羧肽酶B研究进展

药 　物 　生 　物 　技 　术 Pharmaceutical Biotechnology 　2006 ,13 (4) :302～305 ·综　　述· 羧肽酶 B研究进展 3 李素霞 ,张晓彦 ,张映新 ,杨 　梓 ,袁勤生 (华东理工大学生物反应器国家重点实验室 ,上海 200237) 摘 　要 　羧肽酶 B 是重组胰岛素生产中的一个必需工具酶 ,同时在蛋白质测序等领域中也得到广泛应用。 文章综述了羧肽酶 B 的结构、测活方法、性质、稳定性及储存条件、提取方法、基因工程方法生产羧肽酶 B 的研究 及重组羧肽酶 B 的性质等。 关键词 　羧肽酶 B ;重组羧肽酶 B ;性质 中图分类号 :Q55 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :100528915 (2006) 0420302204 　　羧肽酶B (Carboxypeptidase B , CPB) ( EC3. 4. 17. 2)是 一种外分泌蛋白酶 ,属于金属羧肽酶 A 和羧肽酶 B (CPA/ CPB)家族 ,每分子含有一个 Zn 原子 ,可选择性水解蛋白或 多肽羧基端的精氨酸和赖氨酸。酶在最初以无活性的酶原 形式产生 [1 ,2 ] ,去除前肽片段才能激活酶。胰脏中羧肽酶 A 和羧肽酶 B 的最基本功能是在肠道内分解肽段 ,肽段由胰 蛋白酶降解蛋白质产生 ,羧肽酶 A 对于芳香族或脂肪类氨 基酸残基有最佳的切割能力 ,羧肽酶 B 优先切割碱性氨基 酸 ,但同时 CPB 也能切割一些非碱性的氨基酸残基 [3 ] 。羧 肽酶 B 在科研中的应用主要基于其切割特性。它可以用于 蛋白质和肽的测序 ,在医学上用于诊断胰腺炎。另外 ,在重 组胰岛素的生产中 ,活性胰岛素的产生也要依赖于羧肽酶 B 的切割。 1 　羧肽酶 B的结构 羧肽酶B (CPB)在胰腺中以无活性的酶原形式合成 ,羧 肽酶原 B 的分子质量为 46 ku ,由 401 个氨基酸组成 ; CPB 分子质量为 35 ku ,由 306 个氨基酸组成。胰腺羧肽酶原 B 有两个结构域 :催化结构域和激活部分。激活部分保护着 活性部位。位于活性中心的 Arg2145 和激活部分的 Asp241 之间形成盐桥 ,以防底物的 C 端羧基基团结合到 Arg2145 上 [4 ] 。酶原的 Asp241 突变为 Asn 或 Ala ,可使酶原具有低 的内在酶活性 ,说明少量底物结合到底物结合部位 ,因此 , Asp241 和 Asp2145 之间的盐键形成有助于保持酶原的无 活性状态 [4 ] 。 胰腺 CPB 由胰蛋白酶酶切酶原的 Arg295 位点激活 , 导致活性肽释放 ,底物结合位点暴露。C 末端的 Arg 被活 性 CPB 酶解除去。与 CPB 活性部位的锌原子起协调作用 的是 His269 , Glu272 和 His2196 ;其他参与催化反应的重要 氨基酸残基有 Arg2127 和 Glu2270 ; Arg2145 对于底物结合 非常重要 ,同时 ,Asn2144 和 Tyr2248 对其底物结合起辅助 作用 ;而 Asp2255 很可能决定对碱性氨基酸的专一性 ,因 为 ,对于 CPA 来说 ,该位点是异亮氨酸或亮氨酸 [5 ] 。 2 　羧肽酶 B的活性测定 2. 1 　测活方法 [6 ] 该方法基于 CPB 可以水解马脲酰2L2精氨酸生成马尿 酸 ,而马尿酸 ( hippuric acid) 和马脲酰2L2精氨酸 ( hippuryl2 L2arginine)具有不同的吸收光谱。通常的分析方法如下 : 试验当天新鲜配制的 0. 