 ，张雪洪 ，杜 毅 ，许 平 前景 (1．上海交通大学 生命科学技术学院，上海 200240；2．上海爱普香料有限公司，上海 201809； 3．山东大学 生命科学学院，济南 250100) 摘 要：维生素 C葡萄糖苷是卫生署公布认可的美白添加剂之一，利用糖基转移酶的特异性转糖基作用进行生物 转化合成是目前维生素 c葡萄糖苷的唯一生产途径。对维生素c葡萄糖苷的生产方法进行了讨论，着重阐述了其 制备(生物转化合成法)、纯化及结晶三大生产的国内外研究现状，指出国内实现维生素 c葡萄糖苷工业化生 产的发展方 向。 关键词：维生素 c葡萄糖苷；AA一2G；生物转化 ；糖基转移酶 中图分类号：TS202．3 文献标志码：A 文章编号：1672—3678(2008)04—0001—06 Current research situation and development prospect of ascorbyl glucoside WANG Bing 一，QIU Jian—hua。，ZHANG Xue—hong ，DU Yi ，XU Ping (1．College of Life Science& Biotechnology，Shanghai Jiaotong University，Shanghai 200240，China； 2．Shanghai Apple Flavor& Fragrance Co．，Ltd．，Shanghm 201809，China； 3．College of Life Science，Shandong University，Jinan 250100，China) Abstract：Ascorbyl glucoside is one of ingredients of skin—whitening recognized by Department of Health． Biotransfonnation synthesis by specific glucosyl group transformation using saccharide—transferring enzyme is the unique production method for ascorbyl glucoside．The biosynthesis methods for ascorbyl glucoside were reviewed in detail．Especially，its current research situation of methods of separation，purification， and crystal were expounded．And the demestic production perspective on ascorbyl glucoside was prospec— ted as wel1． Key words：ascorbyl glucoside；AA一2G；biotransformation；saccharide—transferring enzyme 维生素 C(缩写为 VC)是人体必需的营养元素 之一，在临床上主要用来治疗坏血酸病，故化学名 称为抗坏血酸(ascorbic acid，AA)。此外，VC特有 的化学结构和生理活性使其可以作为酸味剂 、还原 剂、抗氧化剂、漂白剂和稳定剂广泛应用于化妆品、 食品和医药等领域 J。然而VC也存在着一系列固 有弊端：其在水溶液中极不稳定；易被空气中的氧 和其他氧化剂氧化；暴露于中性 pH、热、光和重金属 下会快速降解等 J，从而限制了它在某些领域中的 应用。因此，开发高附加值的 VC衍生物成为近年 来国内外学者研究的热点 J。 维生素 C葡萄糖苷 (ascorbyl glucoside)，学名 O一 一D 吡喃型葡萄糖基 抗坏血酸(2 O D gluco pyranosyl— —ascorbic acid，缩写为 AA一2G)，是 VC的 收稿 日期：2008-04—24 基金项目：中国博士后科学基金资助项 目(20070420659) 作者简介：王 冰(1979一)，女，山东济南人，博士，研究方向：生物工程。 联 系 人：许 平，教授，博士生导师，E-mail：pingxu@sdu．edu．cn。 维普资讯 http://www.cqvip.com · 2 · 生物加工过程 第6卷第 4期 一 种衍生物，其分子式为 C H 0 相对分子质量 为338．