001 mol/ L 马脲酰 L2精氨酸的盐溶 液 ,总测定体系 3 ml ,254 nm 处调零。加入的酶溶液的体 积5～20μl ,立即调节灵敏旋钮置光吸收为零 ,然后根据所 需的时间频繁记录增加的吸收值。0. 001 mol/ L的马尿酸 缓冲盐溶液作为常规的对照。 整个分析在室温进行 (25 ℃) 。最高达 40 %的水解反 应符合零级反应动力学 ,因此 ,酶的浓度调整到 10 min 内 水解反应不超过 30 %。100 %水解的光吸收值为 0. 36 ,在 测定范围内 ,数据显示底物的水解速率与酶浓度呈明显的 正比关系。 蛋白浓度和含量可通过测定获得 ,活力单位定义为在 0. 001 mol/ L 的底物浓度下每分钟的底物水解百分数。比 活定义为 unit/ mg ·protein。 2. 2 　影响酶活力测定的因素 [7 ] 2. 2. 1 　p H 对 酶 活 力 测 定 的 影 响 　底 物 浓 度 为 203 3 收稿日期 :2005211230 　　修回日期 :2006204202 基金资助 :上海市生物化学重点学科资助。 作者简介 :李素霞 ,华东理工大学生物工程学院 ,副教授 ,研究方向蛋白质与多肽。Tel :021264252255 王 下划线 王 下划线 王 下划线 1 ×1024 mol/ L时 ,p H7. 9～8. 0 可得最佳反应速率 ;另有报 道认为 ,p H7. 65 , K0 达峰值 ,p H8. 0 时 ,k0 为峰值的 95 %。 2. 2. 2 　测活底物对活力测定的影响 　L2精氨酸和 L2赖氨 酸可以不同程度地抑制酶的活力 , L2精氨酸发挥作用的浓 度值更低 ,这是因为 , L2精氨酸和 L2赖氨酸是 CPB 水解底 物马脲酰2L2精氨酸和马脲酰2L2赖氨酸的产物 ,它们可以与 底物竞争结合酶的活性中心 ,因而抑制了酶的活力。 2. 2. 3 　测活温度的影响 　温度每升高 10 ℃, k0 升高 1. 5 倍 ,但温度对 Km 的影响非常小。 3 　羧肽酶 B的性质 3. 1 　对 p H 的稳定性 对于不同来源的羧肽酶 B 活性研究明 [8 ] ,CPB 的活 力在 p H8 左右时为最大值 ,偏酸性和偏碱性的条件都会使 酶活造成不同程度的损失。当 p H ≥12 时 ,活力完全丧失。 另外 ,重组 CPB 在 p H5 时 ,活力接近零 ,表明重组 CPB 的 等电点就在 p H5 左右。 3. 2 　热稳定性 在一定的温度范围 ( < 60 ℃) 内 ,CPB 的活力随着温度 的升高而上升 ,随后下降。温度对活力的增效作用在所有 来源的 CPB 中是一个普遍现象。比较来源于猪、海星等的 CPB 来说 ,重组 CPB 的热稳定性要差一些 [9 ] 。 3. 3 　羧肽酶 B 在储存过程中的稳定性 CPB 的稳定性考察表明 ,温度和盐浓度是影响 CPB 活 力的重要因素。在 0 mol/ L NaCl 和0. 05 mol/ L NaCl 溶液 中存放的 CPB ,活力测定时吸收值的变化无规律可循 ,说明 CPB 在此环境下不稳定。在 0. 2～0. 3 mol/ L NaCl 溶液中 存放 3 个月后 ,CPB 活力均呈现不同程度的下降 ,其盐浓度 越高 ,活力下降越快。而在 0. 1 mol/ L NaCl 溶液中存放 36 个月时才可见少许蛋白质降解。因此 ,在 0. 1 mol/ L NaCl 溶液中 ,220 ℃冻存 CPB 是液态保存 CPB 的最适条件。实 际操作中 ,应分批按用量分装 ,以保证融化后一次性使用。 65 %饱和度 (N H4 ) 2 SO4 盐析态保存的 CPB 只适合 1～2 个 月内短期存放 [10 ] 。 3. 4 　金属离子对羧肽酶 B 活性的影响 3. 4. 1 　作为酶的激活剂 　Mn2 + , Zn2 + , Mg2 + ,Ca2 + 都能 够不同程度的提高酶的活力 ,几乎所有来源的 CPB 在和 Co2 + 孵育一段时间之后 ,活力都大大提高 [11 ,12 ] 。 3. 4. 2 　作为酶的抑制剂 　Cu2 + 可以部分抑制重组 CPB 的 活力 ,而在 Hg2 + 的存在下 ,重组 CPB 的活力几乎全部 丧失。 3. 5 　其他影响酶活性的因素 重组 CPB 的活力可以被 10 mmol/ L 的 ED TA 强烈地 抑制 ,这说明 CPB 活性中心的 Zn2 + 对活力的发挥至关重 要。但海星 CPB 在 1 mmol/ L ED TA 存在下 ,0 ℃孵育 1 h , 活性保持 100 %。另外 ,重组 CPB 对于 PMSF ,一种丝氨酸 类蛋白酶的抑制剂并不敏感 ,这两点说明重组 CPB 是一种 金属酶 ,而不是丝氨酸羧肽酶 [11 ,12 ] 。 一些无机盐在 p H8. 0 时对羧肽酶 B 显示抑制作用 ,抑 制作用顺序为 NaI , KSCN , NaBr , MgSO4 , NaCl , KCl ,和 NaNO3 ,其中 ,NaCl , KCl 和 Na2 SO4 在 p H7. 2 和 p H8. 0 时 的抑制作用相同。0. 9 mol/ L NaCl (1 ×1024 mol/ L 马尿酰2 L2精氨酸)可降低降解速率 50 %。盐浓度从 0. 001 25 mol/ L Tris2HCl 到 4 mol/ L NaCl (0. 025 mol/ L Tris2HCl) 未观 察到任何酶活性升高的现象。 4 　羧肽酶 B的分离纯化 Folk 等 [6 ]早在 1960 年已从猪和牛的胰腺分离和鉴定 了 CPB。至今 ,已得到分离纯化和鉴定的 CPB 有来源于人 胰腺、骆驼、鸵鸟、非洲肺鱼、鲤鱼、、鲶鱼、白虾、小龙虾、海 星等。下面以从猪胰腺中提取分离 CPB 为例来说明 CPB 一般的提纯方法。 4. 1 　从猪胰腺中提取纯化羧肽酶 B 的方法 [6 ] 从猪胰腺猪提取纯化羧肽酶 B 仍是目前商业用羧肽酶 B 的主要来源。其主要的提取方法流程如下 : 室温下自然水解 16 h 制备丙酮粉 双蒸水提取 液 (粗酶液) 硫酸铵分级沉淀 透析 DEA E 纤维 柱层析 洗脱液 (粗酶液) 疏水柱层析 洗脱液 透析或者上 Sephadex 脱盐柱 ,脱盐得 CPB 成品。 后来 ,经改进后简化了繁琐的工艺流程 [13 ] ,将制备丙 酮粉一步省略 ,新鲜猪胰腺经自然水解激活后 ,硫酸铵分级 沉淀 ,上疏水柱层析分离 ,再上 DEA E 柱纯化 ,即可得较纯 的 CPB 成品。不同来源的 CPB 提取一般也参照以上方法。 4. 2 　重组羧肽酶 B 的纯化 研究了大肠杆菌表达重组羧肽酶 B 的复性及其纯化 , 首先用凝胶过滤法复性和纯化了羧肽酶原 B ,羧肽酶原 B 经胰蛋白酶酶切激活后 ,经 DEA E 离子交换层析一步纯 化 ,得到了活性羧肽酶 B ,电泳鉴定纯度达 90 %以上 [16 ] 。 更进一步的纯化可利用 Octyl2FF 疏水柱进行 [14 ,15 ] 。 5 　重组 CPB的研究 目前商业上使用的羧肽酶 B 均为从猪的胰腺纯化得到 的 ,不仅价格昂贵 ,而且并不完全排除其他蛋白酶。因此 , 我们实验室开展了重组 CPB 的研究。 L I等从大鼠的新鲜胰腺中克隆得到了羧肽酶原 B ( PCPB)的基因 ,测序表明编码大鼠 pCPB 的基因有 1 209 bp ,Blast 的结果显示 ,与 Genebank 上收录的大鼠 pCPB 基 因相比有 5 个核苷酸不同 ,导致 2 个氨基酸的差异 ,其中 11 位的 Lys 变为 Asn ,139 位的 Arg 变为 Glu。