27，熔点为 158．5～159．5℃l4 。该化合物 于 1990年由日本林原生物化学研究所与日本冈山 大学药学系共同研究发现 J。AA一2G是 VC和吡 喃型葡萄糖苷通过糖基转移酶作用的缩合物，其中 VC分子上 2一位 C上的羟基被吡喃型葡萄糖苷所取 代，后者以 一1，4一糖苷键连接(图 1)。由于 2一位 C 上有葡萄糖基掩蔽，因此 AA一2G具有显著的非还原 活性 ]。AA一2G有两个同分异构体 5—0一OL—D一吡喃 型葡萄糖基一 一抗坏血酸(缩写为 AA一5G)和 6—0一OL— D一吡喃型葡萄糖基一 一抗坏血酸(缩写为AA-6G)，分 别是 5位和6位 C原子的羟基被葡萄糖苷所取代 (图1)，虽然它们相 比VC而言也具有较好的稳定 性 ，但是 AA一5G和AA一6G都具有直接还原活性 。 CH20H 0 HO 、 图 1 AA-2G及其结构异构体 AA一5G和 AA一6G Fig．1 AA-2G and its isomers AA一5G。AA一6G H AA一2G的结构特征决定了它具有如下几个主 要特点与功能：1)AA一2G具有非还原活性，不易发 生氧化反应 ，在水溶液中特别稳定 J。2)AA-2G具 有较好的耐光性和耐热性，其在 100℃，30 min的加 热条件下也不分解 。3)进入细胞的AA一2G，经 OL一 葡萄糖苷酶水解生成 VC和葡萄糖，且具有同原始 VC一样的还原性和抗氧化性。并且由于 AA一2G的 持续分解，可为体内不断的提供 VC，促进胶原蛋白 的形成，具有防止皮肤衰老的功能 。4)AA-2G是 卫生署公布认可的6种美白添加剂之一。它可以直 接排出表皮层中已经形成的黑色素(即将已形成的 黑色素加速逆向还原至最初形态)，美白效果比其 他添加剂更加明显和快速，因此在多种高端美 白化 妆品中都有着广泛的应用 。 目前，国际上应用于美白化妆品中的 AA一2G均 由日本林原国际有限公司一家提供，该公司对 AA一2G 的合成与生产技术不断进行研究开发，并申报了若干 相关专利加以商业保护 ，而关于该产品的文献 却鲜有报道。近些年，国外对于 AA一2G的研究主要 集中在化妆品中AA一2G与 VC及 VC衍生物的 HPLC 检测分析方法上 。国内对该产品的研究仅限于 2004～2006年浙江工业大学的赵丽华 -4’” 等对 AA一 2G生物合成法进行的初步探索。目前为止国内还没 有一个厂家能够达到该产品的工业化生产水平。 1 AA-2G合成的基本工艺流程 生物转化法是 目前 AA一2G合成的唯一途径，即 利用糖基转移酶(saccharide—transferring enzyme)的 特异性转糖基作用，将葡萄糖基供体(麦芽糖或其 他仪一葡聚糖)上的葡萄糖苷转移到 VC的2一位 C 上 。基本工艺流程如图 2所示。反应过程中， VC的2一位 C上可能会连接上长短不一的葡萄糖 基，产生混合物 AA一2G ( =1，2，3，4，5，6)，这些寡 聚糖基 VC衍生物可以通过添加葡糖淀粉酶减少糖 的聚合度，使 寡聚糖基 VC衍 生物转 变成 AA一 2G_1 J 。 另外在糖基转移反应中，易形成 AA一2G 的结构异构体 AA一5G，AA一6G等副产物；且 VC和葡 萄糖基供体在反应后会有所剩余，因此糖基转移反 应结束后，需对反应液进行分离纯化，最后通过结 晶的方法，得到高纯度的AA一2G产品 ” 。 图2 合成 AA-2G的工艺流程 Fig．2 Process flow diagram of AA一2G production 。 船 从 维普资讯 http://www.cqvip.com 2008年7月 王 冰等：维生素 C葡萄糖苷的研究现状及发展前景 ‘3 · 2 AA-2G的制备工艺 AA-2G的制备工艺条件直接影响了其葡萄糖 基的转化率，也就是直接影响到 AA-2G的收率。影 响转化率的制备工艺条件包括：糖基转移酶的种 类、酶的用量、VC的用量、葡萄糖基供体的选择、葡 萄糖基供体与受体之间的质量配比、pH、温度等。 转化反应过程中，VC的最佳质量浓度为0．2～ 3 g／L；葡萄糖基供体的质量浓度通常是 VC的0．5～ 30倍；从工业化经济角度考虑，糖基转移酶的添加 量通常是以3—80 h完成反应为佳；反应的最佳 pH 是 3～10；最佳温度是 30～70℃ ” 。转化过程 中，由于VC具有还原性，因此需要避光、避氧，可以 在反应液中添加硫脲或硫化氢 。 糖基转移酶的选择与使用是整个 AA-2G生产 中的重要环节。所使用的酶可以是纯酶，也可以是 粗酶或固定化酶。在工业化生产 中使用粗酶或固 定化酶更能节约资源、降低生产成本。目前为止， 已经研究开发了 5种酶类用于 AA一2G的生物转化 合成，包括 一葡萄糖苷酶(EC 3．2．1．20，OL—glucosi— dase) -6]、环麦芽糊精葡聚糖转移酶(EC 2．4．1． 19，cyclodextrin glucosyl transferase，CGTase)[18 3、 一淀粉酶(Ec 3．2．1．1， —amylase) ⋯、蔗糖磷酸酶 (EC 2．4．1．7，sucrose phosphorylase，SPase) 和 一异麦芽糖基葡糖基糖形成酶 ( —isomaltosyl glu— cosaccharide—forming enzyme，IMGase) 。目前工业 化生产中应用最广泛的是 CGTase。当使用不同的 糖基转移酶时，相对应的，所使用的 一葡萄糖基供 体也是不相 同的。如工业化生产 中使用 CGTase 时，葡萄糖基供体主要为环糊精、部分淀粉水解物 (胶凝淀粉)以及糊精(还原糖(以葡萄糖计)占糖浆 干物质的百分比(DE)=1～60) 。 2．1 一葡萄糖苷酶 1990年，人们首次发现利用小鼠肠内 一葡萄糖 苷酶、玉米种子内 一葡萄糖苷酶可以合成具有非还 原性的AA一2Gl5-6]。后来研究发现，该酶的来源比 较广泛，包括动物来源(鼠科动物的肾脏、小鼠的肠 黏膜以及狗和猪的小肠等)、植物来源(稻米种子和 玉米种子)和微生物来源(真菌 Mucor和Penicillium 属，酵母 Saccharomyces属等) 。使用该酶转化合 成 AA一2G时，只会形成 AA一2G产物，没有中间产物 AA一2G (n=2，3，4，5，6)或其他副产物出现。但该 酶不仅能够合成 AA-2G，也能够水解 AA-2G生成 VC和葡萄糖 ，因此 AA-2G的合成转化率较低，使得 该酶的工业化应用受到限制L22 J。 2．2 环麦芽糊精葡聚糖转移酶 该酶的来源主要是细菌——B0c 和 Klebsiel— fn属。1991年，日本研究者利用来 自嗜热脂肪芽孢 杆菌(Bacillus stearothermophilus)的 CGTase转化合 成并大规模生产 AA-2G[1 招 。该酶最大的优势 为其底物专一性特别强，因此一直是 AA一2G工业化 应用中的最佳酶源。目前商品化的 CGTase主要有 丹麦诺维信公司的Toruzyme 3．0 L和 日本天野制药 的 Cyclodextrin Glucanotransferase“Amano”两大产 品。使用 CGTase转化合成 AA一2G时，反应过程中 会生成中间产物AA一2G ，需要进一步利用葡糖淀粉 酶(glucoamylase)将其水解成 AA一2G终产物和葡萄 糖。2007年，韩国研究者 Prousoontorn等 利用固 定化的 CGTase制备 AA一2G，但 目前还没有达到工 业化生产的水平。 2．3 一淀粉酶 该酶的来源主要是细菌——B0c 属。使用 该酶转化合成 AA一2G时，反应过程中也会生成 AA一 2G 中间产物，但 n的数量比CGTase作为转化酶时 要相对少些，然而该酶的底物专一性却远远不及 CGTase[ 2．4 蔗糖磷酸酶 韩国研究者于 2007年利用一种新的微生物 酶——SPase转化生成 AA-2G_2 。该酶来源于一株 长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)，它在磷酸解作 用的同时发生糖基转移反应。虽然该研究尚未达 到工业化生产水平，但这却是首次从蔗糖开始转化 生产 AA-2G，为 AA-2G的合成提供了一个新的方法 和研究角度。 2．5 一异麦芽糖基葡糖基糖形成酶 2006年日本研究者在对 AA-2G生产工艺的改 善研究 中发现，IMGase可以明显生成大量的 AA一 2G 引 ，而这一发现其实在早些年就 已经有 了报 道 。该酶来源于球形节杆菌(Arthrobacter globi— formis)。使用这种酶生产 AA一2G，最大的优势为不 会产生 AA-2G的结构异构体 AA一5G和 AA一6G，或 者它们以非常少的量产生而不足以被检测到，由此 简化了后处理纯化工艺，提高了生产效率。