后续的表达及 活力测定表明 ,这种差异不会导致活力的降低。所克隆的 基因装载到表达载体 PET224a 后 ,在大肠杆菌宿主 BL21 (DE3)中获得了高效表达 [14 ] 。 303李素霞等 :羧肽酶 B 研究进展 5. 1 　重组 PCPB 包涵体的变性、复性研究 采用多种条件 ,包括变性剂、去污剂、极端酸碱、高温等 条件对重组 PCPB 以及 62His tag PCPB 的包涵体进行了溶 解研究 [15 ,16 ] 。以 8 mol/ L 脲为对照 ,选择 6 mol/ L 的脲、6 mol/ L ,4 mol/ L 的盐酸胍、极端酸碱条件、高温以及去污剂 SDS对 PCPB 包涵体进行溶解。结果 8 mol/ L 的脲 ,6 mol/ L 的盐酸胍、p H12. 5 (分别加 1 mol/ L 和 2 mol/ L 尿素) 的 溶解条件得到了较高的溶出率 ,其中以 p H12. 5 ,2 mol/ L 的脲溶解效果最好 ,比传统使用的 8 mol/ L 的脲要高出 20 %左右。由碱性 p H 值提供的电荷分布是 PCPB 包涵体 解聚的主要原因。但过高的碱性条件造成活力回收率低。 采用 8 mol/ L 尿素和弱碱性条件均能很好地溶解 His2tag PCPB 包涵体 ,实验表明 ,弱碱性条件的溶解率及活性蛋白 的收率略高于 8 mol/ L 尿素。 用逐步优化法分别考察了蛋白质浓度、p H 以及温度对 PCPB 复性的影响 ,确定了最佳 p H 与温度。并在此基础上 实验了氧化还原对 GSSG和 GSH 的比值、以及尿素、小分 子添加剂对 PCPB 复性的影响。综合以上因素得到用稀释 法复性 PCPB 的最佳缓冲液组成。即 : 20 mmol/ L Tris2 HCl p H9. 5 , 0. 1 mmol/ L ZnCl2 , PCPB 浓度 :150μg/ ml ,1 mmol/ L GSH ,0. 5 mol/ L 尿素 ,在 25 ℃中复性 32 h。优化 后复性液中比活比最初提高了约 3 倍。在稀释复性的基础 上考察了逐步滴加法对 PCPB 复性的促进作用 ,并考察了 脉冲复性中的加样间隔周期对复性率的影响。发现加样周 期在 1 h 时 ,复性率提高较为明显 [15 ] 。 5. 2 　PCPB 在毕赤酵母中的表达 研究利用毕赤酵母表达系统表达大鼠 PCPB ,同时探讨 最优表达条件 ,实现了 PCPB 在毕赤酵母中的成功表达 ,通 过表达条件的优化 ,使用 BM GY培养基 ,添加酪蛋白水解 物和 3 mmol/ L 的 PMSF ,于 28 ℃培养 ,每隔 12 h 补加 0. 5 %的甲醇 ,重组酵母 GS1152PCPB 表达的重组蛋白可达 500 mg/ L ,表达的目的蛋白占总蛋白的 94 % ,活化后的 CPB 的比活力达 110 U/ mg[17 ] 。 5. 3 　重组 CPB 的性质及同天然来源 CPB 的性质 比较 [8 ,9 ,11 ,12 ,15 ] 张晓彦等 [15 ]研究了重组 CPB 的性质。重组 CPB 发挥 活力的最佳 p H 值为 7～9 ,商业上所用猪胰 CPB 的活力在 p H8 的条件下最大 ,p H7 和 9 时 ,活力分别下降 35 %和 24 %。使用不同的底物对海星 CPB 的 p H 研究发现 ,其活 力最佳的 p H 在 7～8 之间 ,和猪 CPB 相似 ,p H9 时 ,活力也 有较大程度的下降。 重组 CPB 在 40 ℃孵育后能提高酶活 ,温度对于活力的 增效作用在其他来源的 CPB 中也存在 ,如海星、catfish 及 dogfish 等。