实验中 还发现，在使用 IMGase的同时，如果配合使用 CG— Tase进行糖基转移反应，则 AA-2G的产量要比单独 维普资讯 http://www.cqvip.com · · 生物加工过程 第 6卷第4期 使用 IMGase时有很大提高。目前该酶已经由日本 研究者投入使用到AA-2G的工业化生产中 ，但 4 AA-2G的结晶工艺 尚未见该酶以商品化形式销售。 3 AA-2G的纯化工艺 生物转化反应结束后得到的溶液中，不仅含有 产物 AA-2G，还有灭活的生物酶、剩余的VC和葡萄 糖基供体、副产物 AA 5G和 AA一6G等。因此需要 对 AA 2G反应液做进一步的分离纯化。 1991年，日本研究者首先报道了AA一2G生产过 程中的纯化工艺流程。其中利用了强酸性阳离子 交换树脂通过柱层析的方法对反应液进行分离，得 到纯化的 AA-2G。所使用的强酸性阳离子交换树 脂主要是苯乙烯 二乙烯基苯共聚物为基体的磺酸 基阳离子交换树脂，如：H 型、Na 型、K 型、Ca 型、Mg 型等 m 。 后经研究发现，在使用强酸性阳离子交换树脂 纯化 AA 2G时，虽然 VC和葡萄糖较易与 AA一2G分 离开，但仍有少量副产物不易去除，这不仅阻碍到 AA 2G的纯度增加，还影响到后续 AA一2G的结晶收 率，这少量的副产物正是 AA 2G的结构异构体 AA一 5G和AA-6G。由于AA 5G和AA一6G都具有直接还 原活性，因此人们在利用强酸性阳离子交换树脂纯 化 AA 2G之前，通过一步“氧化处理”步骤首先将它 们除去，这样可以得到收率为 70％ ～80％以上的 AA 2G液体产物。“氧化处理”的手段可以是简单 的搅拌通风；或使用铜盐、铁盐、亚铁盐、活性炭等 加速氧化过程；甚至可以使用过氧化氢或高锰酸钾 等氧化剂 。 2001年，人们研究使用阴离子交换树脂吸附 AA 2G和 VC，随后用浓度小于 0．5 molZL(0．1～ 0．45 molZL左右)的酸(如 HC1、H SO 、HNO 、柠檬 酸等)或盐的水溶液(如 NaC1、KC1、Na SO 、K SO 、 NaNO 、KNO 、柠檬酸钠、柠檬酸钾等)洗脱分离得 到AA一2G。这不仅简化了工艺流程，并且可以得到 收率为 80％ ～90％的 AA 2G液体产物。工业上常 用的阴离子交换树脂包括美国 Rohm&Haas公司 的 “AMBERLITE IRA411S”， “AMBERLITE IRA478RF”，“AMBERLITE IRA910CT”以及 日本 Mitsubishi Chemical Indiustries公 司 的 “DIAION WA30”，这几种树脂对 AA-2G均有较高的吸附分离 能力 “]。 通过结晶工艺所获得的 AA-2G最终晶体产品 为无水结晶粉末，具有易流动、不吸湿、不潮解、不 硬化、易溶于水等优点，从而在包装、运输和储存等 方面具有很大的优势。1992年 日本研究者首次完 成了 AA一2G的结晶工艺 J：在过饱和 AA一2G溶液 中接入纯的质量分数为0．1％ ～10％的AA-2G晶体 作为晶种，在20～60~C的温度下缓慢搅拌，冷却促 进结晶，形成糖膏(masseeuite)。随后通过离心分离 法(centrifugal separation)、结块粉碎法(block—pulver- ization)、流化床造粒法(fluidized—bed granulation)、 喷雾干燥法(spray—drying)等方法获得最终 AA一2G 晶体产物 。离心分离是传统的分离方法，离心之 后分为上层的母液(糖渣)和下层的晶体。下层晶 体中AA-2G收率非常高，可达到 99．9％；上层母液 可以重复利用，进行二次结晶或三次结晶。其他三 种获得晶体的方法，不能够去除其 中的糖渣部分， 因此得到的产品收率较低，但产量相对较高 ⋯。 5 发展前景 AA 2G是迄今人们发现的最稳定、性能最佳的 VC替代品，近些年主要作为一种美白添加剂应用 于多种品牌的高端化妆品中 。AA一2G的工业化 生产主要包括制备、纯化、结晶三大工艺，生物转化 法是 目前 AA一2G制备的唯一途径 引。日本研究者 长期以来致力于该产品的研究开发，日本林原国际 有限公司所生产的 AA一2G产品不仅纯度可达 99％ 以上，且产量相当可观，全世界应用于化妆品中的 AA一2G均由该公司一家提供，其在市场上 占有垄断 的地位。目前该公司对 AA一2G的研究仍在不断深 入，随着其生产各工艺的优化改善，该产品的成本 不断降低，销售价格(人民币)也由8 000 kg降 至约 3 000 kg。我国对于 AA一2G的研究也有报 道 ，但仅属于初步的研究探索，尚未达到工业 化水平。 目前，国内AA-2G的应用厂商都希望能够得到 国产的AA一2G产品，笔者所在的研究小组也对 AA 2G的工业化生产有着浓厚的兴趣。初期研究结果 表明，要想实现 AA-2G的工业化生产，最大的障碍 不是工艺技术问题，而是成本问题。前面提到糖基 维普资讯 http://www.cqvip.com 2008年7月 王 冰等：维生素 c葡萄糖苷的研究现状及发展前景 转移酶是 AA-2G生产中的关键影响因素，它的选择 与使用在转化反应过程 中直接影响到葡萄糖基供 体的转化率，即 AA-2G的产物收率；此外，如果糖基 转移酶使用不得当，反应中会产生较多的中问产物 或副产物，从而影响到后面的分离纯化乃至结晶的 收率。对于糖基转移酶，我们希望其具有来源简单 易得、底物专一性强、副产物少、单位酶活高等多方 面优势。目前在 AA-2G生产中应用最广泛的糖基 转移酶是 CGTase，该酶具有底物专一性强、产物生 成率高等优 良特性，但商品化的 CGTase有一个最 大的缺陷，就是单位酶活较低，如 日本天野制药提 供的CGTase单位酶活仅为600 U／mL，因此转化反 应中不得不大大提高其添加量，这使得AA一2G的生 产成本大幅度增高。日本林原国际有限公司在该 产品相关专利 中提到所使用的 CGTase主要是 由 Bacillus spp．或Klebsiella spp．菌株制备的粗酶液，但 具体内容作为商业秘密进行 了保护，我们无从查 询。另一个严重消耗生产成本的原料是葡萄糖基 的受体 VC，实验表明 VC在反应过程 中大大过量 时，才能够得到高产率的AA-2G，这使得 VC的成本 消耗也占据了总成本中相当大的一部分比例。 由此在今后的研究中，我们认为针对 VC成本 过高的问题，可以在分离纯化步骤将剩余的VC回 收利用，以降低成本，这在 日本专利中也有相关提 示。针对 CGTase成本过高的问题 ，一方面可以寻 找 CGTase的广泛微生物来源(如最常用的菌株 Ba— cillus stearothermophilus等)，通过筛选、驯化、诱变等 手段获得产量高、单位酶活高、纯度高、转化率高的 CGTase，这方面国内已有相关文献报道可以供参 考 ；另一方面，也可以采用固定化酶的技术将 CGTase固定化 ，改善酶的稳定性、增加酶的循环 使用次数，从而达到降低成本的目的。 参考文献： [1] 李战友．维生素 c深层次应用与开发 [J]．河南科技 ，1999 (11)：9-10． Li Zhanyou．Deep application and development of vitamin C[J]． Henan Sci and Tech，1999(11)：9-10． [2] 赵丽华，裘娟萍，黄敏，等．抗坏血酸糖类衍生物的研究进展 [J]．饲料工业 ，2004，25(2)：28-30． Zhao Lihua，Qiu Juanping，Huang 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。。ll¨ ’¨l ¨ 。 ⋯¨ ‘。⋯⋯ l|¨⋯ “ ⋯⋯- ’ll¨II 全球生物塑料应用市场潜力巨大 2008年上半年，在美国召开的塑料工程师学会年会指出，全球生物塑料生产将从 2007年的26．24万 t 提高到 2011年的99．88万 t，显示出可再生资源生产聚合物的技术进步，推动了全球生物塑料生产持续升 温。全球消费的生物塑料仍仅占全部2．31亿t塑料的0．7％，应用市场空间与潜力较大。 走传统石油化工路线的塑料每年消耗约25亿桶石油，而当前石油原料正面临短缺，且接替的新增储量 仅为石油消费量的1／4，在此背景下生物塑料的魅力正在日益提升。 日本政府近期已确定目标，到2020年将使日本消费的所有塑料的20％来自可再生资源；德国已禁止将 含有质量分数大于5％有机物固体废弃物掩埋地下，这将对德国2012年生物塑料的推行产生很大影响；按 照2002年实施的农场安全和农业投资法，美国要求每一个联邦机构都必须制定使用生物基塑料的。 据分析预测，到2011年全球汽车和电子领域应用的生物塑料的比例将从现在的12％上升至近40％。 (朱宏阳) 维普资讯 http://www.cqvip.com