但温度过高至 55 ℃时 ,孵育半小时 ,酶活全部 丧失。重组 CPB 对于最高温度的耐受性比天然来源的 CPB 要差一些。来源于 dogfish 的 CPB ,在 50 ℃孵育 25 min 时 ,活力提高至原来的 180 % ,随着孵育时间延长 ,这种 温度增效作用逐渐减弱 ,2 小时后活力恢复至原有水平。 60 ℃孵育 50 min 后 ,活力仍保留 40 %。 重组 CPB 的活力被典型的金属螯合剂如 ED TA ,及 Hg2 + 所抑制。Mn2 + ,Zn2 + , Mg2 + ,Ca2 + 都能够不同程度的 提高酶活 ,其中 Zn2 + 对酶活的增强作用在 dogfish 来源的 CPB 中也有报道 ,不过增强效果不太明显。而 Mg2 + ,Ca2 + 这两种金属离子对于其他来源的 CPB 则有抑制作用。 Co2 + 被证明是酶的一种激活剂 ,几乎所以来源的 CPB 在和 Co2 + 孵育一段时间之后 ,活力都大大提高。Co2 + 对不同来 源的 CPB 活力增强效果是不同的 ,其中 ,重组 CPB 及 dog2 fish 来源的 CPB 在 Co2 + 作用下 ,活力可以提高将近 3 倍。 另外 ,研究了当底物为马脲酰2L2精氨酸和马脲酰2L2赖 氨酸时重组 CPB 的 Km ,当反应体系的温度为 25 ℃,p H8. 0 时 , Km 值分别为 0. 37 和 4. 25 ,而猪 CPB 的 Km 为 3. 55 和 0. 39 , 海星的为 2. 63 和 0. 54。因此 ,相比较而言 ,马脲酰 L2精氨酸是 CPB 的最适底物。研究了重组 CPB 在保存中 的稳定性 ,结果发现在 20 mmol/ L Tris ,p H8. 0 ,0. 1 mol/ L NaCl 的溶液中220 ℃冷冻是最佳的保存方式。1 mg/ ml 的 CPB 保存 6 周后 ,仅有 25 %的酶活损失。双向电泳显示重 组 CPB 的等电点为 5. 35 ;紫外扫描分析显示其最大吸收值 为 277 nm。通过对重组和天然来源的 CPB 进行的性质比 较 ,可以发现 ,不同来源的 CPB 其性质是相似的。 CPB 作为一个工具酶 ,在蛋白质序列测定、胰岛素生 产 [18 ] 、降钙素生产等方面得到广泛的应用。进一步的研究 希望能降低成本 ,提高活性 CPB 的回收率 ,从而实现重组 CPB 的大规模生产。 参考文献 [ 1 ] Aviles FX and Vendrell J , Carboxypeptidase B. 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Key words Carboxypeptidase B , Recombinant Carboxypeptidase B , characteristic ·信　　息· 2006 103 　基质金属蛋白酶 2 的小肽抑制剂 治疗肿瘤生成疾病 2006 104 　癌胚抗原特异性结合肽及其与 TNF α的融合蛋白 2006 105 　具有止血活性的尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶 2006 106 　一种大肠杆菌通用的高效可溶表达载体系统 2006 107 　用于治疗和预防阿尔茨海默病的重组腺相关病毒基因疫苗及其用途 2006 108 　无细胞百日咳抗原蛋白的分离纯化方法 2006 109 　一种 NF kB抑制物及其制备方法、以及作为抗肿瘤药物的应用 2006 110 　山麦冬多糖的提取工艺 503李素霞等 :羧肽酶 B 研究进展